秸稈類型及配比變化對污泥厭氧消化中微生物群落的影響

唐濤濤，李江，2，楊愛江，2，楊釗，向福亮，袁華宇

（1貴州大學資源與環(huán)境工程學院，貴州貴陽550025；2貴州大學環(huán)境工程規(guī)劃設計研究所，貴州貴陽550025）

污泥和秸稈作為城市和農(nóng)業(yè)固體廢棄物，其產(chǎn)量在2016 年和2017 年已達到9.84×108噸和4.328×107噸（含水率80%計）[1-2]。其中，玉米、小麥和水稻秸稈作為主要的農(nóng)作物秸稈，所占總產(chǎn)量的比例高達83.51%[1]。厭氧消化作為一種高效的生物質(zhì)能源轉化技術，不僅可將污泥和秸稈中的有機物轉化為沼氣，而且產(chǎn)生的沼液和沼渣也可作為肥料回用于農(nóng)田，減少化肥使用量。但由于單一厭氧消化存在諸多缺點，如占地面積大、沼氣產(chǎn)量低等[3]，因此厭氧消化技術未能被大規(guī)模應用于廢棄物的處理處置。將多種廢棄物混合進行聯(lián)合厭氧消化不僅能有效平衡營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)C/N、穩(wěn)定消化系統(tǒng)的pH，而且還能促進不同微生物的生長繁殖，從而提高厭氧消化效率[4-5]。其中，營養(yǎng)物質(zhì)與微生物群落結構對提高消化效率起重要作用[6]。

因此，本文基于16S rRNA 高通量測序技術分析秸稈（玉米、小麥和水稻）與污泥進行聯(lián)合厭氧消化過程中微生物群落結構的演替，揭示秸稈類型及配比變化對污泥厭氧消化體系中微生物群落結構的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 材料

實驗所用污泥采集于貴陽某污水處理廠[序批式活性污泥法（SBR）處理工藝]濃縮池新鮮污泥，在采集過程中利用粒徑為100目（0.15mm）的不銹鋼篩網(wǎng)進行過濾以去除污泥中的大顆粒物。實驗秸稈使用前用破碎機進行打碎，使秸稈粒徑小于10mm。污泥與秸稈的基本性質(zhì)如表1所示。

1.2 實驗方法

實驗分為10 組，每組各2 個7L 的厭氧消化反應器。反應器的有效容積為5L，采用機械攪拌，并利用溫度為(35±1)℃的恒溫流動水進行保溫和水封；攪拌軸與容器間也采用水封，確保密閉。首次向反應器中投入1/3的消化污泥作為接種污泥，之后按有效容積10%（500mL）投加，直至達到反應器有效容積；以后每天按有效容積5%（250mL）投加污泥，并排出等量消化污泥。在投加污泥過程中，向反應器中通入N2，保持反應器處于厭氧狀態(tài)。反應器的馴化時間為90 天，以確保各反應器處于穩(wěn)定狀態(tài)。隨后按VS污泥∶VS秸稈=1∶0（空白對照即污泥單一厭氧消化）、1∶0.5、1∶1、1∶1.5的配比向污泥中添加玉米秸稈（即每250mL 活性污泥加入2.16～10.80g 玉米秸稈）、小麥秸稈（即每250mL 活性污泥加入1.95～9.75g 小麥秸稈）和水稻秸稈（即每250mL 活性污泥加入1.83～9.12g水稻秸稈）；3 個實驗組分別標記為C1、C2 和C3，W1、W2 和W3，R1、R2 和R3。待反應器運行穩(wěn)定后，從反應器底部收集消化污泥用于分析微生物多樣性。

表1 污泥與秸稈基本性質(zhì)

