幽門螺旋桿菌相關胃病不同中醫(yī)證候患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1的表達及臨床意義*

張靈利，何艷杰，李 紅

1.遼寧省朝陽市中心醫(yī)院（朝陽120000）；2.遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院消化內科（沈陽110032）

幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，HP）被世界衛(wèi)生組織列為一類致癌病原體［1］。在祖國傳統(tǒng)醫(yī)學中，認為HP是一種“邪氣”，侵入機體后會導致機體出現(xiàn)脾胃濕熱、肝胃不和等中醫(yī)證候，而中醫(yī)證候可動態(tài)反應疾病微觀變化［2］。HP 屬于“痞滿”、“胃脘痛”范疇，病因多為飲食不節(jié)，病機為脾胃升降失調、血瘀氣阻等，而血淤氣阻、郁熱等病理變化可促進HP 附著、繁殖，為疾病發(fā)生提供客觀條件?；|金屬蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP-2）屬于MMPs家族，具有降解細胞外基質作用，參與炎癥反應及腫瘤發(fā)生，同時具有修復、重塑細胞膜及細胞外基質作用［3］?；|金屬蛋白酶抑制物-1（Tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1）是MMPs抑制劑，對MMP-2表達水平及活性起到抑制作用［4］。本研究旨在通過觀察HP相關胃病不同中醫(yī)證候患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1的表達情況，初步分析兩者表達臨床意義，為不同中醫(yī)證候發(fā)病機制提供一定參考價值。

資料和方法

1 一般資料 選取本院2018年10月至2019年10月期間收治的HP 相關胃病患者58 例為研究對象，根據中醫(yī)證候不同分為脾胃濕熱證組、脾胃不和證組和肝胃不和證組。脾胃濕熱證組23 例，其中男性10例，女性13例；年齡29～58歲，平均年齡（42.08±8.64）歲；胃炎17例，胃潰瘍5例；病程4～31年，平均（17.53±6.75）年。脾胃不和證組18例，其中男性8例，女性10 例；年齡30～60 歲，平均年齡（42.78±8.70）歲；胃炎14例，胃潰瘍4例；病程3～32年，平均（17.61±6.88）年。肝胃不和證組17例，其中男性7例，女性10 例；年齡28～60 歲，平均年齡（42.51±8.76）歲；胃炎14例，胃潰瘍3例；病程4～33年，平均（17.72±6.94）年。各疾病組性別、年齡、病種及病程比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。另選取同期來本院體檢的健康志愿者20例作為對照組，其中男性8例，女性12例；年齡27～60歲，平均年齡（41.72±7.13）歲。對照組與各疾病組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準同意。病例納入標準：符合《中國慢性胃炎共識意見》［5］中慢性胃炎相關診斷標準或符合消化性潰瘍相關診斷標準［6］；年齡范圍在18～60歲之間；中醫(yī)辨證診斷為脾胃濕熱證、脾胃不和證或肝胃不和證；所有患者對本研究充分知情，并自愿簽署病人知情同意書。排除標準：合并嚴重心腦血管系統(tǒng)、肝腎系統(tǒng)等內科疾病者；年齡超出18～60歲范圍者；近期接受抗生素、抑酸藥、質子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、非甾體類抗炎藥等相關治療；妊娠期和哺乳期女性；具有心理疾病史、精神疾病史者；依從性較差，不配合研究者。

2 研究方法

2.1 胃黏膜標本獲取：所有受試者均采用GIFXQ260型電子胃鏡進行檢查，并鉗取胃大彎、胃小彎側（胃竇距幽門約2 cm 處）2塊胃黏膜組織，面積約為0.1 cm2，分別進行HP快速尿素酶檢測和美籃染色法檢測。HP感染檢測，即快速尿素酶檢測：取出胃黏膜組織塊后，迅速將其放入檢測試劑中，觀察試劑顏色變化，若試劑由黃色變?yōu)榧t色，提示為HP 陽性，若試劑顏色不變，提示為HP 陰性?？焖倌蛩孛笝z測試劑盒購自上海撫生實業(yè)有限公司。美藍染色法檢測：取出胃黏膜組織塊后，將其浸于4%多聚甲醛中進行固定，常規(guī)脫水后進行石蠟包埋，并切片，切片厚度約為4 μm。切片常規(guī)脫蠟至水，滴加1%美藍溶液，染色5～10 min，采用自來水將染料清洗干凈，常規(guī)脫水、二甲苯透明，自后采用中性樹膠封片，在鏡下觀察染色情況，若觀察到藍色彎曲桿菌，提示為HP陽性。本研究快速尿素酶檢測和美藍染色法檢測均提示HP陽性者視作HP陽性，否則為HP陰性。

