磷脂膜的相行為對(duì)氧化石墨烯與磷脂膜相互作用的影響

張曉菲,武 烈,李?yuàn)檴?朱曼毓,程曉偉,姜秀娥

(1.中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所,電分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)春 130022; 2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)與工程學(xué)院,安徽 230026)

生物體內(nèi)的磷脂分子除了存在因極性頭部基團(tuán)差異引起的種類差別外,還存在因烷基鏈結(jié)構(gòu)差異而引起的種類差別.其中,烷基鏈上的雙鍵可顯著改變磷脂分子的相變溫度,并對(duì)磷脂膜的相態(tài)有顯著影響.由于不同磷脂組分的相態(tài)不同,磷脂雙層膜具有顯著的相態(tài)異質(zhì)性[1],而磷脂膜的相態(tài)異質(zhì)性對(duì)維持細(xì)胞膜的基本功能至關(guān)重要.許多生物大分子,如DNA[2]、蛋白質(zhì)[3]與磷脂膜的相互作用都具有相態(tài)選擇性.研究還發(fā)現(xiàn),膜的相態(tài)對(duì)納米材料與磷脂膜的相互作用也具有顯著影響,從而影響細(xì)胞反應(yīng)和細(xì)胞毒性.如Holl等[4]報(bào)道了聚陽(yáng)離子聚合物可選擇性地破壞磷脂膜的流動(dòng)相區(qū)域,而凝膠相區(qū)域則不受影響.Hamda等[1]發(fā)現(xiàn)納米粒子能夠以一種尺寸依賴的方式與具有兩相分離的囊泡結(jié)合: 直徑小于200 nm的納米粒子結(jié)合到膜的有序相區(qū)域,而大于200 nm的粒子則結(jié)合到無序相區(qū)域.這些研究都表明納米材料在磷脂膜上的吸附和作用具有相態(tài)選擇性.Liu等[5]發(fā)現(xiàn),與流動(dòng)性較低的脂質(zhì)體相比,金納米顆粒與流動(dòng)性較高的脂質(zhì)體的相互作用更快,表明磷脂膜與納米材料間相互作用的強(qiáng)度也受到磷脂分子相態(tài)的影響.Wang等[6]發(fā)現(xiàn)不同相態(tài)磷脂分子結(jié)構(gòu)不同,且其分子定向也存在著差異,這可能是導(dǎo)致作用強(qiáng)度差異的原因.此外,負(fù)電性的納米粒子可以引起流動(dòng)相的磷脂膜局部凝膠化,而正電性的納米粒子則引起凝膠相的磷脂膜局部流動(dòng)化[6].這表明磷脂膜的相態(tài)及其與納米材料的相互作用存在交互影響.然而,磷脂膜的兩種相態(tài)(凝膠相與流動(dòng)相)及不同相態(tài)間的比例在生命活動(dòng)過程中不斷改變,如肺膜在呼-吸循環(huán)的過程中,表面壓不同時(shí)誘導(dǎo)肺膜中的磷脂分子處于不同的相態(tài)中.因此,探究磷脂膜相態(tài)的動(dòng)態(tài)變化對(duì)納米材料與磷脂膜相互作用的影響及其誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)具有重要意義,而且對(duì)理解生物膜的本質(zhì)以及納米生物界面相互作用具有重要價(jià)值.

作為代表性的二維納米材料,氧化石墨烯(GO)由于具有較大的比表面積及易于表面功能化和表面改性的特性,已在生物成像、癌癥治療和抗菌等方面得到廣泛應(yīng)用[7].隨著氧化石墨烯在生物領(lǐng)域的發(fā)展,揭示氧化石墨烯-生物膜界面相互作用對(duì)于闡明氧化石墨烯的生物學(xué)效應(yīng)及保證氧化石墨烯的生物安全性具有重要意義[8].目前,在基于磷脂雙層膜或磷脂囊泡的模型生物膜研究中發(fā)現(xiàn),氧化石墨烯可以通過物理或化學(xué)機(jī)制引起生物膜的損傷[9～15].通過計(jì)算機(jī)模擬,Gao等[9]發(fā)現(xiàn)石墨烯材料可以通過其鋒利的邊緣插入細(xì)胞膜內(nèi)部而破壞膜的結(jié)構(gòu); Zhou等[10,11]和Zeng等[12]進(jìn)一步證實(shí)了氧化石墨烯可以抽提磷脂膜中的磷脂進(jìn)而破壞生物膜的完整性.基于表面增強(qiáng)紅外吸收光譜,本課題組[13]發(fā)現(xiàn),氧化石墨烯與磷脂膽堿基團(tuán)間的靜電吸引和疏水作用及與磷酸基團(tuán)間的氫鍵作用是其克服與磷酸基團(tuán)間靜電排斥作用而吸附在磷脂膜上的主要驅(qū)動(dòng)力,而且氧化石墨烯對(duì)磷脂膜中磷脂分子的抽提作用需要這些弱作用力的協(xié)同配合[14].研究還發(fā)現(xiàn),氧化石墨烯的碳自由基引起的磷脂過氧化也可以導(dǎo)致膜損傷,而且膜損傷的程度依賴于材料表面碳自由基的密度[13].由于生物膜相態(tài)異質(zhì)性的存在,氧化石墨烯-生物膜界面相互作用必然會(huì)受到磷脂膜物理特性的影響.然而,磷脂膜的相行為對(duì)氧化石墨烯與磷脂膜間相互作用及其誘導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)的影響尚未見報(bào)道.

