利用iTRAQ技術和轉(zhuǎn)錄組篩選芍藥屬遠緣雜交不親和基因

賀丹,謝棟博,張佼蕊,何松林,李朝梅，鄭云冰,王政，劉藝平，栗燕,逯久幸

利用iTRAQ技術和轉(zhuǎn)錄組篩選芍藥屬遠緣雜交不親和基因

賀丹1,2,謝棟博1,張佼蕊1,何松林1,2,李朝梅1，鄭云冰1,王政1，劉藝平1，栗燕1,逯久幸1

（1河南農(nóng)業(yè)大學林學院，鄭州 450002；2河南科技學院園藝園林學院，河南新鄉(xiāng) 453003）

【目的】遠緣雜交育種是目前牡丹、芍藥品種改良和育種的主要方法，而遠緣雜交不親和一直是制約其快速發(fā)展的主要因素。本研究從牡丹、芍藥遠緣雜交授粉后不親和應答相關的柱頭差異蛋白與轉(zhuǎn)錄組方面深入研究，揭示牡丹、芍藥遠緣雜交不親和的分子機理，為雜交育種提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳陨炙帯塾衽越弧⑸炙帯塾衽c牡丹‘鳳丹白’雜交為供試材料，在授粉后24 h采取柱頭，分別進行同位素標記相對定量（iTRAQ）和轉(zhuǎn)錄組技術分析。對所獲得的蛋白和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，并對其中可能與遠緣雜交不親和相關的基因進行定量PCR驗證?！窘Y(jié)果】利用iTRAQ技術分析牡丹、芍藥遠緣雜交后柱頭中蛋白質(zhì)的表達差異，共鑒定到685個差異蛋白，富集到了188條通路，其中顯著富集的Pathway有18條。與不親和授粉相關代謝通路有RNA降解、鈣信號途徑、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase signaling pathway，MAPK）信號途徑、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)。在RNA降解代謝通路中，烯醇酶（Enolase）、熱休克蛋白DnaK（HSP70）及病菌抗原（GroEL）均表達下調(diào)。在鈣信號途徑中，鈣調(diào)蛋白（CALM）表達下調(diào)，腺苷酸轉(zhuǎn)運酶（adenine nucleotide translocase，ANT）表達量增加，表達上調(diào)。MAPK信號途徑中，乙二醛酶Ⅰ（GloI）表達下調(diào)。磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)中的鈣調(diào)蛋白（CALM）表達下調(diào)。隨機選取與差異蛋白相關的6個基因進行qRT-PCR驗證，結(jié)果顯示，6個基因的表達與蛋白質(zhì)水平趨勢相一致，均表達下調(diào)。通過轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得了52 998個有注釋信息的Unigene，占所有Unigene的40.37%。基于6組樣品的RPKM（Reads Per Kilobase per Million）值，共篩選到16 224個差異基因。其中上調(diào)基因13 361，下調(diào)基因2 863個。對差異基因進行pathway顯著富集分析，雜交與自交相比，不親和差異表達的基因主要富集在氧化磷酸化代謝、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、次級代謝產(chǎn)物等通路。與遠緣雜交不親和相關且發(fā)生顯著變化的基因有、（胼胝質(zhì)酶）和（squamosapromoter binding protein-like）表達上調(diào)，（ABC transporter family protein）表達下調(diào)?！窘Y(jié)論】在轉(zhuǎn)錄組和蛋白數(shù)據(jù)共注釋到6個蛋白、4個基因與植物不親和性密切相關，這些蛋白與基因可能在遠緣雜交不親和方面發(fā)揮著重要作用。