1.3 理化指標的測試

1.4 微生物多樣性測試

微生物采用16S rRNA 進行測定，厭氧微生物菌群通過Illumina MiSeq平臺（Illumina，SanDiego，USA）進行分析。反應器運行穩(wěn)定后，向反應器中收集消化污泥用于DNA 的提?。∣MEGA-soil DNA Kit，Omega Bio-Tek，USA）；用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，細 菌）、524F_10_ext （TGYCAGCCGCCGCGGTAA） 和Arch958R（YCCGGCGTTGAVTCCAATT，古菌）進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增。隨后用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST（Promega，USA）進行檢測定量。最終根據(jù)Illumina MiSeq 平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE2×300的文庫。

1.5 微生物群落結構分析

實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2016 進行處理和分析。微生物數(shù)據(jù)利用上海美吉云平臺（www.i-sanger.com）進行檢查分析，篩選有效序列并將相似性≥97%的序列歸為同一分類操作單元（OTU），計算多樣性指數(shù)，并繪制韋恩圖（Venn）、微生物Circos圖、主成分分析圖（PCA）等。

2 結果與討論

2.1 秸稈類型及配比對消化污泥特性的影響

在收集消化污泥用于微生物群落結構分析前，需保證厭氧體系能穩(wěn)定運行。而衡量厭氧體系穩(wěn)定運行的一個關鍵因素是確保各項參數(shù)保持穩(wěn)定，包括pH、VFAs、- N、堿度（ALK）、VFAs/ALK比值等。由表2可見，秸稈類型及配比的變化雖會對污泥厭氧消化性能產(chǎn)生影響，但各實驗組的VFAs、ALK濃度及VFAs/ALK比值并未超過體系的穩(wěn) 定 運 行 范 圍（3000mg/L、 1000～5000mg/L、0.4）[7-9]。因此，秸稈的添加不僅不會破壞體系的穩(wěn)定性，而且還能極大地增加沼氣產(chǎn)量（表2），這與Chen 等[10]的研究結果相似。此外，秸稈的添加均會增加乙酸、丙酸和丁酸濃度，而戊酸濃度會降低。這是因為乙酸、丙酸和丁酸可直接通過碳水化合物和蛋白質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生，而戊酸主要是蛋白質(zhì)通過還原脫氨或Stickland反應產(chǎn)生[11]。以往的研究也表明，碳水化合物在厭氧環(huán)境下更容易發(fā)生水解[12-13]。而秸稈富含纖維素和半纖維素，質(zhì)量分數(shù)分別為25%～44.30%和30%～50%[14]。因此，秸稈中的纖維素和半纖維素容易在厭氧環(huán)境下水解形成糖類物質(zhì)，從而導致體系中乙酸、丙酸和丁酸濃度的增加。其中，玉米秸稈的添加對pH、VFAs和乙酸的影響較大；而小麥和水稻秸稈的添加對ALK的影響較大。Chen 等[10]研究也發(fā)現(xiàn)，當污泥與玉米、小麥和水稻秸稈進行聯(lián)合厭氧消化時，玉米秸稈的添加有利于VFAs 的累積；而小麥和水稻秸稈的添加有利于ALK的增加，這與本研究結果相似。但當配比增至1∶1.5 時，各實驗組中VFAs 和乙酸濃度均會大幅增加，特別是玉米秸稈。這是因為玉米秸稈添加量高于小麥和水稻秸稈，使得體系中可被生物降解物質(zhì)（如半纖維素和簡單的碳水化合物）的濃度增加，從而導致VFAs 濃度增加。以往的研究表明，累積沼氣產(chǎn)量能有效反應物質(zhì)的水解性能；即較高的累積沼氣產(chǎn)量表示物質(zhì)能更好的水解[15]。在本研究中，玉米秸稈的添加對累積沼氣產(chǎn)量的促進作用強于小麥和水稻秸稈；這表明玉米秸稈能更好的水解，并產(chǎn)生高濃度的VFAs。從而與體系中的- N 和ALK 發(fā)生中和反應，最終導致- N和ALK濃度降低。

