納米氧化鋅對玉米種子萌發(fā)及根系碳代謝的影響

孫露瑩，宋鳳斌，李向楠，朱先燦，劉勝群，王 洋，齊曉寧

(1．中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，吉林 長春 130102;2．中國科學院大學，北京 100049)

0 引 言

納米氧化鋅(ZnO nanoparticles，ZnO NPs)作為一種納米金屬氧化物，因其具有獨特的物理性質(zhì)和較大的比表面積，越來越多的應用在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等多領(lǐng)域的研究[1-2]。納米材料的廣泛應用增加了其釋放到環(huán)境中的可能性，不可避免地通過影響植物不同階段的生長發(fā)育，進而影響整個農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)[3-4]。

種子萌發(fā)是植物生長周期的第一階段，也是對非生物環(huán)境因子最敏感的時期之一。而納米材料對植物種子萌發(fā)作用是積極的還是消極的，仍然沒有統(tǒng)一的認識。有研究認為，小尺寸的納米材料易于滲透和調(diào)節(jié)水通道，促進種子萌發(fā)；大的比表面積有助于吸附和輸送更多的物質(zhì)[5]。Lahiani等[6]的研究也證明了這一點，多壁碳納米管(MWCNTs)通過調(diào)控編碼玉米種皮上的幾種水通道蛋白的基因表達，加強了種子對水分的吸收，刺激了種子發(fā)芽。鋅作為植物生長所必須的營養(yǎng)元素，其氧化物的納米顆粒對植物的影響更復雜。關(guān)于納米氧化鋅對白菜、番茄及黃瓜等種子萌發(fā)的促進作用已有較好的研究[7-8]。Mahajan等[9]研究發(fā)現(xiàn)，20 mg·L-1的ZnO NPs有利于綠豆種子的萌發(fā)，1 mg·L-1ZnO NPs可促進鷹嘴豆種子的萌發(fā)，高于該濃度時會抑制其萌發(fā)和生長。種子萌發(fā)過程中在其內(nèi)部進行著復雜的生理生化變化，需要啟動多條代謝途徑，為種子萌發(fā)過程提供物質(zhì)和能量，其萌發(fā)成功與否還取決于淀粉酶、蛋白酶等對貯藏物質(zhì)的分解和利用。Laware和Raskar[10]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的納米TiO2提高了蛋白酶和淀粉酶活性，促進種子萌發(fā)和幼苗生長。萌發(fā)后期，植物對水分和養(yǎng)分的吸收取決于根系的生長狀況及根系形態(tài)。同時，植物根系構(gòu)型易受外界環(huán)境及水肥條件等的影響。納米材料對根系形態(tài)的研究也報道不一。有研究表明，低濃度(50～100 μg·mL-1)的碳納米管促進了水稻根系的伸長，利于植株對養(yǎng)分的吸收，而高濃度(150 μg·mL-1)的碳納米管則抑制了根系的活力和生長[11]。

然而，目前關(guān)于納米氧化鋅對玉米種子萌發(fā)和幼苗根系形態(tài)的影響研究較少，尤其是有關(guān)納米氧化鋅調(diào)控玉米幼苗根系碳代謝的了解甚少。本文通過設置不同濃度的納米氧化鋅，探究其對玉米種子的萌發(fā)及其萌發(fā)后期根系糖代謝調(diào)控的影響，從而篩選出促進種子萌發(fā)及幼苗建成最適的納米氧化鋅濃度。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.2 試驗方法

種子表面消毒：選取大小一致、籽粒飽滿的玉米種子，用1%的次氯酸鈉溶液消毒30 min，再用超純水沖洗5次，然后，用濾紙將水吸干。

浸種：將已消毒的100粒種子置于盛有處理液的三角瓶中，用封口膜封住瓶口，于28 ℃，200 r·min-1震蕩12 h。

種子萌發(fā)試驗：將浸種處理的30粒種子平鋪于放有雙層中速定性濾紙的培養(yǎng)皿上，放入22 ℃黑暗培養(yǎng)箱中發(fā)芽7 d，定期補充水分以確保濾紙濕潤，每個處理3次重復。以胚根至少達種子長度1/2作為發(fā)芽標準，每24 h記錄種子發(fā)芽情況。對種子萌發(fā)7 d的胚根、胚芽長度、鮮重和不定根數(shù)等生長數(shù)據(jù)進行定量分析[12]。計算各發(fā)芽指標。公式如下：