牡丹；芍藥；iTRAQ；轉(zhuǎn)錄組；遠緣雜交

0 引言

【研究意義】牡丹（）是芍藥科芍藥屬的落葉亞灌木，迄今已有1 600多年的栽培歷史，是我國的傳統(tǒng)名花，也是我國特有的名貴觀賞兼藥用植物[1]。芍藥科芍藥屬的牡丹與芍藥，被譽為“花王和花相”，具有很高的觀賞和生產(chǎn)價值。牡丹、芍藥的新品種培育工作一直是科研和生產(chǎn)的重要內(nèi)容。雜交育種作為傳統(tǒng)的育種方式，也是牡丹、芍藥的主要育種方法。利用雜交育種能夠培育出一些具有較高觀賞價值、抗寒、抗病等特點的新品種，而芍藥屬遠緣雜交在國內(nèi)的研究還處于初步階段[2-3]。通過一系列研究發(fā)現(xiàn)受精前障礙是牡丹、芍藥遠緣雜交育種過程中存在的嚴重問題。在雜交過程中，雖然少量花粉能在柱頭上萌發(fā)并穿過柱頭，但花粉管的伸長卻受到阻礙，并且在柱頭上產(chǎn)生了大量的胼胝質(zhì)，從而阻礙花粉管進入子房完成受精[4-5]。通過研究牡丹、芍藥遠緣雜交不親和性的機制，對克服遠緣雜交受精前障礙，實現(xiàn)牡丹、芍藥遠緣雜交具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學篩選相關基因能夠提高育種效率，克服常規(guī)育種中的困難[6-9]。同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術是2004年美國應用生物系統(tǒng)公司（ABI）推出的一種新的蛋白質(zhì)組學技術。其可靠的結(jié)果已經(jīng)廣泛應用在生命科學的多個領域，包括尋找功能蛋白，篩選生物標志物或特殊蛋白，研究抗逆機理等[10]。程云清等[11]以平歐雜交榛‘達維’的正常發(fā)育與敗育子房為材料，進行蛋白樣品技術分析，初步篩選獲得可能參與調(diào)控榛子子房敗育的候選蛋白37個。目前，有關iTRAQ技術應用于植物雜交不親和性的研究鮮少報道。Chalivendra等[12]采用iTRAQ技術研究番茄的種間生殖障礙，通過對蛋白質(zhì)組變化的分析發(fā)現(xiàn)花粉-柱頭互作中的蛋白包括S-RNases、HT-A蛋白、細胞壁疏松以及抗性響應相關蛋白。LI等[13]使用iTRAQ技術揭示了大米花粉-柱頭互作的蛋白機制，發(fā)現(xiàn)泛素化在授粉的信號轉(zhuǎn)導過程中具有重要作用。利用轉(zhuǎn)錄組技術可以挖掘重要的功能基因，揭示優(yōu)良性狀的分子機制，還可以研究不同器官、不同環(huán)境脅迫下基因表達的差異。轉(zhuǎn)錄組測序技術已被廣泛應用于蠟梅、油松、油桐等的研究中[14-16]。ZHOU等[17]對羊草成熟花柱、子房、葉片高通量測序，發(fā)現(xiàn)多達1 025個轉(zhuǎn)錄本在花柱中特異性表達，這些轉(zhuǎn)錄本集中在細胞間交流與信號傳導。【本研究切入點】目前，中外學者探討了一些植物育種中的不親和機理，但關于牡丹、芍藥遠緣雜交不親和機理的研究還很欠缺。本研究在前期芍藥屬遠緣雜交的基礎上，發(fā)現(xiàn)芍藥自交與芍藥屬遠緣雜交親和性存在顯著差異?！緮M解決的關鍵問題】以芍藥‘粉玉奴’自交、芍藥‘粉玉奴’與牡丹‘鳳丹白’雜交授粉后24 h的柱頭為供試材料，分別進行轉(zhuǎn)錄組和iTRAQ分析及后續(xù)分析，以期從中篩選出與雜交不親和性相關的基因及蛋白，揭示芍藥屬遠緣雜交不親和性分子機制，為芍藥遠緣雜交育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試母本芍藥品種‘粉玉奴’與父本牡丹品種‘鳳丹白’均引自山東菏澤，于2011年栽植于河南農(nóng)業(yè)大學苗圃基地，植株生長良好，可以正常開花結(jié)實。于2018年4月初采取‘鳳丹白’花粉，進行生活力測定后，儲存于4℃冰箱。4月中下旬進行雜交，自交組合為‘粉玉奴’ב粉玉奴’，雜交組合為‘粉玉奴’ב鳳丹白’。依據(jù)前期熒光顯微觀察確定雜交障礙發(fā)生的關鍵時間，授粉后24 h取自交與雜交的柱頭用液氮速凍并置于-80℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 iTRAQ標記