2.2 微生物多樣性指數(shù)分析

細菌和古菌群落均以97%的相似性作為一個單元來劃分，進行OTU（operational taxonomic unit）聚類分析。Coverage 指數(shù)是指各樣品文庫的覆蓋率，若Coverage 指數(shù)越接近1，代表本次測序結果越接近樣本中微生物的實際情況。本研究中細菌的覆蓋率為98.79%～99.50%，古菌的覆蓋率為99.93%～99.99%（表3 和表4），這表明測序結果能良好的反應各實驗組中微生物群落結構的實際情況。

表3 和表4 為各實驗組中細菌和古菌多樣性指數(shù)的評估。ACE 和Chao 指數(shù)反映樣本中微生物群落的豐度，數(shù)值越大，表明菌群豐度越高。表3中ACE 和Chao 指數(shù)的增加表明秸稈的添加有利于微生物豐度的增加，但隨著配比的增加，微生物豐度并未進一步增加；特別是當污泥與玉米秸稈的配比為1∶1 時不僅沒有促進古菌豐度的增加，而且還導致體系中的古菌豐度降低。Shannon 和Simpson指數(shù)則反映樣品中微生物群落的多樣性。表3和表4中Shannon和Simpson指數(shù)的變化表明，秸稈類型和配比的變化使得污泥厭氧體系中的微生物多樣性發(fā)生不同程度的變化。其中，水稻秸稈對微生物多樣性的促進作用較強；這表明秸稈類型的變化是導致微生物多樣性發(fā)生變化的主要影響因素。而以往的研究也證實，共基質(zhì)特性的不同會導致微生物多樣性產(chǎn)生變化[16-17]。

表3 不同實驗組中細菌群落的豐度和多樣性

表4 不同實驗組中古菌群落的豐度和多樣性

Venn 圖可用于統(tǒng)計多組或多個樣本中所共有和獨有的物種（如OTU）數(shù)目，可以比較直觀的表現(xiàn)各樣本中物種（如OTU）的組成相似性及重疊情況，如圖1所示。由圖1(a1)～(a3)可見，與CK相比，同一類型秸稈與污泥在不同配比下各實驗組間重疊OTU 的數(shù)量分別為863、814 和918。結果表明，水稻實驗組中細菌的相似性高于玉米和小麥實驗組。圖1(a4)～(a6)為不同類型秸稈在不同配比各樣品的OTU 分布，在C2 實驗組中發(fā)現(xiàn)最高的獨有OTU 數(shù)，這表明當污泥與玉米秸稈配比為1∶1時會使體系產(chǎn)生較多的新型細菌群落。圖1(b)為各實驗組中古菌群落的OTU。由圖1(b1)～(b3)可見，與CK 相比，W1 實驗組中含有的獨有OTU 數(shù)高于其余實驗組。同時，由圖1(b4)～(b6)發(fā)現(xiàn)，W1 實驗組中獨有的OTU 數(shù)也高于其余實驗組，這表明污泥與小麥秸稈配比為1∶0.5時對古菌群落的影響較大。

