藥用蘭科植物分子標記技術(shù)研究進展

周龍偉 張良花 李川

摘要? ? 分子標記技術(shù)在鑒定植物遺傳多樣性上已被廣泛使用。本文綜述了常用的DNA分子標記（RAPD、AFLP、ISSR等）鑒定藥用蘭科植物遺傳多樣性的研究進展，指出了使用藥用蘭科植物分子標記的問題，并提出了分子標記在藥用蘭科植物資源保護和開發(fā)等方面的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞? ? 藥用蘭科植物;分子標記;遺傳多樣性

中圖分類號? ? S567? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

蘭科（Orchidaceae）植物是天門冬目的多年生草本植物，俗稱蘭花，亦叫胡姬花，是開花植物中最大、最具多樣性的科，約800個屬、25 000余種，廣布全球，主產(chǎn)南美和亞洲的熱帶地區(qū)。我國有166屬、1 000余種，南北均產(chǎn)，而以云南、海南、臺灣種類最豐富。我國蘭花資源中某些種不但具有很高的觀賞價值，而且具有極高的藥用價值，已知藥用有76屬、287個種[1]，如石斛、白及、黃花白及、天麻、金線蓮、手參、石仙桃等。目前，大多數(shù)藥用蘭科植物是野生蘭花，過度采挖使野生蘭科植物的生境被破壞而導(dǎo)致野生資源已瀕臨滅絕。因此，對蘭科植物的研究和保護工作已刻不容緩。本文綜述了近年來利用分子標記技術(shù)研究蘭科植物遺傳多樣性的應(yīng)用與研究進展，為相關(guān)研究提供參考。

1? ? 目前蘭科植物利用分子標記的研究現(xiàn)狀

1.1? ? RAPD技術(shù)的應(yīng)用

朱勝男等[2]采用隨機擴增多態(tài)性DNA技術(shù)對31種石斛屬（Dendrobium）植物的遺傳多樣性進行分析。從100條RAPD引物中共篩選出18條引物，18條引物共擴增出1 082條帶，其中多態(tài)性位點有261個，多態(tài)性比為99.2%。UPGMA聚類結(jié)果顯示，基因型之間的相似系數(shù)分布于0.642～0.838之間，31種石斛屬植物樣品分為7類。聚類分析顯示供試樣品完全被區(qū)分開，試驗結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)分類相似，但又有一定區(qū)別。苑? 鶴等[3]利用RAPD分子標記對浙江義烏、天臺、建德、武義，云南麻栗坡、勐海的14個居群的鐵皮石斛和1個居群的紫皮石斛進行遺傳多樣性分析。從225個RAPD引物中篩選出15個引物，對105個鐵皮石斛和3個紫皮石斛樣本進行PCR擴增，共擴增出138條帶，其中133條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率（PPB）為96.38%;14個鐵皮石斛居群的多態(tài)位點（PPL）在10.79%～76.26%之間，平均為45.32%。結(jié)果表明，全國主產(chǎn)區(qū)人工栽培的鐵皮石斛遺傳多樣性豐富，鐵皮石斛種質(zhì)的親緣關(guān)系遠近與其地理種源具有顯著的相關(guān)性，與栽培地點無關(guān)。此外，金? 波等[4]、邱? 婧等[5]、任? 羽等[6]也曾用RAPD技術(shù)對石斛的遺傳多樣性進行研究，也都獲得了類似的結(jié)果，豐富穩(wěn)定的擴增多態(tài)性證明，RAPD標記技術(shù)可以用于石斛屬植物的分類、物種鑒定和遺傳多樣性研究。

王德信[7]以烏天麻、黃天麻和綠天麻3種變型為研究對象，通過RAPD分析研究天麻（Gastrodia elata Bl.）遺傳多樣性，采用改良的CTAB法提取天麻樣品DNA，篩選出重復(fù)性好的10條隨機引物，對130個樣品的基因組DNA進行擴增，建立RAPD分析圖譜。結(jié)果表明，54條為特異性帶，多態(tài)性變異率高達65.1%，說明天麻變異程度較大。聚類分析表明，栽培群體烏天麻是一個高度混雜的群體，雖然個體的表現(xiàn)型基本相同，但從遺傳物質(zhì)的組成來看，基因型不一致。研究表明，天麻具有豐富的遺傳多樣性，其中烏天麻遺傳多樣性最豐富、變異復(fù)雜，為鑒定優(yōu)質(zhì)天麻品種、天麻種質(zhì)資源合理有效利用和進行遺傳育種提供了科學依據(jù)。

