蠟狀芽孢桿菌協(xié)同李氏禾根系分泌物去除水體Cr6+的效應(yīng)及機(jī)制

林華，林志毅，滿(mǎn)向甜，Kong-CHHUON，劉杰，俞果*

1. 桂林理工大學(xué)/廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；2. 桂林理工大學(xué)巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 桂林 541004；3. 柬埔寨理工學(xué)院，柬埔寨 金邊 120000

根系分泌物是植物生長(zhǎng)過(guò)程中分泌并釋放到根際環(huán)境中的有機(jī)化合物的總稱(chēng)，目前已知的根系分泌物種類(lèi)有200種左右，包括氨基酸、有機(jī)酸、酶、可溶性糖等（Boeuf-Tremblay et al.，1994；Baetz et al.，2014）。這些根系分泌物是植物與土壤環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)和能量交換的載體，對(duì)根際土壤的理化性質(zhì)有重要的影響（Haichar et al.，2014；Bertin et al.，2003）。近年來(lái)，隨著高效液相色譜、氣相色譜等分析技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用，世界各國(guó)科研人員在環(huán)境污染防治、土壤學(xué)等領(lǐng)域?qū)Ω捣置谖镩_(kāi)展了廣泛的研究。研究表明，根系分泌物可以改善土壤質(zhì)量、提高植物抗性，在土壤修復(fù)尤其是在土壤重金屬污染的植物修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的作用。王艷紅等（2008）發(fā)現(xiàn)鋅（Zn）超富集植物東南景天（Sedum alfrediiHance）的根系分泌物能活化土壤中難溶態(tài)的 ZnO、ZnCO3等。盧豪良等（2007）發(fā)現(xiàn)秋茄（Kandelia candelL.）的根系分泌物能有效提高沉積物中重金屬（Cu、Pb、Cd、Zn）的生物有效性。

鉻（Cr）是一種危害性大的環(huán)境污染物，其對(duì)生物體具有明顯的致癌和致畸作用，因此鉻污染被世界各國(guó)列為重點(diǎn)防治對(duì)象（Miretzky et al.，2010；Wise et al.，2014）。李氏禾（Leersia hexandraSwartz）是中國(guó)首次發(fā)現(xiàn)和唯一報(bào)道的濕生鉻超富集植物，對(duì)Cr6+具有很強(qiáng)的吸收和富集能力，在鉻污染水體的植物修復(fù)方面表現(xiàn)出巨大的潛力（Zhang et al.，2007）。近幾年來(lái)，關(guān)于李氏禾超富集鉻的研究取得了不少進(jìn)展，但是還有一些問(wèn)題仍需深入研究：如李氏禾如何通過(guò)根系分泌作用適應(yīng)鉻脅迫，其根系分泌物與根際微生物的協(xié)同作用等（Liu et al.，2009；Liu et al.，2011；Zhang et al.，2009）。伍嬋翠等（2016）發(fā)現(xiàn)李氏禾根系分泌物對(duì)土壤中難溶性鉻具有較強(qiáng)的活化作用。我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，李氏禾根際存在較高豐度的蠟狀芽孢桿菌，而蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種耐高濃度鉻脅迫的微生物，這意味著在李氏禾耐受和富集Cr6+的過(guò)程中蠟狀芽孢桿菌可能起到了重要的作用。

本研究在水培條件下，研究添加外源蠟狀芽孢桿菌與李氏禾的根系分泌物共同凈化水體Cr6+的影響，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）研究Cr6+脅迫和添加外源蠟狀芽孢桿菌對(duì)李氏禾根系分泌物組成成分的影響，以明確根系分泌物在李氏禾還原Cr6+過(guò)程中的作用，進(jìn)一步豐富李氏禾超富集鉻的生理機(jī)制，為提高李氏禾修復(fù)Cr6+污染水體效率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試?yán)钍虾滩勺杂趶V西桂林市雁山鎮(zhèn)周邊未受重金屬污染的田埂間，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物菌種保藏中心（菌種編號(hào)CCTCCAB2011085），菌株接種于液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)12 h后，4000 r·min-1離心10 min，棄上清液，離心后的菌體添加適量無(wú)菌水調(diào)節(jié)菌體濃度為108cfu·mL-1的菌懸浮液備用。

1.2 植物的預(yù)培養(yǎng)