圖1 OTU的Venn圖

2.3 微生物種群分析

圖2 細菌和古菌在門和屬水平下的分類

圖2為各樣品中細菌和古菌在門和屬水平下的Circos 圖。圖2(a)、(b)為不同實驗組中細菌和古菌在門水平下的分類，污泥-秸稈聯(lián)合厭氧消化實驗組中主要的細菌門分類為： 擬桿菌門（Bacteroidetes）（17.71%～34.56%）、 變 形 菌 門（Proteobacteria）（10.86%～19.81%）、綠 彎 菌 門（Chloroflexi） （5.86%～15.11%）、 厚 壁 菌 門（Firmicutes）（7.12%～24.02%）、陰溝單胞菌門（Cloacimonetes）（2.22%～14.82%）、降氨酸菌門（Aminicenantes）（0.77%～13.32%）、尚未明確的菌門 （WS6） （2.15%～7.35%） 、 放 線 菌 門（Actinobacteria）（2.81%～6.12%） 和 酸 桿 菌 門（Acidobacteria）（1.35%～5.28%）等，這與以往的研 究 結 果 相 似[10,18]。 其 中 ，Bacteroidetes、Proteobacteria、Chloroflexi和Firmicutes均為優(yōu)勢菌門； 這 是 因 為Bacteroidetes、Proteobacteria、Chloroflexi和Firmicutes對復雜的有機物具有水解和酸化能力，包括蛋白質(zhì)和碳水化合物[19-24]。在本研究中，隨著配比的增加，Bacteroidetes相對豐度逐漸增加，并取代Proteobacteria成為極優(yōu)勢菌門，且當配比為1∶1.5 時促進作用較強。Bacteroidetes作為厭氧消化器中的一種優(yōu)勢菌門，其對氨基酸、甘油、葡萄糖、脂質(zhì)、碳水化合物、纖維素和半纖維素及其他多糖物質(zhì)均具有一定的降解能力，并產(chǎn)生VFAs，如乙酸、丙酸、丁酸、琥珀酸、乳酸和長鏈脂肪酸[25-28]。因此，Bacteroidetes相對豐度的增加能提高乙酸、丙酸和VFAs濃度。與Bacteroidetes不同，秸稈的添加會抑制Proteobacteria的生長，且當配比為1∶1.5 時抑制作用較強。以往的研究表明，Proteobacteria在厭氧消化過程中會消耗乙酸、丙酸和丁酸[29]，故Proteobacteria相對豐度的降低有利于VFAs 的累積?？梢?，秸稈的添加可通過改變Bacteroidetes與Proteobacteria相對豐度實現(xiàn)體系中VFAs 濃度的增加。同時，秸稈的添加也能促進Synergistetes的生長；其相對豐度由0.15%（CK）分別增至0.65%～1.18%（玉米秸稈）、0.22%～0.39%（小麥秸稈）和0.47%～0.79%（水稻秸稈）。顯然， 玉米和水稻秸稈的添加更有利于Synergistetes的生長，且當配比為1∶1.5 時促進作用較強。Zou 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Synergistetes能促進VFAs 向乙酸轉變?？梢?，Synergistetes相對豐度的增加能促進體系中乙酸的產(chǎn)生；這與玉米和水稻實驗組中乙酸濃度高于小麥實驗組的結果相互印證。由圖2(b)可見，污泥-秸稈聯(lián)合厭氧消化實驗組中的古菌門分類為：Euryarchaeota（60.00%～79.09%）、WSA2（8.19%～26.81%）和Bathyarchaeota（7.58%～18.65%）。 其 中， 秸 稈 的 添 加 對Bathyarchaeota均具有顯著的促進作用（p＜0.001），且隨著秸稈添加量的增加而增加，相對豐度由0.16%（CK）增至10.74%～18.74%（玉米秸稈）、7.58%～10.69%（小麥秸稈）和12.30%～18.65%（水稻秸稈）?？梢?，玉米和水稻秸稈的添加對Bathyarchaeota的促進能力較強。

