意大利蒼耳提取物抗植物病原真菌活性研究

何源 齊浩 阿力米熱·庫(kù)來(lái)西 張博 迪麗妮尕·艾斯卡爾 潘樂(lè)

摘要?[目的]研究意大利蒼耳提取物抗植物病原真菌活性，為植物資源的利用及植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。[方法]以意大利蒼耳（Xanthium italicum Moretti）全草為原料，經(jīng)90%乙醇超聲輔助提取后，分別用不同溶劑進(jìn)行萃取得到石油醚相、氯仿相和乙酸乙酯相。采用菌絲生長(zhǎng)速率法研究各相對(duì)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、茄交鏈孢（Alternaria solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium Oxysporum）、鏈格孢（Alternaria alternata）等植物病菌的抑菌活性。[結(jié)果]3種萃取相對(duì)4種植物病原真菌均具有顯著抑制且呈濃度依賴(lài)性，其中氯仿萃取相對(duì)4種植物病原真菌抑制效果最好，當(dāng)濃度為800 μg/mL時(shí)抑制率均達(dá)50%以上。對(duì)灰葡萄、孢鏈格孢、尖孢鐮刀菌和茄交鏈孢的EC50 分別為788.36、566.93 、496.48 、339.39 μg/mL。[結(jié)論]意大利蒼耳萃取相中，氯仿相對(duì)供試真菌抑制作用顯著，活性成分主要集中在中低極性部位。該研究為從意大利蒼耳次生代謝物中發(fā)掘活性先導(dǎo)化合物和植物源農(nóng)藥的創(chuàng)制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞?意大利蒼耳提取物，抗真菌活性，抑制作用

中圖分類(lèi)號(hào)?S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A

文章編號(hào)?0517-6611（2020）06-0119-03

Abstract?[Objective]To ?research activity of extracts of Xanthium italicum Moretti against plant pathogenic fungi，and provide ?research basis for the utilization of plant resources and the development of plantderived pesticides.[Method]Xanthium italicum Moretti was used as the raw material，and after ultrasonic extraction with 90% ethanol，the extract was extracted with different solvents to obtain petroleum ether phase，chloroform phase and ethyl acetate phase.The antibacterial activity of each plant pathogen such as Botrytis cinerea，Alternaria solani，F(xiàn)usarium Oxysporum，and Alternaria alternata was studied by mycelial growth rate method.[Result]Three extracts exhibited antifungal activity against four plant pathogenic fungi with concentrationdependent inhibition.Among them，chloroform extract showed the strongest inhibition against the four plant pathogenic fungi at the concentration of 800 μg/mL.When the EC50 values on Botrytis cinerea，Alternaria solani，F(xiàn)usarium Oxysporum Alternaria alternata were 788.36，566.93 496.48 and 339.39 μg/mL.[Conclusion]The extract of Xanthium italicum，chloroform has a significant inhibitory effect on the tested fungi，and the active ingredients are mainly concentrated in the middle and low polarity parts.This study provides a basis for the discovery of active lead compounds and plantderived pesticides from the secondary metabolites of Xanthium italicum.

Key words?Xanthium italicum Moretti wholegrass extract，Antifungal activity，Inhibition effect

