一株對羥基苯甲酸甲酯降解菌的生長及降解特性研究

李躍 李海普 楊兆光

摘 要：以具有內(nèi)分泌干擾性的對羥基苯甲酸甲酯（MeP）為目標(biāo)污染物，研究細(xì)菌1a51的生長曲線以及對水中MeP的降解。結(jié)果表明，菌株在R2A液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16小時(shí)后進(jìn)入對數(shù)生長期，60小時(shí)后進(jìn)入穩(wěn)定期，隨后進(jìn)入凋亡期;菌株的最適降解pH為7，最適降解溫度為35℃，隨著目標(biāo)污染物MeP濃度的提高，一定時(shí)間內(nèi)的降解率逐漸降低后達(dá)到穩(wěn)定，不同的金屬離子對降解影響不同，Cd2+對菌株降解MeP的抑制效果最明顯，Zn2+對降解幾乎沒影響，本研究結(jié)果可為防腐劑的微生物降解提供一定的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)分泌干擾性;對羥基苯甲酸甲酯;細(xì)菌;生長曲線;降解

Abstract：The growth curve of bacteria 1a51 and the degradation of methylparaben（MeP）which possessed endocrine disruption in water were studied.The results showed that the strain entered the logarithmic growth stage and stable stage after being cultured in R2A liquid medium for 16 h and 60 h，then entered the phase of apoptosis.The optimal pH and temperature of MeP being degraded by strain 1a51 were 7 and 35℃，respectively.With the concentration of MeP increasing，the degradation rate of MeP decreased and then achieved stable.The influence of different metal ions on the degradation of MeP was different.Cd2+had a significant inhibition effect while Zn2+had little effect.The research results could provide basis for the microbial degradation of preservatives.

Key words：Endocrine disruption;Methylparaben;Bacteria;Growth curve;Degradation

1 緒論

對羥基苯甲酸酯類（Parbens）是一類常見的防腐劑，被廣泛用于食品、藥品以及個人護(hù)理品行業(yè)[1，2]。Parbens是由對羥基苯甲酸和脂肪醇脫水縮合形成的一類酯類有機(jī)化合物，多為無色的結(jié)晶，具有良好的水溶性和一定范圍pH內(nèi)較高的穩(wěn)定性[3]，其中對羥基苯甲酸甲酯（MeP）是使用最廣泛的一種。

近年來，Parabens在人們的生活中使用日益廣泛，但是由于其在環(huán)境中的遷移最終對人類和其他生物造成的干擾危害而被美國環(huán)保署列為內(nèi)分泌干擾物[4]。有報(bào)道稱在人的乳腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)有Paraens的存在，因此推測乳腺癌與皮膚使用含Paraens的產(chǎn)品之間可能存在潛在的聯(lián)系。

目前對環(huán)境中Parabens的去除主要是在污水處理廠中，更多的是集中在物理化學(xué)方法上，比如：吸附、膜分離、高級氧化法等，雖然都各有優(yōu)點(diǎn)但是都存在著投資大，能耗高，操作困難，易產(chǎn)生二次污染等缺點(diǎn)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，微生物也被廣泛用來去除水體中存在的Parabens。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)MeP在好氧條件下易于生物降解，生物需氧量約為理論需氧量的90%[5]。目前也有關(guān)于對Parabens的降解菌株的報(bào)道，苗艷芳等從其汽酒廠廢水分離得到一株可以高效降解對羥基苯甲酸的菌株BJS3，在24h內(nèi)的降解率達(dá)到99.93%[6];張麗平等人從海底底泥中分離得到一株可將MeP降解為對羥基苯甲酸的棒狀菌株[2]。

本研究對從活性污泥中分離得到的MeP降解菌菌株的生長曲線和影響MeP降解的因素進(jìn)行了探究，以期對環(huán)境中防腐劑的微生物降解提供依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 主要試劑與儀器

2.1.1 主要試劑

對羥基苯甲酸甲酯（MeP，純度>99%）購自上海麥克林試劑公司;氫氧化鈉（NaOH，分析純）、鹽酸（HCl，分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;硝酸錳（Mn（NO3）2，50%）購自天津市光復(fù)科技有限公司，六水合硝酸鋅（Zn（NO3）2·6H2O，分析純）購自上海麥克林生化科技有限公司，硝酸銅（Cu（NO3）2，分析純）購自天津福晨化學(xué)試劑廠，硝酸鎳（Ni（NO3）2，分析純）購自廣東光華科技股份有限公司，六水合硝酸鈷（Co（NO3）2·6H2O，分析純）購自上海麥克林試劑有限公司，四水合硝酸鈷（Cd（NO3）2·4H2O，分析純）購自西隴科學(xué)股份有限公司。