本文通過應(yīng)用不同相變溫度的磷脂分子(1,2-二油?；?甘油-3-磷酸膽堿和1,2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿)制備了相分離的模擬生物膜,并通過調(diào)節(jié)二者的比例來模擬生物膜的動(dòng)態(tài)相行為,結(jié)合表面增強(qiáng)紅外吸收光譜(SEIRAS)和激光掃描共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)研究了磷脂膜的相行為對(duì)氧化石墨烯和磷脂膜相互作用的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

石墨粉、氯金酸鈉(NaAuCl4),亞硫酸鈉(Na2SO3)、硫代硫酸鈉(Na2S2O3)、氯化銨(NH4Cl)、氟化銨(NH4F)和氟化氫(HF)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技有限公司; 氯仿(光譜純)購(gòu)于天津光復(fù)化學(xué)試劑公司; 十八烷基硫醇(ODT)、1,2-二油?；?甘油-3-磷酸膽堿(DOPC)、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DPPC)均購(gòu)于Sigma-Aldrich試劑公司; 羅丹明B標(biāo)記的1,2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(LR-DOPE)和硝基苯并-2-氧雜-1,3二唑標(biāo)記的1,2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(NBD-DPPE)購(gòu)于Avanti Polar Lipids試劑公司.實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率18.25 MΩ·cm).

ESCALAB 250型X射線光電子能譜(XPS)儀,美國(guó)賽默飛世爾科技公司; LAMBDA型25紫外-可見光譜儀,美國(guó)Perkin Elmer公司; Multimode-V型原子力顯微鏡(AFM),美國(guó)Veeco儀器公司; VERTEX 70型傅里葉變換紅外(FTIR)光譜儀,德國(guó)布魯克公司; Autolab PGSTAT302N型電化學(xué)工作站,瑞士萬通公司; H-600型透射電子顯微鏡(TEM),日本Hitach公司; 表面增強(qiáng)紅外光譜(SEIRAS)電化學(xué)測(cè)試平臺(tái)基于IFS 66s/v型傅里葉變換紅外光譜儀(德國(guó)布魯克公司)進(jìn)行改造; TCS SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM),德國(guó)Leica公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 氧化石墨烯的制備 以商品化石墨粉為原料,基于Hummer法改良的“水增強(qiáng)的氧化”法[16]制備氧化石墨烯.

1.2.2 金納米薄膜基底的制備 首先用氧化鋁拋光粉(1 μm)對(duì)硅晶體表面進(jìn)行拋光,然后用大量水沖洗以除去表面殘留的拋光粉.將處理干凈的硅晶體浸沒于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的氟化銨溶液中,保持3 min以形成氫化表面,用超純水沖洗表面并用洗耳球吹干殘留水滴.將帶有氫化層的硅表面置于60 ℃的熱水中加熱10 min,將0.03 mol/L的NaAuCl4溶液、0.3 mol/L Na2SO3+0.1 mol/L Na2S2O3+0.1 mol/L NH4Cl混合溶液和體積分?jǐn)?shù)2.5%的HF水溶液等體積混合,并滴加于硅晶體表面,反應(yīng)90 s 獲得金納米薄膜.最后用超純水沖洗表面以終止反應(yīng).通過電化學(xué)方法將金膜表面潛在的污染物除去后,將其安裝在自制的玻璃池上,進(jìn)行溫度控制的表面增強(qiáng)紅外光譜實(shí)驗(yàn)(裝置如本文支持信息圖S1所示).