Vi=S×Gi

糖代謝關(guān)鍵酶活性的測定：0.5 g玉米根鮮樣加少量PVPP于液氮中研磨，加入1 mL浸提緩沖液(200 mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸/氫氧化鈉(HEPES/NaOH)，pH 7.5；3 mM氯化鎂(MgCl2)；1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)；2%丙三醇；0.1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)；1 mM苯甲脒)。將勻漿置于冰上完全解凍后，4 ℃下20 000 g離心30 min，取上清液在4 ℃下20 000 g離心45 min，此上清液一部分用于測定醛縮酶(Aldolase)、磷酸果糖激酶(PFK)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)、磷酸葡糖異構(gòu)酶(PGI)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)；另一部分冰上透析過夜，用于測定己糖激酶(HXK)；詳細方法參考Jammer等[13]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2016整理數(shù)據(jù)，SPSS 22統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；所有數(shù)據(jù)先進行方差齊性檢驗，然后進行單因素方差分析(One-way ANOVA)(P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著)；使用Origin9.6軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度ZnO NPs浸種前后處理液Zn2+濃度變化

浸種前，納米氧化鋅懸浮液隨著濃度的增加逐漸呈白色，其Zn2+含量隨著納米氧化鋅濃度升高呈先上升后下降的趨勢，200 mg·L-1的納米氧化鋅懸浮液中Zn2+含量最高，高于此濃度的納米氧化鋅懸浮液中Zn2+含量趨于穩(wěn)定(圖1、2)。此外，對照組的Zn2+20 mg·L-1的水溶液中Zn2+含量最高，這表明納米氧化鋅的懸浮液中部分納米氧化鋅溶于水，以離子形態(tài)存在；當納米氧化鋅濃度高于500 mg·L-1時，絕大部分的納米氧化鋅顆粒形成了團聚體[14]。浸種后，處理液顏色都變淺，低于100 mg·L-1的納米氧化鋅懸浮液的Zn2+含量均低于浸種前；相反的是，高于100 mg·L-1的納米氧化鋅懸浮液的Zn2+含量卻高于浸種前。Zn2+含量的降低表明，在浸種的過程中，種子吸水膨脹，有助于溶液中的Zn2+被種子吸收。而高濃度的納米氧化鋅懸浮液中的Zn2+含量卻在浸種后增加，這可能與植物的存在有利于納米氧化鋅懸浮液中可溶性鋅的含量增加有關(guān)[1]。

2.2 不同濃度ZnO NPs對玉米種子萌發(fā)的影響

低濃度(10 mg·L-1、20 mg·L-1和50 mg·L-1)ZnO NPs處理下，種子發(fā)芽率隨著ZnO NPs濃度升高而升高；而高于50 mg·L-1的試驗組隨著ZnO NPs濃度升高而降低(圖3)。試驗組20～500 mg·L-1ZnO NPs處理的種子發(fā)芽率都高于無添加納米氧化鋅和20 mg·L-1Zn2+的對照組。特別是50 mg·L-1ZnO NPs的試驗組的發(fā)芽率比無添加納米氧化鋅和20 mg·L-1Zn2+的對照組高11.3%和18.7%；同時也顯著高于10 mg·L-1和1 000 mg·L-1的試驗組(P<0.05)。1 000 mg·L-1ZnO NPs處理抑制了種子的萌發(fā)。

低濃度(10 mg·L-1、20 mg·L-1和50 mg·L-1)ZnO NPs處理下，種子發(fā)芽勢隨著ZnO NPs濃度升高而升高；而50～500 mg·L-1的試驗組隨著ZnO NPs濃度升高而降低(圖4)。20～50 mg·L-1濃度范圍的種子發(fā)芽勢較高，其中50 mg·L-1ZnO NPs試驗組的發(fā)芽勢分別比無添加納米氧化鋅和20 mg·L-1Zn2+的對照組高34.5%和56.0%，同時也顯著高于10 mg·L-1，500 mg·L-1和1 000 mg·L-1(P<0.05)。

注：*及不同字母表示處理間差異顯著(P< 0.05)。下同。

Note: * and different letters mean significant differences between treatments at 0.05 level.The same is as below.