2.1.2 主要儀器

恒溫氣浴振蕩器（THZ-82A，金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠），超凈工作臺（HCB-1300V，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-100G，上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），高效液相色譜（1260Infinity II，美國安捷倫科技有限公司），精密電子天平（Scout SE-SE202F，奧豪斯儀器（常州）有限公司），數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司），超純水機(jī)（UPT-Ⅱ-10T，四川優(yōu)普設(shè)備儀器有限公司），pH計(jì)（PHS-25，雷磁儀電科學(xué)儀器有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（TU-1901，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司），生化培養(yǎng)箱（SPX-150B-Z，上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

2.2 培養(yǎng)基及使用

2.2.1 R2A液體培養(yǎng)基及使用

培養(yǎng)基組分：胰蛋白胨0.25mg/L，酸水解酪蛋白0.5mg/L，酵母浸粉0.5mg/L，可溶性淀粉0.5mg/L，磷酸氫二鉀0.3mg/L，硫酸鎂0.1mg/L，丙酮酸鈉0.3mg/L，蛋白胨0.25mg/L，葡萄糖0.5mg/L。

使用：取本品3.2g，加熱溶解于1000ml蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘;冷卻后備用。

2.2.2 R2A固體培養(yǎng)基及使用

培養(yǎng)基組分：酵母浸出粉0.5mg/L，可溶性淀粉0.5mg/L，蛋白胨0.5mg/L，磷酸氫二甲0.3mg/L，酪蛋白水解物0.5mg/L，丙酮酸鈉0.3mg/L，葡萄糖0.5mg/L，無水硫酸鎂0.024mg/L，瓊脂15.0mg/L。

使用：取本品18.2g，加入1L純化水，加熱溶解，121℃高壓滅菌15分鐘，待溫度降至50℃左右時(shí)，按照需要將培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)皿，冷卻，封裝備用。

2.3 菌株的來源

實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)菌菌株為一株表皮葡萄球菌（從長沙市某污水處理廠好氧池所取的活性污泥分離而來），并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室馴化鑒定得到，具有MeP降解特性，并命名為1a51。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 菌株1a51在R2A液體培養(yǎng)基中生長曲線的測定

為了解細(xì)菌1a51在R2A液體培養(yǎng)基中的各個生長期，用比濁度法測定了不同培養(yǎng)時(shí)間下的菌液濃度。于超凈工作臺火焰旁接種，用接種環(huán)從R2A固體培養(yǎng)基邊緣取少量菌體，接種到含有100mL配置好待用的R2A液體培養(yǎng)基的錐形瓶里，置于28℃，160r/min的恒溫氣浴振蕩器中培養(yǎng)，隔段時(shí)間取一定體積的菌懸液，測定其在600nm波長下的吸光度（OD600），確定菌株生長的遲緩期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和凋亡期。

2.4.2 菌株1a51對MeP降解特性的測定

在不同的培養(yǎng)條件下（溫度、pH、底物濃度、金屬離子）探究細(xì)菌1a51對MeP的降解。研究表明，培養(yǎng)溫度、pH、額外碳源和底物濃度等條件被認(rèn)為是影響各種難降解化合物的細(xì)胞生長、酶活性和降解能力的主要因素[7];為確保細(xì)菌的生物量和生長速度，目標(biāo)物MeP在細(xì)菌的對數(shù)生長期（培養(yǎng)48h，OD600值為1.2左右）加入，繼續(xù)保持原來的條件培養(yǎng)，加入目標(biāo)物后定時(shí)（每隔1h）定量（每次取1mL）取樣測定MeP的濃度;每組實(shí)驗(yàn)平行設(shè)置3個，目標(biāo)物的加入和取樣均在超凈工作臺里完成。

MeP的定性與定量：本實(shí)驗(yàn)用HPLC-UV法測定培養(yǎng)體系溶液中MeP的濃度，具體方法如下：樣品取出后高速離心（10000r/min，10min），然后將上清液經(jīng)過0.45μm水相針式濾膜，用1.5ml進(jìn)樣瓶收集濾液，直接進(jìn)HPLC-UV儀器檢測。儀器條件如下：流動相為甲醇：水（比例為70%∶30%），流速為1.5mL/min，進(jìn)樣體積25μL，檢測波長254nm，以MeP的純品定性，用外標(biāo)法定量。

3 結(jié)果與討論

3.1 菌株1a51在R2A液體培養(yǎng)基中的生長曲線

以菌株1a51的培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，測定的OD600值為縱坐標(biāo)，繪制出菌株的生長曲線，如圖1。結(jié)果表明，菌株在培養(yǎng)16h后開始進(jìn)入對數(shù)生長期，60h左右進(jìn)入生長穩(wěn)定期并且時(shí)間較短，隨后開始進(jìn)入凋亡期。

3.2 菌株對MeP降解的影響因素研究

3.2.1 細(xì)菌1a51對不同濃度MeP的降解

在所用的液體培養(yǎng)基的量一定的前提下，污染物加入的量對菌株的降解有較大影響。為了考察在加入不同濃度的MeP培養(yǎng)基里，菌株對污染物的降解率，實(shí)驗(yàn)選了5種不同的污染物濃度，分別是2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L、10mg/L，考察加入污染物后的6h的降解率。