2.2 胃黏膜炎癥狀態(tài)檢測：采用HE染色法觀察胃黏膜炎癥狀態(tài)。具體步驟如下：獲取的胃黏膜組織塊浸于4%的多聚甲醛中進行固定，然后常規(guī)脫水、透明石蠟包埋，并切片，二甲苯及梯度酒精脫蠟至水，蘇木素溶液染色15 min 左右，鹽酸乙醇分化30 s，伊紅溶液染色1～2 min，采用自來水將染料清洗干凈，再經常規(guī)脫水、透明后，采用中性樹膠封片，在鏡下觀察胃黏膜炎癥狀態(tài)。胃黏膜炎癥程度分為輕度、中度及重度，每個切片均由2名病理科醫(yī)師獨立進行診斷，當診斷結果不一致時，共同探討得出最終診斷結果。

2.3 胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達水平檢測：采用免疫組化SP 法檢測胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達水平。具體步驟如下：同HE染色制作切片，常規(guī)脫蠟至水，采用3%H2O2處理10 min使內源性過氧化物酶失活，沖洗3次后，采用置于0.01 M 枸櫞酸緩沖液中加熱（95℃）處理20 min進行抗原修復，待冷卻，采用羊血清工作液于室溫下進行封閉，滴加一抗，4℃孵育12 h，沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1 h，沖洗3次，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶，室溫下孵育1 h。DAB 顯色5-8 min，自來水充分沖洗以終止反應，蘇木素復染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，在鏡下觀察染色情況，并采用圖像分析系統(tǒng)分析胃黏膜組織中MMP-2、TIMP-1 表達水平，以染色指數表示。鼠抗人MMP-2一抗和鼠抗人TIMP-1一抗均購自廈門研科生物技術有限公司。免疫組化試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司。

3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學推斷。計量數據服從正態(tài)分布，且方差齊，用平均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗。計數數據百分率（%）表示，多組比較采用卡方檢驗，多組間兩兩比較采用卡方分割法比較。等級數據用例數表示，多組間比較采用秩和檢驗，多組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗。相關性分析采用Spearman等級相關分析。檢驗水準α=0.05，均為雙側檢驗。

結 果

1 不同中醫(yī)證型患者HP檢出情況 不同中醫(yī)證型患者HP 感染率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 不同中醫(yī)證型患者HP檢出情況

2 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜炎癥反應程度 各組間胃黏膜炎癥反應程度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與對照組相比，脾胃濕熱證組、脾胃不和證組和肝胃不和證組胃黏膜炎癥反應程度均較為嚴重，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與肝胃不和證組相比，脾胃濕熱證組、脾胃不和證組胃黏膜炎癥反應程度均較輕，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

3 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達情況 各組間胃黏膜MMP-2表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），各組間胃黏膜TIMP-1表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），脾胃濕熱證組、脾胃不和證組和肝胃不和證組胃黏膜TIMP-1表達水平均高于對照組，脾胃不和證組和肝胃不和證組胃黏膜TIMP-1表達水平均高于脾胃濕熱證組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表2 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜炎癥反應程度（n）

表3 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達情況

表3 不同中醫(yī)證型患者胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達情況

注：與對照組比較，*P＜0.05；與脾胃濕熱證組比較，＃P＜0.05

組 別 n MMP-2 TIMP-1脾胃濕熱證組 23 1.93±0.56 1.62±0.51*脾胃不和證組 18 1.96±0.60 1.86±0.57*＃肝胃不和證組 17 1.94±0.58 1.82±0.55*＃對照組20 1.77±0.41 1.24±0.32

4 胃黏膜MMP-2、TIMP-1表達與HP 感染、胃黏膜炎癥反應程度關系分析 MMP-2 表達水平與HP感染無明顯相關性（r=-0.085，P＞0.05），與胃黏膜炎癥反應程度呈負相關（r=-0.201，P＜0.05）。TIMP-1表達水平與HP 感染呈正相關（r=0.182，P＜0.05），與胃黏膜炎癥反應程度呈正相關（r=0.268，P＜0.05）。

討 論

臨床常采用三聯(lián)療法或四聯(lián)療法對HP感染進行根治，但存在毒副作用大、易產生耐藥性、復發(fā)率較高等缺點，所以臨床醫(yī)師逐漸將研究重點轉向中醫(yī)辨證治療患有HP相關性胃病的患者［7-9］。