圖3 不同濃度ZnO NPs處理下玉米種子發(fā)芽率
Fig.3 Maize seed germination rates with different concentrations of ZnO NPs

圖4 不同濃度ZnO NPs處理下玉米種子發(fā)芽勢
Fig.4 Maize seed germination energy with different concentrations of ZnO NPs

由圖5，6可知，種子發(fā)芽指數(shù)和種子活力指數(shù)均隨著納米氧化鋅濃度升高呈先升高后降低的趨勢。20～100 mg·L-1ZnO NPs處理的種子有較高的種子發(fā)芽指數(shù)，其中，50 mg·L-1和ZnO NPs的試驗組的種子發(fā)芽指數(shù)最高，除20 mg·L-1和100 mg·L-1ZnO NPs處理外，發(fā)芽指數(shù)均顯著高于其他處理(P<0.05)。50 mg·L-1和100 mg·L-1ZnO NPs處理的種子活力指數(shù)均顯著高于其它處理，且50 mg·L-1ZnO NPs的試驗組種子活力指數(shù)比無添加納米氧化鋅和20 mg·L-1Zn2+的對照組分別顯著高80.5%和107%(P<0.05)。而高濃度(1 000 mg·L-1)ZnO NPs處理顯著抑制了種子活力指數(shù)。

2.3 不同濃度ZnO NPs對玉米種子萌發(fā)后胚根、胚芽生長狀況的影響

不同濃度ZnO NPs處理對玉米種子萌發(fā)7 d后的玉米根、芽伸長具有差異性(圖7)。由表1可知，玉米的生物量也發(fā)生了變化，隨著納米氧化鋅濃度的增加，根系鮮重顯著增加，在100 mg·L-1ZnO NPs處理時達到最高，比無添加納米氧化鋅和20 mg·L-1Zn2+的對照組分別顯著高41.7%和42.6%；此外，50 mg·L-1ZnO NPs處理下的根系鮮重比無添加納米氧化鋅和20 mg·L-1Zn2+的對照組分別顯著高18.4%和19.1%(P<0.05)。濃度為1 000 mg·L-1ZnO NPs處理時的根系鮮重比無添加納米氧化鋅和20 mg·L-1Zn2+的對照組顯著低34.4%和34.0%，其他處理的根系鮮重與對照差異均不顯著。芽鮮重隨納米氧化鋅濃度的變化與根系鮮重的變化趨勢相似，不同的是芽鮮重在50 mg·L-1ZnO NPs處理時達到最高，比無添加納米氧化鋅和20·mg L-1Zn2+的對照組均顯著高27.1%，而1 000 mg·L-1ZnO NPs處理則顯著降低了芽鮮重(P<0.05)，其他試驗組與對照組的差異均不顯著。

表1 不同濃度ZnO NPs對玉米種子胚根及胚芽生長狀況的影響Table 1 Maize radicle and plumule growth with different concentrations of ZnO NPs

注：同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)(數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準差)。**表示在0.01水平上差異極顯著(P<0.01)。

Note: Different letters in the same column mean significant differences between treatments at 0.05 level (Data are average value ± standard deviation).** means significant differences between treatments at 0.01 level.

與對照及20 mg·L-1Zn2+處理相比，低濃度(50 mg·L-1和100 mg·L-1)ZnO NPs處理顯著增加了玉米胚根長，而1 000 mg·L-1ZnO NPs顯著抑制了玉米胚根的伸長(P<0.05)。整體上，玉米胚根的長度隨納米氧化鋅濃度的升高先增加后降低，這表明適宜濃度范圍內(nèi)納米氧化鋅的處理有助于玉米胚根伸長。

低濃度(10 mg·L-1、20 mg·L-1、50 mg·L-1和100 mg·L-1)ZnO NPs處理促進了種子胚芽的生長，隨著納米氧化鋅濃度的增加胚芽長度呈先增加后減少的趨勢，高濃度(500 mg·L-1和1 000 mg·L-1)ZnO NPs抑制了種子胚芽的生長(表1)。當ZnO NPs濃度為50 mg·L-1時，胚芽長度達到最高，比無添加納米氧化鋅和20 mg·L-1Zn2+的對照組顯著高16.4%和14.7%，同時也顯著高于10 mg·L-1和200～1 000 mg·L-1的試驗組(P<0.05)。