張? 鐵等[8]以文山地區(qū)藥用金線蓮原植物滇越金線蘭（A.chapaensis）及3種葉面特征不同的花葉開唇蘭為材料提取基因組DNA，選擇適合的隨機引物和PCR反應(yīng)體系，擴增分析金線蓮的帶譜。結(jié)果表明，16條引物共得到108條帶譜，其中有95條多態(tài)性譜帶，多態(tài)百分比為87.96%，且4種材料都具特異性條帶。由此表明，試驗材料之間遺傳差異性較大，花葉開唇蘭可能已經(jīng)形成了新的變型或變種。獲得的特異性條帶可用于區(qū)分干燥的金線蓮藥材。

黃寶華等[9]從100個隨機RAPD引物中篩選出14個多態(tài)性較好的引物對15份蝦脊蘭（Calanthe）野生種進行了分析，結(jié)果表明，14個RAPD引物共擴增出254條帶，其中多態(tài)性帶243條，多態(tài)性比率為95.67%;15份蝦脊蘭野生種間的遺傳相似系數(shù)的變幅為0.258 8～0.684 8，平均值為0.471 8，表明蝦脊蘭屬植物的遺傳多態(tài)性較豐富。

另外，王春香[10]用RAPD技術(shù)對斑葉蘭（Goodyera schle-chtendaliana Rchb.f.）遺傳多樣性與群落優(yōu)勢種群生態(tài)位進行了研究。季祥彪等[11]用此技術(shù)研究了貴州野生春蘭遺傳多樣性（表1）。

1.2? ? AFLP技術(shù)的應(yīng)用

王慧中等[12]采用AFLP技術(shù)分析了13種石斛屬植物的遺傳多樣性，選擇性擴增引物組合E+ACT/M+CAC、E+AAC/M+CAC和E+ACA/M+CAC分別對這13種材料進行擴增，得到豐富的條帶。在100～300 bp共得到346條帶，多態(tài)性帶342條，多態(tài)性百分率為98.8%。聚類分析結(jié)果表明，在相似系數(shù)0.54處，可將13種材料分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類。Ⅰ類包括串珠石斛、鐵皮石斛、廣東石斛、重唇石斛、晶帽石斛、細葉石斛、滇桂石斛、報春石斛、玫瑰石斛、球花石斛;Ⅱ類包括鼓槌石斛;Ⅲ類包括美花石斛（花，淺紅）、美花石斛（花，淡白）。AFLP分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類學的結(jié)果基本一致，表明該標記技術(shù)對石斛屬植物的遺傳多樣性和分類研究是可行的。

關(guān)? 萍等[13]從貴州、云南、四川、陜西和遼寧收集了27份天麻樣品，從64對AFLP選擇性引物組合中篩選出16對組合，對不同分布區(qū)天麻的遺傳多樣性進行分析。16對引物共產(chǎn)生548條大小在100～1 500 bp的譜帶，其中多態(tài)性帶428條，多態(tài)性比率（PP）達78%，說明不同分布區(qū)的天麻中存在一定的遺傳多樣性，且AFLP可以有效地進行天麻遺傳多樣性的分析。遺傳差異分析結(jié)果表明，27個樣品的遺傳距離為0.018 7～0.593 0，平均為0.219 9，表明不同分布區(qū)天麻個體間存在一定的遺傳差異。不同變型的AFLP分析結(jié)果顯示，3種變型從分子上無明顯差異，說明天麻種內(nèi)的變型僅僅是表型上的變異，尚未在遺傳上固定下來，對天麻幾個變型的劃分是否成立還有待進一步研究。程紀倫等[14]利用AFLP技術(shù)，采用8對M+3和P+3引物組合對23份貴州野生天麻品種進行了總基因組DNA水平上的多態(tài)性檢測，用NTSYSpc-2.10s軟件的UPGMA方法對檢測結(jié)果進行聚類。結(jié)果共獲得552條可統(tǒng)計的條帶，其中396條呈多態(tài)性，多態(tài)性帶百分率約為72%。UPGMA聚類可以將貴州不同產(chǎn)地的野生天麻很好地區(qū)分開來。其聚類分析結(jié)果表明，貴州野生天麻種質(zhì)豐富的遺傳多樣性，多數(shù)來源地相同的天麻種質(zhì)表現(xiàn)出較為密切的親緣關(guān)系。此外，王曉麗等[15]、趙永亮等[16]、謝? 淵等[17]也曾用AFLP技術(shù)對天麻的遺傳多樣性進行了相關(guān)研究。其結(jié)果表明，AFLP技術(shù)在天麻的種類劃分、遺傳多樣性研究、親緣關(guān)系鑒定上起到重要作用。