圖2(c)為各實驗組中細菌在屬水平上的分類。污泥-秸稈聯(lián)合厭氧消化實驗組中的優(yōu)勢細菌屬分類主要為未識別的_p_ 降氨酸菌門（norank_p_Aminicenantes）（0.78%～13.32%）、未分類的_p_陰溝單胞菌門（unclassified_p_Cloacimonetes）（2.22%～14.81%）、 未 識 別 的_c_ 擬 桿 菌 門_vadinHA17（norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17）（4.82%～11.02%）、norank_p_WS6 （2.15%～7.35%）和Christensenellaceae_R-7_group（2.33%～15.73%）。與CK 相比，秸稈的添加能促進unclassified_p_Cloacimonetes、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17和Christensenellaceae_R-7_group菌屬的生長，相對豐度分別由2.16%、3.76%和0.83%（CK）增至2.22%～14.81%、 4.82%～11.02% 和 2.33%～15.73%。 以 往 的 研 究 表 明， Cloacimonetes、Bacteroidetes 與Christensenellaceae（Firmicutes） 對纖維素具有一定的水解能力[31-33]。 因此，unclassified_p_Cloacimonetes、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17 和Christensenellaceae_R-7_group相 對 豐度的增加能促進秸稈中纖維素的水解。其中，當配比為1∶1.5 時，玉米、小麥和水稻秸稈的添加對Christensenellaceae_R-7_group均具有較強的促進作用，且在該配比下水稻秸稈的添加也更有利于unclassified_p_Cloacimonetes和norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17 的生長。與水稻秸稈不同，玉米秸稈的添加僅在配比為1∶0.5 和1∶1 時對norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17 和unclassified_p_Cloacimonetes具有較強的促進能力；而小麥秸稈在配比為1∶1時 對unclassified_p_Cloacimonetes和norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17 具有較強的促進能力。此外，秸稈的添加也能促進部分相對豐度較低的細菌菌 屬 生 長， 如norank_f_Porphyromonadaceae、unclassified_f_Ruminococcaceae和Bacteroides；相 對豐度分別由0.06%、0.26%和0.003% （CK）增至0.87%～7.52%、0.61%～1.74%和0.007%～1.40%。以往的研究表明，隸屬于Porphyromonadaceae的菌屬會產(chǎn)生丙酸[34-35]，這與各實驗組丙酸濃度增加的結果一致；Ruminococcaceae對纖維素具有降解能力[36]；而Bacteroides不僅對半纖維素具有較強的分解能力[37]，而且還能以纖維素或纖維二糖作為碳源，并對植物細胞壁中的多糖也具有水解能力[38]。與Christensenellaceae_R-7_group相似，當配比為1∶1.5時，玉米、小麥和水稻秸稈的添加對Bacteroides均具有較好的促進能力。而當配比為1∶0.5時，玉米秸稈的添加對norank_f_Porphyromonadaceae和unclassified_f_Ruminococcaceae具有較強的促進能力，但在配比方面，小麥秸稈的添加僅對norank_f_Porphyromonadaceae具有較強的促進能力。與玉米秸稈不同，小麥秸稈僅在配比為1∶1.5時對unclassified_f_Ruminococcaceae具有較強的促進能力；而水稻秸稈僅在配比為1∶1 時對norank_f_Porphyromonadaceae具有顯著的促進能力（p＜0.001）。由此可見，向污泥中添加秸稈能極大地促進體系中水解菌和酸化菌的生長，從而對產(chǎn)甲烷古菌的生長產(chǎn)生影響。

由圖2(d)可見，污泥-秸稈聯(lián)合厭氧消化體系中的優(yōu)勢古菌屬分類為：鬃毛甲烷桿菌屬（Methanosaeta）（32.01%～61.75%）、未識別的_p_深 古 菌 門（norank_p_Bathyarchaeota）（7.58%～18.74%）、（norank_c_WCHA1-57）（8.15%～26.80%）、（norank_f_ARC26）（3.30%～12.65%）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）（2.42%～7.47%）和甲烷瘤球菌屬（Methanomassiliicoccus）（2.28%～8.07%）。其中，norank_p_Bathyarchaeota、Methanomassiliicoccus及norank_f_ARC26 的相對豐度會增加（p＜0.001），分別由0.16%（CK）、1.00%（CK）和2.62%（CK）增至7.58%～18.74%、2.28%～8.07% 和3.30%～12.65%。其中，norank_p_Bathyarchaeota的變化趨勢與Bathyarchaeota一致；即當配比為1∶1.5 時，玉米、小麥和水稻秸稈的添加均能極大地促進norank_p_Bathyarchaeota的生長。同時，玉米和水稻秸稈在該配比下對Methanomassiliicoccus的生長也具有良好的促進能力。而與玉米和水稻秸稈不同， 小麥秸稈僅在配比為 1∶1 時對Methanomassiliicoccus具有較強的促進作用。He等[39]研究發(fā)現(xiàn)，屬于Bathyarchaeota的菌屬對難降解的大分子物質(zhì)具有一定的降解能力，如芳香族化合 物 、 纖 維 素 和 蛋 白 質(zhì) 。 可 見 ，norank_p_Bathyarchaeota相對豐度增加也能促進秸稈的降解。此外，本研究檢出的乙酸型產(chǎn)甲烷菌（Methanosaeta）相對豐度會降低（除C2、W3 和R3） ， 氫 型 產(chǎn) 甲 烷 菌Methanospirillum、Methanobacterium（除R2） 和Methanobrevibacter（除W1 和R2） 的 相 對 豐 度 也 會 降 低。 而Methanomassiliicoccus相對豐度會顯著增加（p＜0.001），這表明秸稈的添加可能會對污泥厭氧消化體系的產(chǎn)甲烷特征產(chǎn)生影響， 因為Methanomassiliicoccus為甲基型產(chǎn)甲烷菌，主要能利用甲醇（或甲胺）與氫氣作為電子供體產(chǎn)生甲烷[40-41]。顯然，向污泥中添加秸稈會對乙酸型產(chǎn)甲烷菌和氫型產(chǎn)甲烷菌的生長產(chǎn)生不同程度的抑制作用，但會顯著提高甲基型產(chǎn)甲烷菌的相對豐度。綜上所述，配比的變化會對體系中細菌群落產(chǎn)生較大的影響，從而改變微生物的生長環(huán)境，最終影響產(chǎn)甲烷菌的生長。而Mata-Alvarez 等[42]通過對聯(lián)合厭氧消化的研究也發(fā)現(xiàn)，細菌群落結構易受到原料比例的影響，而甲烷菌更易受到環(huán)境條件（如VFAs和- N濃度）的影響。由此可見，污泥與秸稈配比的變化是導致體系中微生物群落發(fā)生變化的主要影響因素。