選取生長(zhǎng)一致的李氏禾幼苗，用去離子水洗凈，分別栽入含有1.5 L體積分?jǐn)?shù)為50%的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的塑料盆中，塑料盆容積為 2 L，在人工氣候室中預(yù)培養(yǎng)7 d，每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。人工氣候室培養(yǎng)條件設(shè)置：光照16 h，溫度25 ℃，光照強(qiáng)度7000 Lx，相對(duì)濕度75%。

1.3 根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌相互作用對(duì) Cr6+還原實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根系分泌物成分不變，取預(yù)培養(yǎng)中李氏禾的原水培液100 mL，置于250 mL錐形瓶中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，向每一組的錐形瓶中添加適量Cr6+（K2Cr2O7）溶液使初始質(zhì)量濃度為 10 mg·L-1。以不添加蠟狀芽孢桿菌和李氏禾根系分泌物作為空白組，另外四組實(shí)驗(yàn)處理分別添加：活菌、根系分泌物、根系分泌物+活菌、根系分泌物+滅活菌。實(shí)驗(yàn)使用的活菌為 1.1中制備的 108cfu·mL-1蠟狀芽胞桿菌懸浮液；滅活菌采用擴(kuò)大培養(yǎng)后的蠟狀芽胞桿菌經(jīng)高壓蒸汽120 ℃，滅活20 min；將錐形瓶放入恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 30 ℃、160 rmp，每隔2 h對(duì)錐形瓶中溶液進(jìn)行取樣，測(cè)定溶液中Cr6+含量，測(cè)試方法為二苯碳酰二肼分光光度法（賴(lài)永忠，2019）。對(duì)于含有蠟狀芽胞桿菌的3個(gè)處理組（活菌、根系分泌物+活菌、根系分泌物+滅活菌），同時(shí)測(cè)細(xì)菌溶液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度，利用細(xì)菌的吸光值來(lái)反應(yīng)細(xì)菌菌體細(xì)胞密度，從而了解細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.4 根系分泌物的收集實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析測(cè)定方法

取預(yù)培養(yǎng)好之后生長(zhǎng)一致的李氏禾幼苗，用去離子水反復(fù)清洗，分別移植20—30株李氏禾到備好的塑料盆中，塑料盆中的李氏禾設(shè)置3組處理：（1）用質(zhì)量濃度10 mg·L-1Cr6+（K2Cr2O7）溶液脅迫李氏禾；（2）在 10 mg·L-1Cr6+（K2Cr2O7）鉻脅迫下向培養(yǎng)液加入一定量 108cfu·mL-1的蠟狀芽孢桿菌懸浮液；（3）只用去離子水培養(yǎng)李氏禾作為對(duì)照組（即培養(yǎng)的李氏禾不加鉻）。使用通氣泵每天給李氏禾的培養(yǎng)液中通氣3 h（早中晚各1 h），培養(yǎng)10 d后收集李氏禾根系分泌物，操作如下：將培養(yǎng)10 d的李氏禾取出并用去離子水反復(fù)沖洗，在新制備的超純水中加入 3滴體積分?jǐn)?shù) 0.05%的百里酚溶液，浸泡李氏禾根部 5 min。然后將李氏禾放入 0.5 mmol·L-1的CaCl2溶液中，放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，之后收集含有根系分泌物的溶液，過(guò)0.45 μm濾膜，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40 ℃，90 r·min-1）濃縮至20 mL冷凍干燥，用去離子水定容至2 mL，轉(zhuǎn)移至GC進(jìn)樣小瓶，在4 ℃冰箱冷藏，供GC-MS分析。

GC測(cè)試條件：美國(guó) PerkinElmer氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Claus 680 GC；600T MS）；Elite-5ms（30 m×0.25 mm，0.25 μm）色譜柱；色譜柱升溫程序：初始溫度50 ℃，保持3 min，以6 ℃·min-1升溫至250 ℃并保持15 min；進(jìn)樣口溫度；載氣：純度為99.999%的氦氣，載氣流速1 mL·min-1；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量l μL。

MS分析條件：EI離子源，電離電壓70 eV；質(zhì)譜掃描方式：全掃描，掃描范圍為50—800 amu；離子源溫度200 ℃；接口溫度25 ℃；檢測(cè)電壓1 kv；溶劑延遲時(shí)間3 min。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本研究采用Excel 2010、Origin 8.5和SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌聯(lián)合作用下凈化水中Cr6+的效果