朱根發(fā)等[18]利用AFLP分析技術(shù)，從64對PstI/MseI引物中篩選出9對多態(tài)性引物組合，對來源于中國廣東、福建、臺灣的42個墨蘭（Cymbid ium sinense Willd）品種進行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，共擴增出1 384條帶，其中多態(tài)性帶1 333條，多態(tài)性率96.3%。平均每對引物擴增帶數(shù)154條、多態(tài)性帶數(shù)148條。所有的品種均可區(qū)分，其中39個品種具特征帶或缺失帶。墨蘭品種間的遺傳多樣性豐富，品種間的Dice相似系數(shù)為0.422 2～0.824 5，平均相似系數(shù)為0.611 2?！斑_摩”系列芽變?nèi)~藝品種間的遺傳多樣性顯著降低，多態(tài)性率為76.6%，平均相似系數(shù)為0.725 6。聚類分析表明，同一產(chǎn)地來源的品種基本上可聚為一類，反映出了品種間的親緣關(guān)系。

管俊杰等[19]以羊耳蒜（Liparis japonica）幼嫩葉片為材料，采用常規(guī)SDS法提取基因組DNA，通過優(yōu)化AFLP反應(yīng)體系中的幾個關(guān)鍵因素，建立適合羊耳蒜的AFLP銀染反應(yīng)體系，并利用篩選出的引物組合對羊耳蒜的遺傳多樣性進行初步研究。經(jīng)EcoRⅠ和MseⅠ酶組合37 ℃酶切3 h后可將500 ng基因組DNA完全切開;酶切產(chǎn)物和接頭經(jīng)16 ℃連接過夜后，用帶有1個選擇性堿基的預(yù)擴引物和帶有3個選擇性堿基的選擴引物分別進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染，能夠得到清晰的擴增圖譜。3對引物組合對8個羊耳蒜種群共185個體的擴增共得到221條條帶，其中多態(tài)性條帶195條，多態(tài)性條帶百分率為88.24%。其研究結(jié)果表明，建立的AFLP反應(yīng)體系可用于羊耳蒜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究（表2）。

1.3? ? ISSR技術(shù)的應(yīng)用

盧家仕等[20]采用ISSR分子標記技術(shù)和非加權(quán)平均距離法（UPGMA）對24份不同產(chǎn)地石斛屬樣品的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進行分析，從100條ISSR引物中共篩選出6條多態(tài)性穩(wěn)定、清晰的引物，24份石斛樣品共擴增出847個DNA片段，平均每個引物擴增出141個DNA片段，其多態(tài)性為100%。將24份不同產(chǎn)地石斛樣品劃分為6個類群，遺傳多樣性非常豐富。楊春勇等[21]利用ISSR分子標記技術(shù)對9種藥用栽培石斛的遺傳多樣性進行研究，從備選的引物中篩選出14條多態(tài)性引物，共檢測到179個多態(tài)性位點，多態(tài)性比率為94.71%，ISSR標記檢測結(jié)果顯示，源于不同栽培地區(qū)栽培的的石斛屬植物的遺傳多樣性非常豐富。馬佳梅等[22]采用ISSR分子標記技術(shù)，對西雙版納分布的蘭科瀕危植物流蘇石斛5個居群共114個個體的遺傳多樣性進行了研究。從100條引物中篩選出了12條用于擴增，共檢測到117個位點，其中105個為多態(tài)位點。分析結(jié)果表明，流蘇石斛居群水平遺傳多樣性較低，在物種水平上，流蘇石斛多態(tài)位點百分率PPB為89.74%，Nei′s基因多樣性指數(shù)H為0.322 7，Shannonc s多樣性信息指數(shù)Hsp為0.477 9。通過ISSR分子標記技術(shù)對石斛的研究，更加確信分子標記技術(shù)對石斛的分類、遺傳多樣性與親緣關(guān)系鑒定的顯著作用。

