硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑微生物限度檢查方法的建立和驗(yàn)證

雷春華，王明巧，2，3，黃潔瑕，2，3，肖海文，2，3，李雪梅，林文輝，2△

（1.廣東同德藥業(yè)有限公司，廣東 湛江524018；2.國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心·藥用植物油研究＜湛江＞分中心，廣東 湛江524018；3.湛江市明德醫(yī)藥科技有限公司，廣東 湛江524018）

硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑為葛蘭素史克公司產(chǎn)品萬(wàn)托林（Ventolin）的仿制藥，臨床主要用于緩解哮喘或慢性阻塞性肺疾?。赡嫘詺獾雷枞膊。┗颊叩闹夤墀d攣，以及預(yù)防急性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的哮喘，或其他過(guò)敏原誘發(fā)的支氣管痙攣[1]。按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0111中吸入制劑要求，吸入制劑在生產(chǎn)和貯藏期間微生物限度應(yīng)符合要求。本研究中根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》（通則1105及通則1106）非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查方法，建立并驗(yàn)證其微生物限度檢查方法，對(duì)3批產(chǎn)品進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SWCJ-A型凈化工作臺(tái)（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）；YP5002型電子天平（上海佑科儀器有限公司）；BPH-9162型精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；LT-CPS80C型立式壓力蒸汽滅菌器（立德泰＜上海＞科學(xué)儀器公司）；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；HTY-601型集菌儀（杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備公司）。

1.2 材料

標(biāo)準(zhǔn)菌種：金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

培養(yǎng)基：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

試藥：硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑（廣東同德藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為20160201，20160202，20160301）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試液制備

需氧菌、霉菌和酵母菌：取60瓶供試品，置-20℃冰箱內(nèi)冷凍約1 h，取出，迅速消毒品開(kāi)啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆1個(gè)小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器吸出全部藥液，然后取供試品10 mL，加無(wú)菌pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，制成1∶10的供試液。用同一稀釋液將1∶10供試液同法稀釋成1∶20的供試液。

控制菌：取供試品10 mL，加無(wú)菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100 mL，搖勻，制成1∶10的供試液?；靹?，置20～25℃培養(yǎng)2 h。

2.1.2 菌液制備

需氧菌、霉菌和酵母菌：取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加人3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫。采用適宜方法吸出孢子懸液置無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。作為做活菌計(jì)數(shù)，備用。

控制菌：將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，取培養(yǎng)物1mL，用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液。

2.2 需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)算方法適用性試驗(yàn)

2.2.1 需氧菌[2-6]

試驗(yàn)組：取1∶20供試液9.9mL，加入不大于1000cfu銅綠假單胞菌菌液0.1 mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，使每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含銅綠假胞菌不大于100 cfu，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，取出濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，倒置30～35℃培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)試驗(yàn)組的菌落數(shù)。每株試驗(yàn)菌制備2張膜。按上述方法同法操作金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉。

菌液對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9mL，加入不大于1000cfu銅綠假單胞菌菌液0.1mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，使每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含銅綠假單胞菌不大于100 cfu，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，倒置30～35℃培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)菌液對(duì)照組的菌落數(shù)。每株試驗(yàn)菌制備2張膜。按上述方法同法操作金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉。

供試品對(duì)照組：取1∶20供試液9.9 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于胰酪大豆胨瓊脂平板上，倒置30～35℃培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)供試品的需氧菌總數(shù)。平行制備2張膜。

2.2.2 霉菌和酵母菌[2-6]

試驗(yàn)組：取1∶20供試液9.9mL，加入不大于1000cfu白色念珠菌菌液0.1 mL，混勻，置100 mL0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，使每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含白色念珠菌不大于100 cfu，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，倒置20～25℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)試驗(yàn)組的菌落數(shù)。每株試驗(yàn)菌制備2張膜。同法操作黑曲霉。

菌液對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，加入不大于1 000 cfu白色念珠菌菌液0.1 mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，使每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含白色念珠菌不大于100 cfu，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，倒置20～25℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)菌液對(duì)照組的菌落數(shù)。每株試驗(yàn)菌制備2張膜。同法操作黑曲霉。

供試品對(duì)照組：取1∶20供試液9.9 mL，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.1 mL，混勻，置100 mL 0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用0.9%氯化鈉溶液沖洗5次，每次沖洗100 mL，然后取出濾膜，菌面朝上，貼于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，倒置20～25℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)供試品的霉菌和酵母菌總數(shù)。平行制備2張膜。

2.2.3 回收率[7]

試驗(yàn)菌株的回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。3批樣品采用薄膜過(guò)濾法，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌落比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，結(jié)果表明，該方法可用于檢查本品的需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)。

2.3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)[3-6，8-11]

2.3.1 耐膽鹽革蘭陰性菌

試驗(yàn)組：取1∶10供試液10 mL置100 mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌菌液0.1 mL，取出濾膜，置100 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，在30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，依法檢查。

陽(yáng)性對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100 mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的大腸埃希菌和銅綠假單胞菌菌液0.1 mL，取出濾膜，置100 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48 h，同試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，取出濾膜，置100 mL腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48 h，同試驗(yàn)組操作。

2.3.2 大腸埃希菌

試驗(yàn)組：取1∶10供試液10 mL置100 mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的大腸埃希菌菌液0.1 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物1 mL置100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48 h，然后劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72 h，依法檢查。

陽(yáng)性對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100 mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的大腸埃希菌菌液0.1 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，在30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，同試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次沖洗100 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)24～48 h，同試驗(yàn)組操作。

2.3.3 銅綠假單胞菌

試驗(yàn)組：取1∶10的供試液10 mL置100 mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的銅綠假單胞菌液0.1 mL，過(guò)濾，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72h，依法檢查。

陽(yáng)性對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100 mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的銅綠假單胞菌菌液0.1 mL，然后取出濾膜置100 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，同試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，同試驗(yàn)組操作。

2.3.4 金黃色葡萄球菌

試驗(yàn)組：取1∶10供試液10 mL置100 mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu金黃色葡萄球菌液0.1 mL，取出濾膜置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72h，依法檢查。

陽(yáng)性對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10mL置100mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，在最后1次無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中加入不大于1 000 cfu的金黃色葡萄球菌液0.1mL，取出濾膜置100mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h，同試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組：取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 mL置100mL無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液中全量過(guò)濾，再用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗3次，每次100 mL，取出濾膜，置100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，同試驗(yàn)組操作。

2.3.5 控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2。上述方法相應(yīng)的試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組檢出耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)，表明硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑可用該方法檢查本品的耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌。

表2 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 供試品微生物限度檢查

采用薄膜過(guò)濾法，沖洗液為0.9%氯化鈉溶液；需氧菌、霉菌和酵母菌總數(shù)每張濾膜沖洗5次，每次100 mL；控制菌耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌每張濾膜沖洗3次，每次100 mL，依法測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑為吸入制劑，根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則1107中微生物限度檢查法的規(guī)定，硫酸沙丁胺醇吸入氣霧劑的需氧菌總數(shù)每1 mL不得超過(guò)102cfu，霉菌和酵母菌總數(shù)每1 mL不得超過(guò)10 cfu，耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌每1 mL不得檢出。