納米氧化鋅極顯著影響玉米不定根數(shù)(P<0.01)，其隨納米氧化鋅濃度的變化趨勢與胚芽生長一致(表1)。在濃度50 mg·L-1下，不定根數(shù)最高，比20 mg·L-1Zn2+的對照組顯著高21.6%，比1 000 mg·L-1的試驗組顯著高33.8%(P<0.05)。

2.4 不同濃度ZnO NPs對玉米幼苗根系糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.4.1 糖酵解途徑關(guān)鍵酶活性的變化。從不同濃度納米氧化鋅對玉米種子萌發(fā)的影響不難得出，低濃度(20 mg·L-1、50 mg·L-1和100 mg·L-1)ZnO NPs促進了種子萌發(fā)和幼苗生長，因此我們對篩選出的濃度進行了碳代謝關(guān)鍵酶活性的分析。由圖8可知，納米氧化鋅顯著影響了糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶、醛縮酶和磷酸果糖激酶活性(P<0.05)。濃度為50 mg·L-1ZnO NPs處理下的己糖激酶活性比無添加納米氧化鋅和20 mg·L-1Zn2+的對照組分別顯著高125%和86.0%(P<0.05)；而20 mg·L-1、100 mg·L-1的試驗組與對照組差異不顯著(圖8A)。磷酸葡糖糖異構(gòu)酶活性與己糖激酶活性變化趨勢相同，但處理間差異未達到顯著水平(圖8B)。與己糖激酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶活性變化不同的是，100 mg·L-1ZnO NPs顯著降低了醛縮酶活性(圖8C)。磷酸果糖激酶活性隨納米氧化鋅濃度升高先升高后降低，同對照相比100 mg·L-1的ZnO NPs顯著降低了磷酸果糖激酶活性，而較低濃度(20 mg·L-1、50 mg·L-1)ZnO NPs處理的磷酸果糖激酶活性與對照組差異不顯著(圖8D)。綜上可見，糖酵解途徑的調(diào)控因納米氧化鋅濃度的不同而有所不同，且幼苗根系糖酵解途徑不同酶的活性變化并不是完全一致。

2.4.2 脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的變化。脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性隨納米氧化鋅濃度升高先增加后降低，濃度為50 mg·L-1ZnO NPs處理下的脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性比無添加納米氧化鋅的對照組顯著高60.2%(P<0.05)，而20 mg·L-1、100 mg·L-1的試驗組與對照組差異不顯著(圖9)。

3 討論與結(jié)論

近年來，納米技術(shù)的廣泛應用為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域帶來了機遇和挑戰(zhàn)。納米材料對植物的各種形態(tài)和生理過程具有影響，對植物生長發(fā)育有益也有害，這取決于納米材料的應用方式、大小、濃度以及植物種類等[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，50 mg·L-1ZnO NPs浸種是提高玉米種子發(fā)芽速度和增強種子活力的最佳濃度，這可能與納米顆粒對種子的滲透有關(guān)[16]。由于納米顆粒的小尺寸效應，所產(chǎn)生的磁場與種子的磁場形成了主動靶向性，提高了種子對水分的吸收能力，促進了種子萌發(fā)[17]。而濃度高于100 mg·L-1時，不利于種子萌發(fā)甚至對種子生長產(chǎn)生抑制作用。除了對種子萌發(fā)產(chǎn)生影響，萌發(fā)后胚根、胚芽的生長也對納米氧化鋅處理響應顯著。50 mg·L-1和100 mg·L-1ZnO NPs浸種促進其根系及胚芽的生長和伸長，這有利于生物量的積累。已有研究證明，用濃度1 000 mg·L-1ZnO NPs噴灑花生葉片，可以促進其種子萌發(fā)，提高幼苗活力，增加株高和鮮重，并認為這可能是由于納米氧化鋅處理后，種子中鋅的濃度更高所導致的；而鋅在保護和維持細胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面起著重要作用，且與蛋白質(zhì)合成、膜功能、細胞伸長和對環(huán)境脅迫的耐受性密切相關(guān)[18]。濃度為0.1 mg·L-1ZnO NPs促進了花葉蘆竹種子萌發(fā)和根莖生長[13]，這表明植物不同，處理方式不同，促進種子萌發(fā)的納米氧化鋅最適濃度也不同。