關(guān)? 萍等[24]利用ISSR分子標記技術(shù)，對分布于貴州的藥用植物天麻的9個種群的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，用12條ISSR引物共擴增出120條大小為200～1 600 bp的清晰譜帶，其中97條具有多態(tài)性，總的多態(tài)位點百分率為80.83%，表明在物種水平上有較高的遺傳變異;種群水平的多態(tài)性相對較低，多態(tài)百分率在17.5%～40.83%之間，平均25.56%。用POPGENE軟件計算各種群間和種群內(nèi)的遺傳參數(shù)，結(jié)果表明，物種水平上的Nei′s遺傳多樣性（He）為0.042～0.153，平均為0.07 3;Shannon信息指數(shù)為0.332 6±0.224 1;Nei′s基因分化系數(shù)（Gst）為0.6377，表明種群間的遺傳變異占總變異的63.77%，而種群內(nèi)的遺傳變異占總變異的36.23%，這與有限的基因流有關(guān);而種群間有限的基因流（Nm=0.284 1）可能是由于種子的傳播距離、種子極低的生活率以及種群間的地理隔離和營養(yǎng)繁殖等因素所致。

和志嬌等[24]采用ISSR標記對14份小白芨（B.letilla form osana）、5份白芨（B. striata）、2份黃花白芨（B. ochracea）4份未確定種進行了遺傳多樣性的研究，從35個引物中篩選出12個能擴增出清晰帶型并具多態(tài)性的引物，共擴增出了124條DNA片段，分子量在259～2 200 bp之間，平均每條引物擴增出10.33條DNA片段，多態(tài)性比率為87.90%，采用POPGENE軟件，計算了種間的Nei氏距離，并用UPGMA法構(gòu)建了系統(tǒng)樹，這25份供試材料明顯聚為3個大類，即小白芨、黃花白芨、白芨，與形態(tài)學的分類結(jié)果一致，其中根據(jù)4份未確定種的親緣關(guān)系初步將其歸入了不同的類群。25份白芨種質(zhì)間的遺傳距離為0.448 3～0.790 3。另外，UPGMA聚類結(jié)果表明，不同地理位置采集到的3種白芨樣品種內(nèi)和種間的遺傳親緣關(guān)有明顯的差異。

劉翠華[25]以江西省建蘭（Cymbidium ensifolium）為材料，采用ISSR分子標記進行遺傳多樣性分析，表明17個建蘭居群遺傳距離和地理距離相關(guān)性不顯著（表3）。

1.4? ? 其他分子標記技術(shù)的應(yīng)用

樊洪泓等[26]利用SRAP分子標記技術(shù)進行藥用石斛的遺傳多樣性研究。采用優(yōu)化的SRAP反應(yīng)體系，應(yīng)用NTSYS軟件對9種石斛的SRAP-PCR結(jié)果進行分析，從中篩選得到40對多態(tài)性引物組合，共產(chǎn)生1 782條多態(tài)性條帶，平均每個引物組合產(chǎn)生44.55條多態(tài)性條帶，顯示了較高的多態(tài)性比率。聚類分析40對引物組合的擴增結(jié)果，供試材料分為2個大類，Jaccard′s遺傳相似系數(shù)為0.330 2～0.789 2。SRAP技術(shù)可應(yīng)用于藥用石斛的遺傳多樣性及親緣關(guān)系的研究。