采用丙酮沉淀法提取自交與雜交組柱頭的蛋白質(zhì)。對提取后的蛋白樣品進行還原烷基化處理，用考馬斯亮蘭法測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE檢測后將樣品取等量蛋白Trypsin酶解，用iTRAQ 113、114標記未經(jīng)授粉的柱頭中的蛋白，iTRAQ 115、116標記雜交授粉后柱頭中的蛋白，TRAQ 117、118標記自交授粉后柱頭中的蛋白，最后將標記好的樣品分別等量混合，應用強陽離子交換色譜（strong cation ex- change chromatography，cx）方法對混合后的肽段進行預分離，隨后再進行液相分離和質(zhì)譜分析。

1.3 轉(zhuǎn)錄組分析

采用天根生物公司多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取RNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，120 V電泳20 min。取1 μL RNA樣品，采用Thermo公司生產(chǎn)的Nano Drop ND-5000型紫外可見分光光度計測定樣品的A260/A230和A260/A280的比值及RNA濃度，進行RNA的濃度和質(zhì)量檢測。檢測符合建庫要求的RNA送至武漢華大進行文庫構(gòu)建，采用BGISEQ-500平臺進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

首先，計算各個重復樣品相對應蛋白質(zhì)定量值的中位數(shù)作為待比較樣品的定量值，并據(jù)此計算待比較樣品間蛋白的最終差異倍數(shù)。其次，利用待比較樣品間所有重復樣品每個蛋白質(zhì)的定量值進行T-檢驗，計算出-value，并利用Benjamini-Hochberg多重假設檢驗的方法校正值，得到校正后的值-value。最后根據(jù)差異倍數(shù)和-value來篩選出差異蛋白，當差異倍數(shù)達到1.5倍及以上（即up regulate≥1.5和down regulate≤0.67），且經(jīng)過顯著性統(tǒng)計檢驗其-value值≤0.05時，將其作為顯著差異蛋白。

使用DEGseq軟件對樣品間進行差異表達分析，條件為Fold Change≥2且Adjustedvalue≤0.001，將-value矯正為-value。為了提高DEGs的準確性，定義差異倍數(shù)為兩倍以上并且-value≤0.001的基因，篩選為顯著差異表達基因。

1.5 定量PCR驗證

使用TRIzol法對各樣品進行總RNA提取，用ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（東洋紡生物科技有限公司）進行cDNA的合成。以cDNA為模板，選擇作為內(nèi)參基因[18]，檢測引物為F：5′-TGAGCACCAAAGAAGTGGACGAAC-3′和R：5′-CACACGCCTGAACATCTCCTGAA-3′。使用SYBR Premix Ex TaqTMkit試劑盒（寶日醫(yī)生物技術有限公司）在ABI PRISM 7900HT Real-Time PCR System（美國應用生物系統(tǒng)中國公司）上進行qPCR檢測，每個樣品進行3次技術重復。20 μL反應體系包括10 μL SYBR?Premix，1 μL cDNA，正、反引物各取0.5 μL，ddH2O 8 μL。兩步法進行擴增，反應程序：預變性95℃，60 s；95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。反應結(jié)束后進行溶解曲線分析，按照2-△△CT法計算出基因的相對表達量。引物設計采用Primer 5，基因及檢測引物等相關信息詳見表1。