2.4 污泥-秸稈聯(lián)合厭氧消化與物種關系分析

圖3 各樣本間的分布熱圖

圖3 為細菌和古菌在屬分類上的熱圖，圖3(a)為豐度前50的細菌分布特征。由圖3(a)可見，秸稈的添加會產(chǎn)生3 種新的細菌菌屬，未識別的_f_擬桿 菌 目_UCG-001 （norank_f_Bacteroidales_UCG-001） 、 丙 酸 桿 菌 屬 （Prolixibacter） 和（norank_f_possible_family_01）。其中，Prolixibacter相對豐度高于norank_f_Bacteroidales_UCG-001 和norank_f_possible_family_01，并隨秸稈添加量的增加而增加，其相對豐度可達到0.65%～3.99%。由于Prolixibacter對碳水化合物具有降解能力[43-44]；因此，Prolixibacter菌屬能促進秸稈的降解。此外，秸稈的添加也能促進Longilinea、Leptolinea、unclassified_f_Anaerolineaceae、norank_c_SJA-15 和norank_f_Synergistaceae的生長。其中，Longilinea和Leptolinea的相對豐度分別由0.017%和0.10%增至0.02%～3.39%和0.18%～1.32%。而以往的研究發(fā)現(xiàn)，Longilinea和Leptolinea對多糖具有良好的降解能力[45]；且Longilinea還能將糖轉化為有機酸和脂肪酸，并對難降解有機物具有降解能力[46]?？梢?，Longilinea相對豐度的大幅增加有利于秸稈水解產(chǎn)物的酸化，從而使體系的VFAs 濃度增加。與細菌的屬分類相似，秸稈的添加也會產(chǎn)生新的古菌菌屬norank_f_Thermoplasmatales_Incertae_Sedis，但僅在W3實驗組中檢出。顯然，秸稈的添加有利于微生物種類、多樣性水平和總體數(shù)量的增加，但也會對部分菌屬產(chǎn)生影響。圖4(a)和(b)為細菌和古菌在屬分類學上的主成分分析（PCA），結果進一步表明，秸稈類型與配比的變化均會對細菌和古菌屬分類產(chǎn)生較大的影響，其中配比的變化是主要的影響因素。