白? 堅等[27]采用SRAP分子標記技術(shù)對來自四川、臺灣、廣東的47個建蘭品種的遺傳多樣性進行分析，應(yīng)用NYSYS軟件對SRAP-PCR結(jié)果進行聚類分析。結(jié)果從88對引物中篩選獲得12對特異性強、穩(wěn)定性好的引物進行SRAP分析，共擴增出188條帶紋，其中147條為多態(tài)性位點，平均每組引物擴增出12條多態(tài)性帶。聚類分析表明，47個品種可以分為4個類群：第Ⅰ群由來自四川的3個品種組成;第Ⅱ群的23個品種中有18個來自四川、3個來自廣東、2個來自臺灣;第Ⅲ群的12個品種中有11個品種源于臺灣，1個源于四川;第Ⅳ群僅有1個來自四川，其他品種均來自臺灣。結(jié)果表明，由于人工馴化，造成了建蘭品種遺傳背景的混亂，而SRAP分子標記技術(shù)能有效地分析建蘭品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系（表4）。

2? ? 目前存在的問題

2.1? ? 尚未用到的分子標記技術(shù)

近年來，分子標記技術(shù)逐漸得到廣泛利用，在藥用蘭科植物上也得到相應(yīng)的發(fā)展。尤其以RAPD技術(shù)、AFLP技術(shù)、ISSR技術(shù)、SRAP技術(shù)常見。SSR技術(shù)的應(yīng)用相對較少，其他技術(shù)，如RFLP技術(shù)、STS技術(shù)、TRAP技術(shù)、EST技術(shù)、SNP技術(shù)目前沒有涉及。

2.2? ? 尚未采用分子標記研究的藥用蘭科植物

目前，分子標記技術(shù)在石斛、天麻的研究應(yīng)用中較為廣泛，在其他藥用蘭科植物（如白及、金線蓮、蝦脊蘭等）上的應(yīng)用并不常見，而在很多種蘭藥用科植物（如手參、石仙桃、杜娟蘭、巖蒜等）還未見相關(guān)研究的報道。

2.3? ? 分子標記在實際應(yīng)用中的問題

與傳統(tǒng)標記（形態(tài)標記、細胞標記及生化標記）相比，分子標記有許多優(yōu)點，其直接在DNA分子上檢測生物間的差異，是在DNA水平上遺傳變異的直接反映。但是，目前分子標記技術(shù)依然存在一些問題，主要有標記遺傳圖譜的局限性;與育種目標性狀連鎖分子標記的多態(tài)性頻率較低;在DNA提取、定量和PCR擴增以及數(shù)據(jù)處理等方面的自動化程度較低，所需儀器設(shè)備及試劑價格昂貴。

每一種技術(shù)都有著一定的局限性，單憑一種分子標記技術(shù)的應(yīng)用去研究其遺傳多樣性，在某一種或者某一類植物上去研究探討是不夠周全的。因此，需要結(jié)合多種分子標記技術(shù)，對不同類別的蘭科植物進行進一步探索，積累更多的探究結(jié)果，從而更好地應(yīng)用于蘭科植物的遺傳多樣性研究，為蘭科植物的分類、鑒定以及育種、人工營養(yǎng)繁殖奠定基礎(chǔ)。

3? ? 應(yīng)用前景與展望

蘭科植物中的石斛、天麻、白及、芋蘭、金線蘭、獨蒜蘭、杜鵑蘭、手參等是國家重要的中藥材，由于長期過度開發(fā)利用，藥用蘭科植物野生資源遭到嚴重破壞，有些種類的野生資源已近枯竭，加強保護我國藥用蘭科植物已迫在眉睫。

為了保護蘭科植物，合理開發(fā)利用藥用蘭科植物種質(zhì)資源，近年來不少學者致力于分子標記技術(shù)在蘭科植物上的研究、應(yīng)用。可以預(yù)見，隨著高通量、低成本和高精度DNA測序新技術(shù)的發(fā)展，分子標記技術(shù)將會更好地應(yīng)用于藥用蘭科植物的選擇育種、品種改良以及種子純度的鑒定，為研究遺傳多樣性、劃分雜種優(yōu)勢群提供新方法，為其品種親屬關(guān)系鑒定、同一性鑒定提供有力依據(jù)。

4? ? 參考文獻

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