2 結(jié)果

2.1 iTRAQ分析得到的與雜交不親和相關蛋白代謝通路

通過對雜交不親和、自交親和授粉后的芍藥雌蕊柱頭差異蛋白進行Pathway富集分析，將 685個差異蛋白富集到188條通路，其中顯著富集的Pathway有18條。通過分析，鑒定到與不親和授粉相關的代謝通路有RNA降解（RNA degradation）、鈣信號途徑（Calcium signaling pathway）、促分裂原活化蛋白激酶信號途徑MAPK及磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)（Phosphatidylinositol signaling system）4個通路。4個通路中注釋到的差異蛋白共有28個（表2）。

表1 qRT-PCR驗證所選基因及對應引物信息

表2 遠緣雜交不親和相關的的差異蛋白通路

2.2 與遠緣雜交不親和相關的差異蛋白

在28個差異蛋白中，與不親和相關的差異蛋白有6個。在RNA降解代謝通路中，以親和授粉的雌蕊柱頭蛋白為對照，烯醇酶（Enolase）、熱休克蛋白DnaK（HSP70）及病菌抗原（GroEL）均表達下調(diào)。在鈣信號途徑中，鈣調(diào)蛋白（CALM）表達下調(diào)，鈣信號途徑受到影響。當植物處于逆境脅迫時腺苷酸轉(zhuǎn)運酶（ANT）表達量增加，表達上調(diào)。磷酸肌醇信號途徑通過參與細胞外鈣調(diào)素的信號轉(zhuǎn)導，從而調(diào)控花粉萌發(fā)和花粉管伸長的啟動。磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)中的鈣調(diào)蛋白（CALM）表達下調(diào)。MAPK信號途徑參與調(diào)控磷酸肌醇信號轉(zhuǎn)導、Ca2+信號途徑等，也參與了IAA/ABA的代謝信號途徑。乙二醛酶Ⅰ（GloI）是一種能夠提高植物抗性的蛋白，該途徑中的乙二醛酶Ⅰ（GloI）表達下調(diào)（表3）。

表3 與遠緣雜交不親和相關的差異蛋白

2.3 轉(zhuǎn)錄組分析得到的與授粉不親和相關的基因

2.3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的功能注釋 為了了解雜交親和性的基因表達情況，將測序的Unigene進行功能注釋。通過選擇BLAST參數(shù)E-value不大于1e-5和HMMER參數(shù)E-value不大于1e-10，與7個公共數(shù)據(jù)庫比對后最終獲得52 998個有注釋信息的Unigene，占所有Unigene的40.37%。其中45 943條被注釋到Nr數(shù)據(jù)庫，35 181條被注釋到NT數(shù)據(jù)庫，33 186條被注釋到Swissprot數(shù)據(jù)庫，33 828條被注釋到Pfam數(shù)據(jù)庫，34 854條被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫，35 864條被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫，被注釋到GO數(shù)據(jù)庫的有24 594條。

2.3.2 差異基因分析 基于6組樣品的RPKM值，共篩選到16 224個差異基因。其中上調(diào)基因13 361，下調(diào)基因2 863個。通過KEGG Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達的基因涉及多種生物學途徑，將基因參與的KEGG代謝通路分為5大類：細胞過程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、代謝（Metabolism）、有機系統(tǒng)（Organismal Systems）。雜交柱頭與自交柱頭相比，不親和差異表達的基因主要富集在氧化磷酸化代謝、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、次級代謝產(chǎn)物等通路。

在KEGG分析中胼胝質(zhì)酶、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、植物激素信號轉(zhuǎn)導等途徑是植物花粉發(fā)育，受精的重要途徑[19-20]，結(jié)合相關研究，從以上顯著富集的差異表達基因集中篩選得到4個可能與雜交不親和相關的基因（表4）。CL268_All、Unigene36776_All和CL7449_All在不親和相對于親和基因中顯著表達上調(diào)。CL8637_All在不親和相對于親和基因中顯著表達下調(diào)。