2.5 消化污泥中微生物群落RDA關聯(lián)分析

圖4 細菌和古菌在屬分類上的主成分分析

微生物的群落結構不僅受到生物因素的調(diào)控，也與非生物因素（如環(huán)境因子等） 的影響密不可分。從RDA分析圖（見圖5）中環(huán)境因子箭頭的連線長度及環(huán)境因子與微生物之間箭頭的夾角，可以看出環(huán)境因子與微生物群落之間的相關性。由于與樣本菌群組成相關的環(huán)境因子很多，因此在進行環(huán)境因子分析前，需對環(huán)境因子進行篩選，保留那些相互作用較小的環(huán)境因子。目前，常用的環(huán)境因子篩選方法為VIF （variance inflation factor，方差膨脹因子）。而且VIF 值越大，表明自變量間的多重共線性關系越嚴重；當VIF 值大于10 時被認定為無用的環(huán)境因子。如表5所示，經(jīng)篩選后的環(huán)境因子VIF值均低于10，這表明所選環(huán)境因子符合分析要求。由圖5(a)可見，pH、- N、乙酸和異丁酸對細菌群落的影響較大。 其中，unclassified_p_Cloacimonetes、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17、norank_f_Porphyromononadaceae與 乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸呈正相關關系。Christenseallaceae_R-7_group、Prolixibacter與pH、- N、乙酸、丙酸及丁酸呈正相關關系。由此可見，上述菌群不僅能促進秸稈的降解，而且還能增加乙酸、丙酸和丁酸濃度；這與各實驗組中菌屬相對豐度和乙酸、丙酸和丁酸濃度增加的結果一致。圖5(b)為環(huán)境因子與相對豐度前10的古菌菌屬的RDA 分析圖，與細菌群落不同，乙酸、丙酸、丁酸和異丁酸對產(chǎn)甲烷古菌群落的影響較大。Methanosaeta與- N、乙酸、丙酸和異丁酸呈正相關關系；Methanobrevibacter、Methanobacterium和Methanospirillum與pH 和丁酸呈正相關關系；Methanomassiliicoccus與- N、丁酸、丙酸和異丁酸呈正相關關系。結果表明，乙酸和異丁酸會對微生物群落結構產(chǎn)生較大的影響。

圖5 各樣本間的RDA分析

表5 環(huán)境因子的VIF值

3 結論

（1）秸稈類型及配比的變化會對污泥厭氧消化特性產(chǎn)生影響，但不會破壞體系的穩(wěn)定運行。其中，玉米秸稈對pH、VFAs和乙酸的影響較大；而小麥和水稻秸稈對堿度的影響較大。但當配比增至1∶1.5 時，各實驗組中VFAs 和乙酸濃度均會大幅增加，特別是玉米秸稈。

（2）秸稈類型及配比的變化會對厭氧體系中微生物種類、豐度和多樣性產(chǎn)生顯著影響，其中，配比的變化是導致微生物群落發(fā)生變化的主要影響因素。隨著秸稈的添加，部分水解菌和酸化菌的相對豐度會顯著提高（p＜0.001），從而促進秸稈的降解；如Bacteroidetes、Cloacimonetes、Bathyarchaeota、Synergistetes（ 門 水 平） 和unclassified_p_Cloacimonetes、norank_c_Bacteroidetes_vadinHA17、Christensenellaceae_R-7_group、norank_f_Porphyromonadaceae、unclassified_f_Ruminococcaceae、Bacteroides、Prolixibacter、Longilinea、Leptolinea、norank_p_Bathyarchaeota（屬水平）等。

（3）向污泥中添加秸稈雖然會對乙酸型產(chǎn)甲烷菌和氫型產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生不同程度的抑制作用，但會顯著促進甲基型產(chǎn)甲烷菌（Methanomassiliicoccus）的生長（p＜0.001）。

（4）RDA 分析表明，乙酸和異丁酸均會對細菌和古菌菌屬結構產(chǎn)生較大的影響。其中，pH、氨氮（- N）、乙酸和異丁酸對細菌群落的影響較大，而乙酸、丙酸、丁酸和異丁酸對產(chǎn)甲烷古菌群落的影響較大。