《胃脾論》中指出脾胃衰而百病生，《內經》中指出正氣存內、邪不可干，以上提示中醫(yī)理論體系的重要組成部分為脾胃學說，脾胃損傷為內在病因，邪氣等為外在病因，當機體正氣不足時，易導致邪氣入侵，從而引發(fā)疾病。HP相關性胃病在中醫(yī)學中屬于“痞滿”、“胃脘痛”范疇，病機主要是脾胃升降失調、氣機阻滯，本質為本虛標實，本虛指的脾虛，標實指的本虛基礎上形成的一系列病理變化（如血瘀、氣滯、濕阻等）［10］。HP在中醫(yī)學中將其歸屬于“邪氣”，可引起許多胃部疾病發(fā)生。人類體質有9種基本類型，即氣虛質、氣郁質、陽虛質、陰虛質、平和質、濕熱質、癖血質、痰濕質和特稟質。脾胃濕熱證主要表現(xiàn)為濕熱質，脾胃不和證、肝胃不和證主要表現(xiàn)為氣郁質［11］。有研究顯示，且HP感染與HP相關性胃病中醫(yī)證型存在一定關系，HP 相關性胃病中脾胃濕熱證為主要中醫(yī)證候型［12］。本研究結果顯示，脾胃濕熱證組HP 感染率高于脾胃不和證組、肝胃不和證組，但無明顯差異，可能與本研究納入病例數較少有關。

HP侵入機體后會損傷胃黏膜，引起不同程度炎癥反應，本研究結果顯示，不同證型組炎癥反應程度均強于對照組，且疾病組中肝胃不和證組炎癥反應程度最強，提示HP感染相關性胃疾病患者均表現(xiàn)出不同程度炎癥損傷，其中肝胃不和證患者表現(xiàn)最為明顯。分析原因，肝胃不和證患者情緒控制不佳，易動怒，從而導致氣機不暢，中焦氣機運行異常，肝氣犯胃，所以該類患者胃黏膜炎癥反應相對于脾胃濕熱證和脾胃不和證患者更為嚴重。

MMPs能將細胞外基質降解，TIMPs則可抑制MMPs活性，兩者相互制約，共同維持細胞外基質分泌與降解平衡［13-14］。MMPs和TIMPs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的研究較多，MMP-2作為MMPs的重要成員之一，活化后能破壞細胞基底膜，促進腫瘤細胞浸潤及轉移，而TIMP-1 可將此過程抑制。但關于MMP-2 和TIMP-1在HP相關胃部疾病中表達水平的研究相對較少。MMP-2不僅與腫瘤發(fā)生有關，在生理生長及病理損傷過程中還扮演者塑性和修復角色。蘇玲玲等［15］研究觀察到MMPs表達于腺體、固有膜及上皮細胞中，且胃部炎癥反應越嚴重，遷移至上皮細胞的MMPs表達水平越高，認為MMPs可能通過類似細胞遷移的作用對胃黏膜起到保護作用。TIMP-1 作為MMP-2的內源性抑制劑，當炎癥反應加劇時，TIMP-1水平明顯升高。生理狀態(tài)下，當胃部出現(xiàn)病理損傷時，MMP-2表達水平應明顯上調以發(fā)揮修復作用，TIMP-1蛋白則應相對表達水平較低，MMP-2／TIMP-1平衡向MMP-2偏移，從而改善胃黏膜損傷狀態(tài)。但本研究結果顯示，疾病組MMP-2表達水平有所升高，但無明顯差異，TIMP-1表達水平則明顯升高，提示MMP-2／TIMP-1平衡向TIMP-1偏移，從而促進HP 相關性胃病胃黏膜損傷加重，疾病進一步發(fā)展。為了進一步明確檢測MMP-2 和TIMP-2 表達的臨床意義，本研究經相關性分析，發(fā)現(xiàn)MMP-2與胃黏膜炎癥反應程度呈負相關，TIMP-1 與胃黏膜炎癥反應程度呈正相關，提示MMP-2水平越低、TIMP-1水平越高，胃黏膜炎癥反應越嚴重。

綜上所述，HP 相關胃病患者存在 MMP-2／TIMP-1失衡現(xiàn)象，MMP-2 具有胃黏膜保護作用，TIMP-2可抑制MMP-2活性，與HP感染及胃黏膜炎癥程度呈正相關，前者類似于中醫(yī)學中的“正氣”，后者類似于中醫(yī)學中的“邪氣”。而不同中醫(yī)證候MMP-2、TIMP-1表達水平略有差異，可能與不同中醫(yī)證候發(fā)病機制不同有關，本研究還需進一步擴大病例數進行研究。