表4 不親和相關的差異基因

2.3.3 相關差異基因的Blast比對分析 通過BLAST軟件將CL268_All編碼的氨基酸序列與其他物種對比篩選同源序列（圖1），發(fā)現(xiàn)該基因與葡萄（）（82.70%)、茶（）（82.42%）、栓皮櫟（）（81.76%）、核桃（）（81.21%）、桃（）（80.87%）的相似度較高。

通過BLAST軟件將Unigene36776_All編碼的氨基酸序列與其他物種對比篩選同源序列（圖2），發(fā)現(xiàn)該基因與茶（）（81.56%）、葡萄（）（80.69%）、櫻桃（）（80.53%）、桃（）（80.75%）、核桃（）（80.10%）的相似度較高。

通過BLAST軟件將CL8637_All編碼的氨基酸序列與其他物種對比篩選同源序列（圖3），發(fā)現(xiàn)該基因與哥倫比亞錦葵（）（82.66%）、橡膠樹（）（83.05%）、核桃（）（82.76%）、栓皮櫟（）（83.84%）、棗（）（82.95%）的相似度較高。

圖1 CL268_All與其同源基因編碼氨基酸序列的對比

通過BLAST軟件將CL7449_All編碼的氨基酸序列與其他物種對比篩選同源序列（圖4），發(fā)現(xiàn)該基因與光皮樺（）（73.74%）、榴蓮（）（76.78%）、麻風樹（）（73.74%）、核桃（）（74.78%）、胡楊（）（73.54%）的相似度較高。

2.4 差異表達蛋白相關基因的qRT-PCR驗證

為了驗證差異蛋白結(jié)果，隨機選取gi|327424468_1（烯醇酶）、gi|327436891_2（熱休克蛋白）、gi|327427673_4（熱休克蛋白）、gi|327426876_5（病菌抗原）、gi|327427197_1（鈣調(diào)蛋白）、gi|327433480_5（乙二醛酶Ⅰ）等差異蛋白對應的基因進行qRT-PCR驗證，結(jié)果如圖5。6個差異蛋白所對應基因在自交與雜交時期芍藥雌蕊柱頭中表達量和變化趨勢有顯著差異，表明這些基因在牡丹、芍藥雜交過程中的表達具有明顯的空間特異性。定量PCR結(jié)果與蛋白質(zhì)水平趨勢相一致，均呈現(xiàn)下調(diào)表達。

3 討論

遠緣雜交后芍藥柱頭中的差異蛋白及差異基因參與較多的通路中也包括RNA降解。在RNA降解代謝通路中，以親和授粉的雌蕊柱頭為對照，烯醇酶、熱休克蛋白、病菌抗原均下調(diào)表達，其中烯醇酶參與了花粉-柱頭相互作用。SHEORAN等[21]在油菜的研究中發(fā)現(xiàn)烯醇酶參與了花粉-柱頭相互作用，親和授粉后，烯醇酶在萌發(fā)的花粉中上調(diào)表達。陶璐與岳訓[22]在擬南芥花粉管與柱頭的互作研究中發(fā)現(xiàn)花粉管的延長觸發(fā)了柱頭組織中的糖酵解途徑，激活了糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為丙酮酸鹽，而丙酮酸鹽進一步代謝為被花粉管吸收的營養(yǎng)物質(zhì)。在丙酮酸鹽代謝的過程中，烯醇酶作為關鍵性的酶參與了丙酮酸鹽的轉(zhuǎn)化。因此，烯醇酶與花粉生長及授粉的親和性密切相關。熱休克蛋白是防御類蛋白質(zhì)，與其他分子物質(zhì)合作，穩(wěn)定先前存在的蛋白質(zhì)以抵抗聚集并介導細胞溶質(zhì)中以及細胞器內(nèi)新翻譯的多肽折疊，結(jié)合延伸的肽片段，具有損傷后應激誘導的作用[23]?；ǚ勖劝l(fā)穿過柱頭可以看作是一種外來物質(zhì)入侵植物的行為，會引發(fā)植物的防御系統(tǒng)，促進防御類蛋白的產(chǎn)生或者上調(diào)表達。而在本研究中，熱休克蛋白下調(diào)表達，其原因有待進一步研究。