1.2.3 囊泡的制備 采用膜擠出法制備了熒光標(biāo)記和未標(biāo)記的磷脂囊泡.未標(biāo)記囊泡的制備: 將DPPC磷脂與DOPC磷脂按照摩爾比分別為0∶,1,1∶,1,1∶,4,1∶,10及1∶,0混合于含有氯仿的玻璃瓶中,以獲得具有不同相態(tài)的磷脂囊泡.熒光標(biāo)記囊泡的制備: 使用LR-DOPE和NBD-DPPE熒光磷脂分別標(biāo)記流動(dòng)相的DOPC和凝膠相的DPPC磷脂,將熒光標(biāo)記的磷脂和未標(biāo)記的磷脂在氯仿中以摩爾比為1∶,100的比例混合.首先,在緩慢的氮?dú)饬飨滦D(zhuǎn)玻璃瓶,以除去氯仿并在玻璃瓶壁上形成一層磷脂層薄膜.將玻璃瓶于真空干燥箱中放置10 h后,加入超純水,水合30 min后超聲處理3～5 min,用液氮和溫水對(duì)溶液進(jìn)行10次凍融循環(huán).最后將磷脂渾濁液通過聚碳酸脂膜(孔徑為100 nm)擠出以收集小的單層磷脂囊泡.

1.2.4 SEIRAS監(jiān)測(cè)氧化石墨烯與不同相態(tài)的磷脂膜的相互作用 首先,利用原位SEIRAS實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同相態(tài)的磷脂膜通過磷脂囊泡在疏水性自組裝單層膜上展開融合的形成過程.將1 mol/L ODT乙醇溶液浸沒于新制備的金膜中,以乙醇溶液為背景,采集ODT分子吸附的樣品譜,每條譜線由512次掃描疊加.監(jiān)測(cè)10 min后停止采集譜圖.保持體系12 h,以獲得致密的疏水性單層膜.然后用乙醇去除未吸附的分子并用氮?dú)獯蹈杀砻?加入500 μL超純水并采集背景譜線,再加入500 μL磷脂囊泡溶液(1 mg/mL),采集樣品譜線,每條譜線由512次掃描疊加,持續(xù)監(jiān)測(cè)3 h.最后用大量超純水小心仔細(xì)洗滌金膜表面,除去未展開融合的磷脂囊泡,此過程必須保證磷脂雙層膜浸沒在水溶液中而非暴露于空氣中.將在金膜上形成的磷脂膜在水中平衡一段時(shí)間,以此為背景溶液記錄背景譜線.加入最終濃度為50 μg/mL的氧化石墨烯,立即采集樣品譜線,每1 min采集一條樣品譜線,每條譜線由512次掃描疊加.對(duì)于氧化石墨烯與在相變溫度以上的DPPC磷脂膜的相互作用,通過外部循環(huán)水浴將浸沒于水中的ODT自組裝單層膜加熱至46 ℃,以此為背景記錄背景譜線.再加入預(yù)先加熱至46 ℃的DPPC囊泡溶液,采集樣品譜線.3 h后使用46 ℃的超純水洗去多余的囊泡,并在此背景溶液中平衡一段時(shí)間,以此為背景溶液記錄背景譜線.加入最終濃度為50 μg/mL的氧化石墨烯,立即采集樣品譜線,每1 min采集一條樣品譜線,每條譜線由512次掃描疊加.

1.2.5 CLSM實(shí)驗(yàn)裝置的構(gòu)筑 CLSM實(shí)驗(yàn)采用自制的液體流動(dòng)池進(jìn)行.實(shí)驗(yàn)裝置圖如圖S2(見本文支持信息)所示.將石英片和載玻片在無水乙醇中超聲10 min,然后用大量超純水沖洗并在高純氮?dú)庀麓蹈?再放置于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2和70%的H2SO4的100 ℃食人魚溶液中加熱清洗3 h.然后用大量超純水徹底沖洗并在高純氮?dú)庀麓蹈?最后將O形圈(直徑1.2 cm)放在干凈的石英片上,并將載玻片放在其上面并用膠水粘合,形成三明治結(jié)構(gòu)的液體池.溶液通過載玻片上的兩個(gè)小孔由與注射泵相連的聚乙烯管注入到流動(dòng)池中.