意大利蒼耳（Xanthium italicum Moretti）為菊科蒼耳屬（Xanthium L）一年生草本植物[1-2]。1991年9月在北京市昌平區(qū)首次報(bào)道，成為我國(guó)主要的入侵植物之一[3]。近年來(lái)，意大利蒼耳在新疆地區(qū)快速繁殖蔓延，成為該地區(qū)主要入侵植物。該種傳播速度快、散布范圍廣、長(zhǎng)勢(shì)猛、體型大，幼苗有毒，牛、羊等牲畜不食，對(duì)當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重危害，但由于其生物量巨大、植物資源豐富，且表現(xiàn)出很強(qiáng)的化感作用，表現(xiàn)出顯著的殺蟲(chóng)、抑菌作用[4-6]。因而，其在農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害防治方面的研究引起廣泛關(guān)注。新疆是我國(guó)重要的糧食與林果產(chǎn)區(qū)，但近年來(lái)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、鏈格孢（Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌（Fusarium Oxysporum）、茄交鏈孢（Alternaria solani）等暴發(fā)頻繁、危害嚴(yán)重，成為主要的病原真菌。2009年在阿克蘇、和田地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)由鏈格孢引起的棗果黑斑病，次年該病在阿克蘇爆發(fā)使新疆兵團(tuán)第一師的商品果產(chǎn)量損失超過(guò)30%，2015和2016年，南疆紅棗再次因該病造成了嚴(yán)重?fù)p失[7-8]。王成軍等[9]在新疆石河子等地區(qū)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，由灰葡萄孢引起的灰霉病會(huì)導(dǎo)致番茄減產(chǎn)20% ～ 40%，黃瓜減產(chǎn)30% ～ 50% ，西葫蘆減產(chǎn)10% ～ 30%。由尖孢鐮刀菌侵染引起的根腐病已經(jīng)給新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大損失，在新疆阿爾泰地區(qū)由于大豆連作，根腐病大面積發(fā)生、造成大面積減產(chǎn)和200 hm2絕收[10]，因此篩選出高效、安全的防治藥劑，對(duì)于降低病害發(fā)生，提高產(chǎn)量具有重要意義。研究者針對(duì)蒼耳屬植物的抗菌殺蟲(chóng)作用發(fā)現(xiàn)較早，丁維成等[11]采用菌絲生長(zhǎng)速率法研究發(fā)現(xiàn)蒼耳葉丙酮提取物對(duì)21種植物病原真菌均有不同程度的抑制作用其中對(duì)水稻惡苗病菌、玉米頂腐病菌、水稻稻瘟病菌及小麥根腐病菌活性最好，王旭等[12]對(duì)蒼耳提取物Ⅱ柱層析分離后發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸、十八烷酸流分對(duì)植物病原菌黃瓜枯萎、黃瓜黑星病菌有較強(qiáng)的抑制作用，張君霞等[13]研究發(fā)現(xiàn)蒼耳氯仿提取物對(duì)蘿卜蚜有很強(qiáng)的忌避作用、觸殺作用，對(duì)黏蟲(chóng)具有拒食和生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用。但目前，對(duì)意大利蒼耳抗菌活性的研究很少。筆者以意大利蒼耳提取物為研究對(duì)象，采用超聲輔助法對(duì)意大利蒼耳全草進(jìn)行提取，分別得到氯仿相、乙酸乙酯相和石油醚相，并以灰葡萄孢、鏈格孢、尖孢鐮刀菌、茄交鏈孢為對(duì)象研究了各相的抗植物病原真菌活性，旨在為意大利蒼耳植物資源的利用及植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

供試植物：意大利蒼耳 （Xanthium italicum Moretti），2017年7月采集于新疆博爾塔拉蒙古自治州。供試菌株：灰葡萄孢 （Botrytis cinerea）、鏈格孢 （Alternaria alternata）、尖孢鐮刀菌 （Fusarium Oxysporum）、茄交鏈孢 （Alternaria solani）由中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所化學(xué)生態(tài)學(xué)研究室提供。

1.2?植物提取液的制備

將采集后的意大利蒼耳全草洗凈自然陰干后粉碎，稱(chēng)取植物粉末，并用90%乙醇浸泡，于室溫超聲振蕩輔助提取，用6層紗布過(guò)濾，再用濾紙抽濾2遍除去固體殘?jiān)瑸V液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到浸膏[14]。將浸膏用水分散后，依次加入石油醚、氯仿和乙酸乙酯，用力振蕩使其充分混合，靜置分液，此過(guò)程重復(fù)3次，分別合并石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取液減壓蒸餾濃縮至恒定質(zhì)量，得到石油醚萃取相、氯仿萃取相，乙酸乙酯萃取相。

1.3?植物提取液抑菌活性測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定法[15]，測(cè)定意大利蒼耳的3種萃取相對(duì)4種植物病原真菌的毒力。在無(wú)菌操作條件下，采用稀釋法在10 mL 50 ～60 ℃的PDA培養(yǎng)基中依次加入不同濃度的植物提取物母液，稀釋成不同梯度的含藥培養(yǎng)基，加入等體積的二甲基亞砜溶液為對(duì)照。用直徑7 mm打孔器在菌落邊緣生長(zhǎng)一致的部分打制菌餅，將菌餅（有菌絲的面朝下）接種于平板中央，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用十字交叉法測(cè)定各處理菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率，并進(jìn)行EC50 計(jì)算。