圖3 CL8637_All與其同源基因編碼氨基酸序列的對比

圖4 CL7449_All與其同源基因編碼氨基酸序列的對比

圖5 JI445505、JI457928、JI448710、JI447913、JI448234和JI454517等6個基因的qRT-PCR驗證

花粉管極性生長受多種信號和代謝途徑調(diào)控，包括MAPK信號途徑、磷脂酰肌醇信號通路等[24]。磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)參與花粉萌發(fā)和花粉管伸長，磷酸肌醇途徑受到抑制之后，會擾亂花粉管頂端Ca2+濃度梯度的產(chǎn)生和維持，還導致胼胝質(zhì)在頂端的大量沉積[25]。本研究中，牡丹、芍藥不親和授粉后磷脂酰肌醇信號途徑中的鈣調(diào)蛋白下調(diào)表達，磷脂酰肌醇途徑受到了抑制，從而花粉萌發(fā)和花粉管伸長受到了限制。MAPK信號途徑中蛋白激酶活性降低抑制花粉管生長，反之則促進[26]。LI等[27]將不親和的花粉用MAPK抑制劑處理后，花粉恢復活性，驗證了MAPK介導花粉失活的假設。乙二醛酶系統(tǒng)存在于植物的葉、花等部位[28]，甲基乙二醛（MG）是高等植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的一種細胞毒素代謝物，而乙二醛酶Ⅰ（GloI）主要維持甲基乙二醛（MG）的動態(tài)平衡，清除過多的MG[28-29]。本研究中，MAPK信號途徑中的乙二醛酶Ⅰ（GloI）下調(diào)表達，可能導致MG過多，從而引起花粉的死亡。

腺苷酸轉(zhuǎn)運酶（adenine nucleotide translocator，ANT）作為ADP/ATP載體，催化ADP和ATP在線粒體內(nèi)膜上的交換，為生物機體提供能量[30]。當植物處于逆境脅迫時，ANT表達量減少，在本研究中腺苷酸轉(zhuǎn)運酶ANT表達下調(diào)可能是對花粉管穿入柱頭的抗逆表達。胼胝質(zhì)的合成與降解是一個嚴密的調(diào)控過程，受GSL酶的直接調(diào)控，與在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中涉及胼胝質(zhì)酶合成通路，參與葡聚糖催化合成路徑，并作為細胞膜的組成部分。其中在減數(shù)分裂后期發(fā)揮調(diào)控作用，不親和植株中由其催化合成的胼胝質(zhì)大量增多，最終導致植株育性降低；則主要參與胞間分子運動和抗逆反應[19]。

目前研究中發(fā)現(xiàn)S-Rnase介導自交不親和，S-Rnase由花柱進入花粉管產(chǎn)生細胞毒性阻礙花粉管生長。自我S-Rnase能降解花粉管內(nèi)RNA，導致蛋白質(zhì)合成受阻，引起花粉管發(fā)生細胞程序性死亡[31-32]。在蘋果中花柱S-Rnase與花粉MdABCF轉(zhuǎn)運蛋白的跨膜區(qū)Tran結(jié)合，以內(nèi)吞的方式進入膜內(nèi)，運輸至花粉管液泡中，積累到一定量后，被釋放進入花粉管胞質(zhì)引起花粉管生長停滯，最終引起自交不親和反應[33]。MdABCF能夠非選擇性的運送S-Rnase至花粉管內(nèi)。在植物大、小孢子發(fā)生以及雌、雄配子體發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。主要是與花粉囊發(fā)育及花藥開裂相關[20]。本研究中上調(diào)表達，而花粉囊發(fā)育及花藥開裂在本研究中均不存在問題，推測可能與花粉的進一步發(fā)育有關。