圖1 不同外源條件對(duì)水中Cr6+還原率的影響Fig. 1 Effect of different exogenous conditions on the reduction rate of Cr6+ in the water

圖2 根系分泌物對(duì)蠟狀芽胞桿菌生長(zhǎng)量的影響Fig. 2 Effect of root exudates on the growth of Bacillus cereus

由圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，溶液中Cr6+的還原率也逐漸升高，最終趨于穩(wěn)定。對(duì)比空白組，李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌活菌聯(lián)合作用對(duì)Cr6+的還原效果最為明顯（P＜0.05），在第10小時(shí)還原率達(dá)到75%，在24 h時(shí)還原率高達(dá)99%。李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌滅活菌聯(lián)合作用下，前8 h溶液中Cr6+的還原率穩(wěn)定在20%作用，在第 8小時(shí)時(shí) Cr6+還原率增加到 60%，并在第22小時(shí)趨于穩(wěn)定，達(dá)到88%。蠟狀芽孢桿菌活菌單獨(dú)作用對(duì)溶液中 Cr6+的還原作用明顯低于前兩組（P＜0.05），還原率在第 22小時(shí)時(shí)達(dá)到 58%并趨于穩(wěn)定。李氏禾根系分泌物處理組中Cr6+的還原率穩(wěn)定在23%左右，顯著高于空白組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入適量濃度的蠟狀芽孢桿菌菌液，與李氏禾根系分泌物共同作用，使溶液中Cr6+的還原率明顯增加。此外，高溫蒸汽滅活可能不能完全殺死菌液中的蠟狀芽孢桿菌，導(dǎo)致李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌滅活菌聯(lián)合處理組經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后對(duì)Cr6+還原率也基本達(dá)到了李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌活菌聯(lián)合處理組的水平。李氏禾根系分泌物能為蠟狀芽孢桿菌提供必要的營(yíng)養(yǎng)條件，增強(qiáng)其代謝能力，促進(jìn)了蠟狀芽孢桿菌對(duì)水體中的Cr6+的還原，可以通過(guò)對(duì)根系分泌物對(duì)的成分分析進(jìn)一步驗(yàn)證。前人研究表明，蠟狀芽孢桿菌不但能夠依靠自身的胞外分泌物還原Cr6+，其細(xì)胞壁也可以還原Cr6+，并固定在自身表面（Chen et al.，2012）。同時(shí)，植物根系分泌物中的烯烴、酸、醇、酚、醛也能夠還原Cr6+（林琦等，2003）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，充分發(fā)揮李氏禾根系分泌物與蠟狀芽孢桿菌還原Cr6+的協(xié)同效應(yīng)，是提高 Cr6+污染水體植物修復(fù)效率的關(guān)鍵。

由圖2可知，前4 h蠟狀芽孢桿菌的光密度值都呈線(xiàn)性增長(zhǎng)，添加李氏禾根系分泌物溶液中的蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)情況良好，光密度值穩(wěn)定在1.5左右，顯著高于單獨(dú)蠟狀芽孢桿菌處理組（P＜0.05），說(shuō)明添加李氏禾根系分泌物對(duì)于蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。添加李氏禾根系分泌物溶液的蠟狀芽孢桿菌滅活菌處理組光密度值同樣不斷增長(zhǎng)，且在第 16小時(shí)超過(guò)其他處理組，最終穩(wěn)定在2.0左右。這進(jìn)一步說(shuō)明蠟狀芽孢桿菌在高溫高壓蒸汽的過(guò)程中并未完全失活。研究表明，根系分泌物中的氨基酸、烷烴等物質(zhì)能為微生物提供重要的碳源、能源物質(zhì)，使植物根際的微生物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)非根際，同時(shí)微生物又能促進(jìn)根系的分泌作用（羅繼鵬等，2018；吳林坤等，2014）。

2.2 李氏禾根系分泌物 GC-MS掃描圖譜及結(jié)果分析

本文列出了在無(wú)鉻、10 mg·L-1Cr6+脅迫、10 mg·L-1Cr6+脅迫條件下接種蠟狀芽孢桿菌李氏禾根系分泌物的GC-MS掃描圖譜。圖3—5結(jié)果顯示，李氏禾根系分泌物樣品檢測(cè)出的圖譜特征峰比較顯著，分布較密集，基線(xiàn)漂移不大，故檢測(cè)結(jié)果比較可信。3種處理下掃描圖譜差異明顯，接種蠟狀芽孢桿菌后李氏禾根系分泌物的特征峰明顯少于前兩種未接種情況下的根系分泌物特征峰。