用下列公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率：

菌落直徑（mm）= 測(cè)量菌落的平均直徑-菌餅直徑

抑制率=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑×100%

2?結(jié)果與分析

2.1?抑菌活性?由表1可知，意大利蒼耳全草的3種萃取相對(duì)4種病原菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。在同一濃度處理下，意大利蒼耳全草的 3 種提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌和鏈格孢總體抑菌效果表現(xiàn)為氯仿相 > 石油醚相 > 乙酸乙酯相，對(duì)茄交鏈孢抑菌效果表現(xiàn)為氯仿相 > 乙酸乙酯相 > 石油醚相。各萃取相對(duì)不同病原真菌的抑制效果不同，有一定的選擇性，當(dāng)抑菌時(shí)間為72 h濃度為800 μg/mL時(shí)，氯仿相對(duì)4種病原真菌均有較好的抑制作用，抑制率分別為51%、63%、60%、80%。

由表2、3可知，意大利蒼耳全草的3種萃取相對(duì)4種病原菌在同一濃度，不同時(shí)間處理下呈現(xiàn)的抑菌總趨勢(shì)與表1一致。其中灰葡萄孢和茄交鏈孢的抑制率隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，抑制率逐漸下降，尖孢鐮刀菌和鏈格孢的抑制率隨時(shí)間呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)。說(shuō)明這4種菌對(duì)意大利蒼耳全草的3種萃取相具有一定的抑菌活性，灰葡萄孢和茄交鏈孢對(duì)意大利蒼耳全草的3種萃取相具有一定的耐藥性。

2.2?相對(duì)毒力

由表 4 可知，意大利蒼耳全草3種萃取相對(duì)4 種植物病原真菌的EC50 值之間差異顯著，其中氯仿提取物相較于其他2種提取物對(duì)灰葡萄孢、茄交鏈孢、尖孢鐮刀菌、鏈格孢抑制效果最強(qiáng)，其 EC50 分別為788.36、566.93、496.48和339.39 μg/mL。石油醚提取物和乙酸乙酯提取物對(duì)灰葡萄孢、茄交鏈孢、尖孢鐮刀菌、鏈格孢抑制效果相對(duì)較弱，其 EC50 均超過(guò)了1 000 μg/mL。說(shuō)明氯仿提取物抑制效果優(yōu)于其他2種提取物，意大利蒼耳中主要的抗菌活性物質(zhì)集中在氯仿相中。

3?討論

意大利蒼耳入侵新疆后嚴(yán)重抑制了地蒼耳的生長(zhǎng)繁殖，且破壞了本地蒼耳與其他物種間的群落結(jié)構(gòu)關(guān)系及生態(tài)系統(tǒng)平衡[16]。研究發(fā)現(xiàn)，造成本地藥用蒼耳生長(zhǎng)分布與資源量減少的重要原因之一，是因?yàn)橐獯罄n耳總苞果的水提液具有很強(qiáng)的化感作用，可以改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、土壤酶活性和土壤養(yǎng)分，從而抑制本地蒼耳種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[17-18]。但目前對(duì)意大利蒼耳是否具有同本地蒼耳相同的藥用價(jià)值還未知，這些化感作用明顯部位與其抗菌活性的強(qiáng)弱是否有關(guān)還有待深入研究。

