槐米中蘆丁的提取工藝優(yōu)化及檢識

張 依 周澤純 全錦秋 蒙蘭花

1.廣州醫(yī)科大學藥學院，廣東廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，廣東廣州 511436

槐米為豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾，始載于《日華子本草》，《神農(nóng)本草經(jīng)》中將其列為上品，現(xiàn)列在國家衛(wèi)生部第一批藥食同源名單中，有凉血止血，清肝瀉火等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明槐米具有保護血管[2-3]，改善糖尿病[4]，抑制人鼻咽癌細胞CNE1 增殖并誘導(dǎo)其凋亡[5]，抑菌抗氧化[6-7]和抑制黑色素生成[8-9]等作用。中國是槐米的原產(chǎn)地，世界上98%的槐米來自中國[10]。槐米中富含蘆丁和槲皮素等黃酮類成分，其中主要活性成分為蘆丁。醫(yī)藥工業(yè)中常以槐米為主要原料提取蘆丁，銷往日本，東南亞和歐美等國家和地區(qū)[11-12]。綜上，中藥槐米及其活性成分蘆丁具有較高的藥用、食用、保健保養(yǎng)和研究價值。

蘆丁為黃酮苷，分子中具有較多酚羥基，顯弱酸性，易溶于堿液，酸化后又能游離析出。槐米中提取蘆丁常用的方法有回流提取法，堿提取酸沉淀法，超聲提取法，水煎煮法[13-16]等，回流提取法和水煎煮法簡單方便，成本低，但蘆丁的提取率低；超聲提取法操作簡便，作為輔助方法在中藥提取方面有廣泛應(yīng)用[17]。本研究探討了從槐米中提取蘆丁的提取方法，在此基礎(chǔ)上考察了堿液的pH值、料液比和靜置時間等因素對蘆丁提取率的影響，優(yōu)化了槐米中蘆丁的提取工藝，并對自提的蘆丁進行了紫外（UV）檢識和高效液相色譜（HPLC）檢識。旨在為今后深入開發(fā)和利用槐米資源提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器及試劑

1.1 儀器

TLE303E電子天平、FE20實驗室PH計[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SYU-7-200T超聲波儀、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水多用真空泵、DHG-208B烘箱（鄭州生元儀器有限公司）；UV1900紫外分光光度計、LC-20A HPLC高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 試劑

甲醇（Merck，色譜純）；冰乙酸（西亞試劑，色譜純）其他試劑均為分析純。

蘆丁標準品（廣州市齊云生物科技有限公司，批號：181027，純度＞98%）。

槐米（產(chǎn)地：河北；茂名市東亞藥業(yè)飲片有限公司）由廣州醫(yī)科大學生藥學教研室鑒定。用高速多功能粉碎機粉碎，過100目篩，置棕色廣口瓶中，于4℃冰箱保存待用。

2 蘆丁的提取條件優(yōu)選

2.1 提取方法對蘆丁提取率的影響

平行稱取四份槐米粉末各20g于1000mL燒杯中，各加入400mL沸水溶解，邊攪拌邊小心加入飽和石灰水調(diào)節(jié)pH至9，分別以超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min；超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min，提取2次；電熱套加熱回流（130℃，微沸）30min，超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min；電熱套加熱回流（130℃，微沸）60min四種方法提取蘆丁，趁熱抽濾，取濾液加濃HCL調(diào)節(jié)pH至3，靜置24h后抽濾，取濾渣，60℃烘干，得蘆丁粗提取物。每種方法平行操作3次，計算平均提取率。

表1 提取方法對蘆丁提取率的影響（n=3）

結(jié)果見表1，單純超聲提取時，提取次數(shù)對蘆丁的提取率增加并無提高。相同時間內(nèi)，單純超聲提取或單純加熱回流提取時，超聲提取時槐米中蘆丁的提取率略高于加熱回流提取時的提取率，但兩種方式的提取率均不高。在以上提取方式的基礎(chǔ)上，與先加熱回流30min，再超聲輔助提取30min的提取方式相比，后者提取率有較大的提高。綜上，在堿提酸沉的基礎(chǔ)上，選用先電熱套加熱回流（130℃，微沸）30min，再超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min的方法時蘆丁的提取率最高。其原理是利用超聲波震動所產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)、湍流效應(yīng)、界面效應(yīng)和熱效應(yīng)等物理作用，提高中藥槐米細胞的通透性，加速槐米細胞壁破裂，使溶劑滲透到槐米的細胞內(nèi)或使槐米細胞內(nèi)的化學成分擴散到細胞外[17-18]，從而加速有效成分的溶出。加熱回流法和超聲輔助提取技術(shù)兩者相結(jié)合，能明顯縮短提取時間，有利于槐米中的蘆丁快速且高效提出。

2.2 堿液pH值對蘆丁提取率的影響

平行稱取五份槐米粉末各20g于1000mL燒杯中，各加入400mL沸水溶解，邊攪拌邊小心加入飽和石灰水分別調(diào)節(jié)pH至7、8、9、10、11。采用加熱回流30min，再超聲輔助提取30min的方法提取蘆丁，趁熱抽濾，取濾液加濃 HCL調(diào)節(jié)pH至3，靜置24h后抽濾，取濾渣，60℃烘干，得蘆丁粗提取物。每種條件樣品平行3份，計算平均提取率。