圖3 無(wú)鉻條件下李氏禾根系分泌物GC-MS掃描圖譜Fig. 3 GC-MS scanning map of root exudates of Leersia hexandra Swartz without Cr stress

圖4 10 mg·L-1 Cr6+脅迫下李氏禾根系分泌物GC-MS掃描圖譜Fig. 4 GC-MS scanning map of root exudates of Leersia hexandra Swartz with 10 mg·L-1 Cr6+ stress

圖5 接種蠟狀芽孢桿菌后李氏禾根系分泌物GC-MS掃描圖譜Fig. 5 GC-MS scanning map of root exudates of Leersia hexandra Swartz inoculated with Bacillus cereus

通過(guò)人工分析質(zhì)譜圖并與 NIST107質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)核對(duì)分析，確定出3種處理?xiàng)l件下李氏禾根系分泌物的有機(jī)物質(zhì)及相對(duì)含量用以進(jìn)一步分析，見(jiàn)表1—3。

由表1和表2結(jié)果分析，無(wú)Cr6+處理和有Cr6+處理10 d后的根系分泌物分別檢測(cè)出41種、47種有機(jī)化合物，都包含烷烴、酯、烯烴、芳香烴、醇、醚、酰胺。其中相對(duì)含量超過(guò)5%的物質(zhì)有3種，分別是烷烴、芳香烴、酰胺。由表3分析，接種蠟狀芽孢桿菌處理10 d后的根系分泌物檢測(cè)出19種有機(jī)化合物，含烷烴、醇、酯、酚，相對(duì)含量超過(guò)5%的物質(zhì)有烷烴、酯、酚。未接種蠟狀芽孢桿菌的李氏禾根系分泌物主要成分是烷烴，芳香烴，酰胺類(lèi)物質(zhì)，且Cr6+脅迫下根系分泌物的種類(lèi)顯著增加并分泌出大量的化感物質(zhì)。未接種蠟狀芽孢桿菌的李氏禾根系分泌物種類(lèi)未見(jiàn)減少，也沒(méi)有特別限制某一類(lèi)化合物的分泌，表明李氏禾對(duì)Cr6+具有很強(qiáng)的耐受能力。而接種了蠟狀芽孢桿菌的李氏禾，根系分泌物有機(jī)化合物數(shù)量的減少，說(shuō)明蠟狀芽孢桿菌將根系分泌物作為生長(zhǎng)代謝底物而分解掉，為自身的繁殖生長(zhǎng)提供碳源等物質(zhì)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)油菜幼苗根系分泌物成分主要包含烴、醇、酯等且烴類(lèi)化合物相對(duì)含量最高（張紅等，2014）。吳蕾等（2009）研究大豆、小麥、玉米、高粱的根系分泌物，發(fā)現(xiàn)其成分包括烷烴、酸、醇、酯、苯、酰胺、酮、醛、酚以及其他物質(zhì)，與本研究得出的主要根系分泌物種類(lèi)特征相似。

植物的根系分泌物成分主要受物種的基因控制，但是植物的生長(zhǎng)環(huán)境也是因素之一，所以根系分泌物的種類(lèi)和數(shù)量受植物自身生長(zhǎng)狀況和環(huán)境條件影響（羅曉蔓等，2019）。比如小麥在鎘脅迫下的一些次生代謝產(chǎn)物的根系分泌物具有明顯變化，小麥通過(guò)改變根系分泌物作用而緩解鎘危害（張玲等，2002），楊瑞吉等（2006）研究發(fā)現(xiàn)油菜在磷脅迫下根系分泌物包括烷烴、烯烴、苯、酸、醛、酯、酮、醚等有機(jī)化合物，且在磷脅迫下，油菜根系分泌物種類(lèi)增加，這都是植物通過(guò)調(diào)節(jié)根系分泌物的組成來(lái)改變根系狀態(tài)以適應(yīng)新的外界環(huán)境。此外，一些根系分泌物能對(duì)重金屬產(chǎn)生吸附、絡(luò)合作用，減輕重金屬生物毒性。由表1、2可見(jiàn)，李氏禾根系分泌物中酰胺類(lèi)物質(zhì)前后含量的變化可能是受到鉻脅迫后的一種根際解毒機(jī)制，為了證實(shí)這一點(diǎn)，我們還需要進(jìn)一步研究李氏禾在鉻脅迫下根細(xì)胞膜的受損程度，透性變化情況以及植物根際pH環(huán)境、Eh特征變化等。