1.2.6 CLSM監(jiān)測(cè)氧化石墨烯與不同相態(tài)的磷脂膜的相互作用 氧化石墨烯與流動(dòng)相的DOPC磷脂膜的相互作用: 首先,將DOPC囊泡在干凈的石英片上融合展開形成磷脂雙層膜,再用大量的超純水除去未展開的囊泡,通過CLSM觀察磷脂膜的形貌,然后將50 μg/mL的氧化石墨烯引入流動(dòng)池,90 min后使用CLSM觀察磷脂膜的形貌變化.氧化石墨烯與凝膠相的DPPC磷脂膜以及DPPC/DOPC磷脂膜的相互作用: 首先,在50 ℃下將囊泡在干凈的石英片上融合展開形成磷脂雙層膜,將體系冷卻至室溫,用大量的超純水除去未展開的囊泡,通過CLSM觀察磷脂膜的形貌.然后將50 μg/mL的氧化石墨烯引入流動(dòng)池,90 min后使用CLSM觀察磷脂膜的形貌變化.氧化石墨烯與流動(dòng)相的DPPC磷脂膜的相互作用: 首先通過CLSM觀察DPPC磷脂膜的形貌,將此體系升溫至46 ℃后,將50 μg/mL的氧化石墨烯引入流動(dòng)池,90 min后通過CLSM觀察DPPC磷脂膜的形貌變化.

1.2.7 熒光光譜測(cè)量磷脂膜的相態(tài) Laurdan是一種疏水性熒光染料,其最大發(fā)射波長(zhǎng)依賴于磷脂膜的相態(tài): 當(dāng)磷脂膜從凝膠相轉(zhuǎn)變?yōu)榱鲃?dòng)相時(shí),Laurdan的發(fā)射波長(zhǎng)從440 nm紅移到490 nm.對(duì)于具有不同相行為的Laurdan標(biāo)記的磷脂膜,其流動(dòng)性可通過Laurdan的歸一化極化(GP)值表示:

GP340=(I440-I490)/(I440+I490)

式中,I440和I490均為在波長(zhǎng)為340 nm激發(fā)光下,Laurdan分別在發(fā)射波長(zhǎng)為440和490 nm處的熒光強(qiáng)度.

將200 μmol/L磷脂囊泡和1 μmol/L探針分子Laurdan混合測(cè)定熒光光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 氧化石墨烯的合成與表征

Fig.1 TEM image(A),AFM image(B,inset shows the height profile),UV-Vis spectrum(C),survey(D)， C1s(E) XPS spectra and FTIR spectrum(F) of GO sample

2.2 氧化石墨烯與不同相態(tài)下的磷脂膜的相互作用

Fig.2 SEIRAS of GO interacting with lipid membrane in single phase state(A) DOPC lipid membrane in fluid state; (B),(C) DPPC lipid membrane in gel state and in fluid state in water,respectively.Sample spectra were obtained with the spectra of lipid membrane in water as reference.Curves a—f were recorded at 1,5,10,30,60 and 90 min,respectively.

Fig.3 Fluorescence images of the morphology change of GO interacting with lipid membrane in single phase state(A),(A′) DOPC lipid membrane in fluid state before(A) and after(A′) interacting with GO.(B),(B′),(C),(C′) DPPC lipid membrane in gel state(B,B′) and in fluid state(C,C′) before(B,C) and after(B′,C′) interacting with GO.

Fig.4 Cartoon schematic diagram of orientation of head group of PC lipids in gel phase and fluid phase(A) and fluorescence intensity change of fluorescence-labeled DOPC and DPPC vesicles after interacting with GO(B)

Fig.5 SEIRA difference spectra of GO interact with DPPC/DOPC(1∶,10)(A), DPPC/DOPC(1∶,4)(B) and DPPC/DOPC(1∶,1)(C) lipid membranes in two phase separation Sample spectra were obtained with the spectra of lipid membrane in water as reference,respectively.Curves a—f were recorded at 1,5,10,30,60 and 90 min,respectively.