圖1 pH值對蘆丁提取率的影響

圖1結(jié)果表明，同樣條件下，控制堿液pH在7或11附近，蘆丁的提取率很低；弱堿狀態(tài)下，蘆丁提取率隨著控制堿液pH升高而大幅提高；至pH為8時，蘆丁的提取率達到最高，隨后緩慢下降。弱堿條件下槐米溶液中的果膠、黏液質(zhì)等水溶性成分易生成鈣鹽沉淀，適當濃度的堿液對槐米中蘆丁有增溶作用。綜上，選擇控制堿液pH為8有助于提高蘆丁的提取率。

2.3 料液比對蘆丁提取率的影響

平行稱取五份槐米粉末各20g于1000mL燒杯中，分別加入100、200、300、400、500mL不同料液比的沸水溶解，邊攪拌邊小心加入飽和石灰水調(diào)節(jié)pH至8。采用加熱回流30min，再超聲輔助提取30min的方法提取蘆丁，趁熱抽濾，取濾液加濃 HCL調(diào)節(jié)pH至3，靜置24h后抽濾，取濾渣，60℃烘干，得蘆丁粗提取物。每種條件樣品平行3份，計算平均提取率。

圖2結(jié)果表明，蘆丁提取率隨著料液比的增加而增加，在料液比為1∶20（g/mL）時達到最大提取率，隨后緩慢下降。因此，選取20g槐米粉末樣品加入400mL沸水進行提取，即料液比為1∶20（g/mL）時為最優(yōu)條件。

圖2 料液比對蘆丁提取率的影響

2.4 靜置時間對蘆丁提取率的影響

平行稱取五份槐米粉末各20g于1000mL燒杯中，各加入400mL沸水溶解，邊攪拌邊小心加入飽和石灰水調(diào)節(jié)pH至8。采用加熱回流30min，再超聲輔助提取30min的方法提取蘆丁，趁熱抽濾，取濾液加濃HCL調(diào)節(jié)pH至3，分別靜置3、6、12、18、24h后抽濾，取濾渣，60℃烘干，得蘆丁粗提取物。每種條件樣品平行3份，計算平均提取率。

圖3 靜置時間對蘆丁提取率的影響

圖3結(jié)果表明，堿提酸沉后抽濾得到的蘆丁粗提取物，在靜置3～6h內(nèi)提取率緩慢增加，隨著靜置時間的增長，蘆丁提取產(chǎn)率不斷提高，到24h，即靜置過夜時，達到最高。中藥槐米經(jīng)堿提酸沉后，需要經(jīng)一定的時間，讓蘆丁充分沉淀析出。

3 蘆丁的檢識

3.1 蘆丁的紫外（UV）檢識

取蘆丁對照品甲醇溶液和自提蘆丁甲醇溶液，用紫外分光光度計在200～600nm的波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果如圖4。兩者紫外吸收光譜特征一致，均在峰帶Ⅰ（300～400nm）和峰帶Ⅱ（220～280nm）范圍內(nèi)有特征吸收，這是因為黃酮類化合物存在桂皮?；氨郊柞；M成的共軛體系，其甲醇溶液在峰帶Ⅰ和峰帶Ⅱ范圍存在特征吸收。因此，從中藥槐米中提取的為蘆丁粗提物。

圖4 蘆丁對照品和自提蘆丁的紫外吸收光譜疊加圖

3.2 蘆丁的HPLC檢識

色譜條件：色譜柱為GL Sciences，InertSustain C18（250×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇：水（含0.1%醋酸）=60∶40；流速：1mL/min；柱溫：室溫；進樣量：20μL；檢測波長：254nm；分析時間：8min。

取空白甲醇溶液、蘆丁對照品溶液和自提蘆丁樣品溶液在上述色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結(jié)果見圖5，蘆丁對照品溶液和自提蘆丁樣品溶液在同一保留時間出峰，且空白甲醇溶液無干擾，該方法專屬性好，自提蘆丁較純。

圖5 空白甲醇、蘆丁對照品、自提蘆丁樣品的HPLC分離色譜圖

4 討論

本研究利用蘆丁易溶于堿液，在酸液中又會沉淀析出的特性，用堿提酸沉法對槐米中的蘆丁進行提取。實驗得出：先電熱套加熱回流（130℃，微沸）30min，再超聲輔助（70℃，40kHz，200W）提取30min為最優(yōu)提取方法。在此基礎(chǔ)上，堿液溶解時pH值為8，料液比為1∶20（g/mL），經(jīng)酸沉淀后靜置時間為24h，為最優(yōu)提取工藝。并用UV法和HPLC法對自提的蘆丁進行了檢識，結(jié)果表明自提的蘆丁較純。加熱回流法和超聲輔助提取技術(shù)相結(jié)合，能有效縮短中藥槐米中蘆丁的提取時間，增加提取率。綜上，優(yōu)化提取工藝后槐米中蘆丁的提取率有明顯提高，該工藝操作簡便，儀器簡單，綠色環(huán)保，為進一步合理開發(fā)利用中藥槐米資源和工業(yè)化大生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。