表1 根系分泌物的鑒定（空白組）Table 1 Identification of root exudates (blank control group)

2.3 Cr6+脅迫下根系分泌物化感物質(zhì)分泌差異

從表2、表3鑒定出來(lái)有機(jī)物的相對(duì)含量分析，李氏禾根系分泌物主要包括烷烴、芳香烴、酰胺等物質(zhì)，其中不少有機(jī)化合物被報(bào)道是化感物質(zhì)（Sun et al.，2019；李楊瑞，1993）。在Cr6+脅迫下，李氏禾根系分泌物中都檢測(cè)到了有且僅有一種酚類(lèi)物質(zhì)：2, 4-二叔丁基苯酚。有學(xué)者認(rèn)為苯甲酸及其衍生物、水溶性有機(jī)酸、酚類(lèi)，及烷烴類(lèi)等化合物都屬于化感物質(zhì)，對(duì)植物具有化感作用，且相對(duì)含量高的物質(zhì)一般可能起主要的化感作用（Buer et al.，2010），而本文檢測(cè)出的2, 4-二叔丁基苯酚是一種已經(jīng)被證實(shí)具有化感效應(yīng)的有機(jī)化合物（張新慧等，2008）。黃翔杰等（2017）研究野菊根系分泌物中發(fā)現(xiàn)2, 4-二叔丁基苯酚對(duì)生菜、萵苣、油菜有明確的化感效應(yīng)，周寶利等（2010）發(fā)現(xiàn)對(duì)嫁接茄幼苗施加低濃度的2, 4-二叔丁基苯酚有明顯的促生長(zhǎng)作用，但是對(duì)茄子幼苗施加高濃度的2, 4-二叔丁基苯酚處理反而對(duì)生長(zhǎng)特性具有抑制作用（王玉潔等，2007）。

表2 根系分泌物的鑒定（有Cr6+）Table 2 Identification of root exudates (under Cr stress)

表3 根系分泌物的鑒定(有微生物)Table 3 Identification of root exudates (microorganism)

本文研究發(fā)現(xiàn)接種蠟狀芽孢桿菌與未接種相比，檢測(cè)出的2, 4-二叔丁基苯酚含量更高，相對(duì)含量從0.16%升高到6.07%。Li et al.（2019）在研究蠟狀芽孢桿菌 BCM2定殖番茄根系防疫根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)番茄根系分泌物中的2, 4-二叔丁基苯酚顯著增加，與本研究結(jié)果一致。李氏禾根系分泌物2, 4-二叔丁基苯酚相對(duì)含量的變化是超富集植物李氏禾對(duì)重金屬逆環(huán)境刺激的一種潛在響應(yīng)機(jī)制。

3 結(jié)論

（1）李氏禾根系分泌物和蠟狀芽孢桿菌相互作用對(duì)水體中Cr6+的還原率高達(dá)99%，遠(yuǎn)大于李氏禾根系分泌物或者蠟狀芽孢桿菌單獨(dú)處理組，表明接種蠟狀芽孢桿菌是提高李氏禾修復(fù)鉻污染水體效率的一種有效方法。

（2）李氏禾根系分泌物種類(lèi)繁多，成分復(fù)雜，包含烷烴、酯、烯烴、芳香烴、醇、酰胺，其中以烷烴、芳香烴、酰胺為主。向李氏禾接種蠟狀芽孢桿菌后，大部分李氏禾根系分泌物中的化感物質(zhì)被分解掉，降低了化感物質(zhì)對(duì)植物的毒害作用。

（3）李氏禾在受到Cr6+脅迫后，酰胺類(lèi)物質(zhì)的含量變化可能是植物為適應(yīng)重金屬鉻環(huán)境變化的一種解毒機(jī)制；李氏禾根系分泌物中的化感物質(zhì)2,4-二叔丁基苯酚是李氏禾對(duì)鉻脅迫的一種潛在的生理響應(yīng)機(jī)制。