蒼耳屬中化學(xué)成分多種多樣，目前已從中分離得到揮發(fā)油類(lèi)、倍半萜內(nèi)酯類(lèi)、甾體類(lèi)、水溶性苷類(lèi)、酚酸類(lèi)等百余種化合物，研究者也對(duì)相應(yīng)的單體化合物進(jìn)行了活性研究。胡冬燕[19]利用現(xiàn)代色譜技術(shù)對(duì)蒼耳（Xanthium sibiricum）氯仿萃取相進(jìn)行分離純化得到蒼耳亭、蒼耳皂素、蒲公英賽醇等11種化合物，并對(duì)含量較大的產(chǎn)物蒼耳亭（0.1%）進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)辣椒絲核、番茄灰霉病菌有較強(qiáng)的抑制作用。有研究者針對(duì)蒼耳（Xanthium sibiricum Patrin.ex Widder）石油醚、乙酸乙酯萃取相也分離得到了蒲公英賽醇、羽扇豆酮、蒼耳亭、蒼耳皂素等化合物并發(fā)現(xiàn)這些化合物對(duì)蕃茄早疫、黃瓜枯萎、蕃茄灰霉和蘋(píng)果腐爛病菌有較好的抑制作用[20]。此外，袁著耕[21]研究發(fā)現(xiàn)用不同萃取相對(duì)刺蒼耳（Xanthium spinosum L.）果實(shí)萃取后氯仿萃取相的化感作用最強(qiáng)，并由此推測(cè)氯仿萃取相相較于其他萃取相化感作用物質(zhì)最多。由此可知，意大利蒼耳經(jīng)不同溶劑萃取后，其中的活性成分基本相似。但該研究采用梯度萃取，不同極性的活性物質(zhì)是否富集到了不同極性的萃取溶劑中，還有待進(jìn)一步分離純化驗(yàn)證。

意大利蒼耳全草醇提物各萃取相的抗真菌效果具有顯著差異，主要原因是抗菌活性物質(zhì)經(jīng)不同極性有機(jī)溶劑萃取后富集在不同極性部位，不同極性萃取液中有生物活性的化學(xué)成分存在差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，各萃取相對(duì)不同菌也表現(xiàn)出不同抑制，可能是因?yàn)椴煌参锊≡L(zhǎng)所需的生長(zhǎng)要素以及代謝方式不同所致[22]。該研究為了最大程度地提高提取效率、縮短提取時(shí)間的同時(shí)不破壞其化感部位，保證提取物中的活性結(jié)構(gòu)不變，采用了超聲輔助溶劑提取法。萃取方法采用的是梯度萃取，但經(jīng)石油醚、氯仿萃取后，乙酸乙酯萃取出來(lái)的東西相對(duì)較少，這可能是該試驗(yàn)氯仿萃取相抑菌效果好，而乙酸乙酯相的抑菌效果相對(duì)較差的主要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，在蒼耳屬其他種中表現(xiàn)出類(lèi)似抑制情況，劉文潔[23]研究了蒼耳根（X.sibiricum）提取物對(duì)蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等的抗菌作用，發(fā)現(xiàn)氯仿相對(duì)6種菌都有很好的抑制作用，是萃取樣品中抑菌效果最廣的。研究者在蒼耳（X.sibiricum）氯仿萃取相中分離得到了蒼耳亭、蒲公英賽醇、β-谷甾醇、東莨菪內(nèi)酯等具有顯著抗真菌活性的單體化合物[24-25]，而意大利蒼耳的抗真菌作用是否也因這些化合物引起，將通過(guò)進(jìn)一步分離純化明確其物質(zhì)基礎(chǔ)。

4?結(jié)論

意大利蒼耳作為新疆入侵植物，因?yàn)槠鋫鞑ニ俣瓤?、散布范圍廣等因素，對(duì)地區(qū)農(nóng)牧業(yè)的生產(chǎn)造成極大的負(fù)面影響，但對(duì)其進(jìn)行植物資源開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。該研究通過(guò)超聲輔助提取意大利蒼耳經(jīng)乙醇提取后分別萃取得到石油醚、乙酸乙酯、氯仿3相。通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定法對(duì)4種植物病原真菌進(jìn)行殺菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)氯仿提取物抑制作用最強(qiáng)，最高抑制率達(dá)80%，EC50 達(dá)339.39 μg/mL。分析表明，意大利蒼耳全草提取物在植物病原真菌防治方面具有開(kāi)發(fā)潛力，其中以氯仿提取物為最佳。該研究為意大利蒼耳抗病的物質(zhì)基礎(chǔ)及進(jìn)一步分離純化奠定了基礎(chǔ)，為新疆蒼耳屬植物資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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