4 結(jié)論

本研究闡述了牡丹與芍藥雜交不親和性的分子機制，通過iTRAQ分析發(fā)現(xiàn)與遠緣雜交不親和性相關的代謝通路主要集中在RNA降解、MAPK信號途徑、鈣信號途徑、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)4個途徑。轉(zhuǎn)錄組的差異基因則主要是胼胝質(zhì)合成酶（家族）、及相關基因。

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Selected Related Genes about Incompatibility of Distant Hybridizationby iTRAQ Analysis and Transcriptome

HE Dan1,2, XIE DongBo1, ZHANG JiaoRui1, HE SongLin1,2, LI ChaoMei1, ZHENG YunBing1, WANG Zheng1, LIU YiPing1, LI Yan1, LU JiuXing1

(1College of Forestry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2Colleg of Horticulture Landscape Architecture, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453000, Henan)

【Objective】Distant hybrid breeding is the main method of cultivar improvement and breeding in tree peony and herbaceous peony, while cross-incompatibility is an important restriction for breeding rapid development. Based on the previous researches, the analysis on different protein of stigma in pollen-stigma interaction and transcriptome was further explored. The mechanism of cross-incompatibility between tree peony and herbaceous peony was revealed, so as to provide the theoretical support for hybridized breeding.【Method】The stigmas of combinations‘Fenyunu’ בFenyunu’ and‘Fenyunu’ בFengdanbai’ were harvested at 24 h after pollination, which were used as materials for isobaric tags and analysis for relative and absolute quantitation (iTRAQ) and transcriptome, respectively. Bioinformatics was analyzed on the data of protein and transcriptome. Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) technique was used to validate the expression data of selected differentially expressed genes (DEGs). 【Result】iTRAQ was used to analyze DEPs of stigma of distant hybrid between tree peony and herbaceous peony, and the result showed that 685 DEPs were belonged to 188 pathways, in which 18 pathways were significantly enriched. There were four pathways with obvious difference in protein, including RNA degradation, mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, calcium signaling pathway, and phosphatidylinositol signaling system. In RNA degradation pathway, enolase, DnaK (HSP70), and GroEL (HSP60) were all down-regulated. In calcium signaling pathway, calmodulin (CALM) was down-regulated, while adenine nucleotide translocase (ANT) was up-regulated. In MAPK signaling pathway, Glyoxalase (GloI) was down-regulated. In phosphatidylinositol signaling system, CALM was also down-regulated. 6 genes were selected randomly to confirmed their expression by qRT- PCR, and the result showed that the expression profiles of the selected genes was in agreement with the results from protein analysis, and they were all down-regulated. A total of 52 998 annotated Unigenes were obtained by transcriptome sequencing, accounting for 40.37% of all Unigenes. Based on the RPKM (Reads Per Kilobase per Million) of six samples, 16 224 DEGs were obtained, among which13 61 were up-regulated, and 2 863 were down-regulated. Based on pathway enrichment analysis of DEGs, it indicated that the level of enrichment of DEGs in “Oxidative phosphorylation”, “ABC transporters” and “Biosynthesis of secondary metabolites” pathways were more significant and reliable than that of selfing. The genes related with incompatibility of distant hybridization were(Callose enzyme), and, which were up regulating expression, butthat was down regulating expression. 【Conclusion】In the data of transcriptome and protein, 6 proteins and 4 genes were closely related to incompatibility of distant hybridization. These proteins and genes might play an important role in incompatibility of distant hybridization.

;; iTRAQ; transcriptome; distant hybridization

2019-08-12；

2019-10-10

國家自然科學基金（31600568，31870698）、河南農(nóng)業(yè)大學科技創(chuàng)新基金（KJCX2015A03，KJCX2018A05）、河南省科技攻關項目（192102110062，202102110234）、河南省高等學校重點科研項目（19A220003）

賀丹，E-mail：dandan990111@163.com。通信作者何松林，E-mail：hsl213@yeah.net

（責任編輯 趙伶俐）