種子萌發(fā)過程中，種子內(nèi)貯藏的蔗糖會進行分解代謝轉(zhuǎn)化為果糖和葡糖糖，為種子萌發(fā)生長提供能量。糖酵解途徑在高等植物中氧化蔗糖產(chǎn)生ATP、NADH和丙酮酸，需要己糖激酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和醛縮酶等多種酶的催化作用。糖酵解代謝途徑通過自身的正向調(diào)控和反饋抑制作用，維持糖酵解代謝處于最優(yōu)條件，提高植物對環(huán)境的適應能力[19]。本研究證明，50 mg·L-1ZnO NPs處理顯著提高了糖酵解活化需要的己糖激酶活性。己糖激酶除了催化己糖磷酸化，維持植物合成碳流和呼吸作用外，還可作為己糖感受器，參與植物的糖信號轉(zhuǎn)導過程[20]。己糖激酶催化己糖為磷酸己糖是糖酵解途徑的開端，較高的己糖激酶活性有助于己糖磷酸化和糖信號產(chǎn)生，為細胞呼吸和植物生長提供代謝物質(zhì)和能量。Winder等[21]研究表明，己糖激酶在葡萄糖傳感器中起核心作用，最終參與種子萌發(fā)及植物生長等過程。醛縮酶在糖酵解過程中催化3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮的醇醛縮合，可逆的生成果糖-1，6-二磷酸，也是光合器官中碳固定途徑的關(guān)鍵酶，參與淀粉合成途徑[22]。種子萌發(fā)過程中，種子中貯藏的淀粉被分解利用，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物和能量用于萌發(fā)生長。而糖質(zhì)新生需要消耗較多的能量，這不利于種子萌發(fā)階段的能量代謝平衡，所以較低的醛縮酶活性會抑制糖質(zhì)新生，利于種子萌發(fā)[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，50 mg·L-1，100 mg·L-1ZnO NPs處理抑制了醛縮酶活性，這可能與較高的Zn2+含量有關(guān)。高品等[24]研究結(jié)果也表明，8 mmol·L-1Zn2+抑制了醛縮酶活性。磷酸果糖激酶是糖酵解途徑的一個關(guān)鍵節(jié)點，它的存在會伴隨著大量能量的消耗，而他的缺失又會致使還原力失衡，影響下游代謝途徑[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，20 mg·L-1和50 mg·L-1ZnO NPs處理下磷酸果糖激酶活性與無添加納米氧化鋅的對照組差異不顯著，這表明適宜濃度的納米氧化鋅使磷酸果糖激酶活性處于能量與還原力平衡的狀態(tài)。脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶催化脲苷二磷酸葡萄糖(UDPG)與焦磷酸(PPi)生成1-磷酸葡萄糖(G-1-P)的可逆反應，還參與細胞壁的生物合成[13,26]；在發(fā)育的種子等組織內(nèi)，脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶可以使尿苷二磷酸葡萄糖脫離蔗糖合成酶，使平衡像蔗糖降解的方向進行[27]。本研究表明，50 mg·L-1ZnO NPs處理下脲苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性顯著高于無添加納米氧化鋅的對照組，這有利于細胞壁組分的前體物質(zhì)纖維素及胼胝質(zhì)等的合成。已有研究表明，植物生長、繁殖與UGP基因的表達密切相關(guān)[28]。

綜上，50 mg·L-1納米氧化鋅浸種促進了糖酵解代謝和細胞壁的生物合成過程，有利于促進種子萌發(fā)，提高幼苗活力。但是，高等植物的糖代謝過程是多條途徑綜合、動態(tài)調(diào)控的，適宜濃度的納米氧化鋅對種子萌發(fā)的促進作用機制還有待進一步研究。目前，關(guān)于納米氧化鋅在田間條件下對作物影響的研究還不多，如何正確利用納米氧化鋅指導農(nóng)業(yè)生產(chǎn)仍需繼續(xù)探討。