Fig.6 Fluorescence images of the morphology change of DPPC/DOPC(1∶,10)(A,D), DPPC/DOPC(1∶,4)(B,E) and DPPC/DOPC(1∶,1)(C,F) lipid membrans interact without(A—C) and with(D—F) GO in two phase separation

凝膠相的DPPC和流動(dòng)相的DOPC磷脂分子具有完全相同的頭部基團(tuán),二者的結(jié)構(gòu)差別僅是與烷基鏈區(qū)域是否存在雙鍵.但二者混合的比例卻對(duì)其與氧化石墨烯間的相互作用具有顯著的影響.推測(cè)氧化石墨烯無法從DPPC/DOPC摩爾比為1∶,4和1∶,1的磷脂膜中抽提DOPC磷脂可能的原因是混合膜中凝膠相的DPPC磷脂分子對(duì)流動(dòng)相的DOPC分子的相態(tài)產(chǎn)生了一定的影響.為了證實(shí)該結(jié)論,使用疏水性熒光分子Laurdan測(cè)試了3種混合磷脂膜的相態(tài)[6].如圖7(A)所示,對(duì)于凝膠相的磷脂膜和流動(dòng)相的磷脂膜,Laurdan探針的最大吸收值分別位于440和490 nm.對(duì)于兩相共存的混合磷脂膜,隨著膜中流動(dòng)相DOPC磷脂含量的增加,Laurdan探針的最大吸收值逐漸紅移,意味著膜的流動(dòng)性逐漸增強(qiáng).膜的相態(tài)變化可由GP340值定量表示.由圖7(B)可見,隨著膜中DPPC磷脂摩爾分?jǐn)?shù)從0增加到100%,GP340值呈非線性增加的趨勢(shì).表明DPPC磷脂和DOPC磷脂的混合是一種非理想混合,DPPC磷脂的加入對(duì)DOPC磷脂分子的相態(tài)產(chǎn)生了影響.而且每種DPPC/DOPC磷脂膜的GP340值均大于理想混合DOPC和DPPC形成磷脂膜的GP340值,表明二元混合磷脂膜中凝膠相磷脂可以引起流動(dòng)相磷脂一定程度的凝膠化.Pyrkova等[23]通過分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)DPPC磷脂可以作為一種“有序性”調(diào)節(jié)劑,影響DOPC磷脂的行為.本文結(jié)果與其一致.因此,氧化石墨烯無法從DPPC/DOPC摩爾比為1∶,4和1∶,1的磷脂膜中抽提DOPC磷脂,是由于膜中大量的DPPC磷脂引起DOPC磷脂更大程度的凝膠化,使二元混合膜的相態(tài)行為更加接近凝膠相所導(dǎo)致.本研究結(jié)果表明,磷脂膜中磷脂分子所處的相態(tài)不僅影響其與氧化石墨烯間相互作用的強(qiáng)弱而誘導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng),而且磷脂的相行為對(duì)氧化石墨烯與磷脂膜的相互作用及對(duì)膜的損傷存在復(fù)雜的調(diào)控作用.這些發(fā)現(xiàn)對(duì)納米生物界面相互作用研究及納米醫(yī)藥的構(gòu)建策略具有指導(dǎo)意義.

Fig.7 Normalized emission spectra(A) and generalized polarization GP340 value(B) of lipid vesicles mixed with different molar ratios of DOPC and DPPC lipids

3 結(jié) 論

通過表面增強(qiáng)紅外光譜和激光共聚焦顯微鏡研究了氧化石墨烯與不同相態(tài)磷脂膜的相互作用,發(fā)現(xiàn)氧化石墨烯對(duì)磷脂的抽提作用受磷脂膜相行為的調(diào)控.相比于凝膠相磷脂膜,流動(dòng)相磷脂膜的頭部基團(tuán)與氧化石墨烯間適度的吸引力以及較疏松的烷基鏈促使氧化石墨烯容易插入磷脂膜內(nèi)部,并從膜中抽提磷脂分子.更重要的是,氧化石墨烯抽提流動(dòng)相磷脂的能力受到膜中凝膠相磷脂對(duì)流動(dòng)相磷脂凝膠化程度的影響.當(dāng)凝膠/流動(dòng)相共存的磷脂膜中僅存在一小部分凝膠相磷脂時(shí),流動(dòng)相磷脂可以被氧化石墨烯抽提; 當(dāng)進(jìn)一步增加膜中凝膠相磷脂的量時(shí),由于流動(dòng)相磷脂凝膠化程度顯著增加,導(dǎo)致流動(dòng)相磷脂無法被抽提.因此,磷脂分子的相態(tài)對(duì)氧化石墨烯抽提磷脂膜中磷脂的行為具有重要影響,且這種影響屬于一種調(diào)控行為.該發(fā)現(xiàn)有助于理解生物膜的內(nèi)在性質(zhì),并促進(jìn)氧化石墨烯在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的安全應(yīng)用.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20190645.