如圖2所示，隨著加入的污染物濃度的提高，MeP的降解率逐漸降低，說明當(dāng)濃度較低時(shí)，污染物的量是降解的決定性因素;當(dāng)濃度提高到8mg/L—10mg/L時(shí)，降解率穩(wěn)定在42%左右，說明當(dāng)加入的目標(biāo)物濃度較高時(shí)，菌株的生物量成為降解的決定性因素。

3.2.2 溫度對1a51降解MeP的影響

溫度通過影響菌株體內(nèi)和體表的各種酶的活性進(jìn)而影響細(xì)菌的生長和代謝，最終影響對目標(biāo)物的降解。本實(shí)驗(yàn)選擇4個不同的培養(yǎng)溫度（15℃、25℃、35℃、45℃）下，考察目標(biāo)物（初始濃度10mg/L，降解時(shí)間為6個小時(shí)）的降解;如圖3所示，在低溫（15℃）和高溫（45℃）時(shí)，菌株活性較小，降解率較低，在35℃時(shí)降解效率達(dá)到56%左右，因此本實(shí)驗(yàn)的最佳實(shí)驗(yàn)溫度設(shè)在35℃。

3.2.3 培養(yǎng)基pH對1a51降解MeP的影響

pH影響微生物的生長和代謝，因此幾乎影響了所有的微生物反應(yīng)過程。為探究菌株1a51對MeP降解的最佳pH，實(shí)驗(yàn)選取從酸性環(huán)境到堿性環(huán)境（pH=5—9）考察污染物（初始濃度10mg/L，降解時(shí)間為6個小時(shí)）的降解;如圖4所示，在pH在5，6和9時(shí)，MeP的降解效率僅有10%左右，在中性環(huán)境下（pH=7），1a51具有最高的降解率達(dá)到32%左右，因此菌株1a51對MeP降解的最適pH為7。

3.2.4 金屬離子對1a51降解MeP的影響

研究報(bào)道重金屬的介入對難降解有機(jī)物的生物降解可能有一定的抑制作用，但同時(shí)也有報(bào)道顯示重金屬對于有機(jī)物的微生物降解具有一定的促進(jìn)作用[8]。為探究重金屬離子對菌株1a51降解污染物MeP的影響，實(shí)驗(yàn)選擇了6種金屬陽離子在兩個不同的濃度（0.1mM和1mM）同樣的時(shí)間（為了使金屬離子充分混合溶解，延長降解時(shí)間至10個小時(shí)）里對MeP的降解率的影響。

如圖5可以看出，不同的金屬離子對降解的影響不同。與不加金屬離子的空白組（BK）對比可以看出，在金屬離子濃度為0.1mM時(shí)，各金屬離子對MeP的降解主要是抑制作用，大致順序?yàn)镹i2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Mn2+>Zn2+;而當(dāng)金屬離子濃度提高至1mM時(shí)，Mn2+和Cd2+的抑制效果更強(qiáng)，而Cu2+對MeP的降解有輕度的促進(jìn)作用，Co2+和Ni2+的抑制作用有所減弱，在實(shí)驗(yàn)濃度下，Zn2+對1a51降解MeP沒有明顯影響。

4 結(jié)論

本文以從污水處理廠的活性污泥里分離出來的具有降解對羥基苯甲酸甲酯（MeP）能力的單體微生物細(xì)菌1a51為研究對象，對菌株的生長曲線及對防腐劑MeP的降解影響因素進(jìn)行了探究。

結(jié)果表明：菌株1a51在R2A液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)16小時(shí)后開始進(jìn)入對數(shù)生長期，60小時(shí)左右進(jìn)入穩(wěn)定期，且穩(wěn)定期較短，隨即進(jìn)入凋亡期。在菌株的對數(shù)生長期加入目標(biāo)污染物MeP發(fā)現(xiàn)，隨著加入的污染物的濃度的增加，相同時(shí)間內(nèi)降解率逐漸降低，當(dāng)污染物濃度達(dá)到8mg/L時(shí)，降解率穩(wěn)定在42%左右;菌株降解MeP的最適溫度為35℃，最適pH為7，在中性環(huán)境菌株活性較高。不同的金屬離子對MeP的降解影響不同，對污染物的降解抑制作用最強(qiáng)的的Cd2+，Zn2+對污染物的降解幾乎沒有影響。

對羥基苯甲酸甲酯（MeP）作為一種典型的防腐劑，具有一定的內(nèi)分泌干擾特性，本研究可以為環(huán)境中微生物去除防腐劑提供一定的指導(dǎo);同時(shí)此研究目前只對MeP的降解進(jìn)行了初步的研究，對其降解路徑和機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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