牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277菌株外切聚磷酸酶的表達(dá)、純化和結(jié)晶

張愛莉， 盧作焜， 李蓉芳， 李文文

(許昌學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南省食品安全生物標(biāo)識快檢技術(shù)重點實驗室，許昌 461000)

多聚磷酸鹽(polyphosphate，polyP)由正磷酸殘基組成，其長度可達(dá)到上百個，在所有的真核和原核細(xì)胞中都能發(fā)現(xiàn)多聚磷酸鹽的存在[1-2]。在真核細(xì)胞中，polyP能夠顯著影響DNA損傷后的細(xì)胞修復(fù)[3]。在細(xì)菌中，polyP不僅參與嚴(yán)緊反應(yīng)，還對增強(qiáng)牙齦卟啉單胞菌、結(jié)核分枝桿菌以及銅綠假單胞菌等病原菌的毒性、感染性、靜止期耐受性以及抗生素耐藥性等生理活動起著至關(guān)重要的作用[4-7]。因此，細(xì)胞中polyP濃度的調(diào)控對細(xì)菌的生長、存活、適應(yīng)及感染等許多生理學(xué)過程十分重要。

外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase，PPX)是細(xì)菌中水解polyP的主要蛋白[8]。研究發(fā)現(xiàn)PPX對幾種主要病原菌(如結(jié)核分枝桿菌和腦膜炎奈瑟氏菌)的致病機(jī)理、靜止期存活以及抗生素耐受性等必不可少[9]。同時，polyP與PPX在嗜熱金屬球菌的銅離子抵抗中具有重要作用[10]。PPX蛋白屬于外切聚磷酸酶/鳥苷五磷酸磷酸水解酶(PPX/GppA)家族蛋白。目前，針對PPX/GppA蛋白家族的研究主要集中在該家族蛋白的生理學(xué)重要性，而關(guān)于其結(jié)構(gòu)的研究尚鮮見報道，僅2種PPX/GppA同源蛋白的結(jié)構(gòu)被報道，分別是來源于超嗜熱菌的PPX蛋白和大腸桿菌的PPX蛋白[11-13]，而來源于運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的PPX/GppA同源蛋白的野生型、截短體和活性位點突變體的X射線晶體學(xué)研究近期也被報道[14]，亟待進(jìn)一步深入研究該家族蛋白。

引起成人牙齒脫落的原因很多，其中最主要是牙周炎，牙周炎也是人類最經(jīng)常發(fā)生的傳染性疾病之一[15-17]。而牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis)是引起嚴(yán)重慢性牙周炎和侵襲性牙周炎的主要病原體[15]。研究表明，該病原菌的重組RgpB蛋白可以激活人口腔成齦纖維細(xì)胞的鈣離子通路[18]，其脂多糖能夠通過增加抗炎癥因子的生成來降低口腔不良反應(yīng)[19]；Porphyromonasgingivalis也與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種系統(tǒng)性疾病相關(guān)[20]。此外，最新研究發(fā)現(xiàn)，引起阿爾茨海默癥的真正原因很可能是Porphyromonasgingivalis[21]。

PorphyromonasgingivalisATCC 33277菌株是牙齦卟啉單胞菌的模式菌株，其基因組僅含有一個編碼外切聚磷酸酶的基因PGN_0378，編碼的外切聚磷酸酶(PgPPX蛋白)由302個氨基酸殘基組成[22]。Porphyromonasgingivalis381的多聚磷酸激酶1(PPK1)蛋白能夠合成polyP，該蛋白基因的缺失會引起生物膜形成和靜止期存活的缺陷[4]。據(jù)此，并結(jié)合PPX蛋白在其他病原菌致病中的重要作用，可以推測PgPPX蛋白也與Porphyromonasgingivalis的致病性以及嚴(yán)緊反應(yīng)等生理活動至關(guān)重要，該蛋白極有可能作為潛在的抗Porphyromonasgingivalis的藥物靶標(biāo)。然而，目前關(guān)于Porphyromonasgingivalis中PPX/GppA家族同源蛋白PgPPX的表達(dá)與純化以及結(jié)構(gòu)的報道仍處于空白。

為此，利用分子克隆技術(shù)對PorphyromonasgingivalisATCC 33277菌株的外切聚磷酸酶(PgPPX)的基因進(jìn)行克隆和重組載體構(gòu)建，表達(dá)、純化后對目的蛋白進(jìn)行晶體生長與對比，以期后續(xù)對該致病菌中的外切聚磷酸酶進(jìn)行X射線晶體學(xué)研究，對基于結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的藥物設(shè)計提供一個起點，為更為有效地治療牙周炎提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菌株與質(zhì)粒：大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)， pGEX-6p-1質(zhì)粒。

其他試驗材料及來源如表1所示。

表1 試驗材料

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以PorphyromonasgingivalisATCC 33277菌株為擴(kuò)增模板，利用PCR技術(shù)對PgPPX的編碼序列PGN_0378進(jìn)行擴(kuò)增。采用T4 DNA連接酶將雙酶切后的目的基因片段連接至pGEX-6p-1載體，使表達(dá)的PgPPX蛋白序列N端具有谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽和HRV3C蛋白酶酶切序列。提取質(zhì)粒后鑒定擴(kuò)增的重組質(zhì)粒(由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成)。將正確克隆的重組質(zhì)粒利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21中?；騊GN_0378的分子克隆信息如表2所示。

表2 分子克隆信息

1.2.2 PgPPX融合蛋白的表達(dá)

使用非代謝的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在不同的濃度下誘導(dǎo)目的融合蛋白的過量表達(dá)，4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4、2.7 mmol/L KCl、140 mmol/L NaCl、1.8 mmol/L KH2PO4，pH=7.4)懸起收集的菌體細(xì)胞，并采用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎[23]。

1.2.3 PgPPX蛋白的純化

1.2.4 PgPPX結(jié)晶條件的篩選

采用坐滴氣相擴(kuò)散法對晶體生長條件進(jìn)行篩選[24-25]，所使用的結(jié)晶池液條件包括Hampton Research公司生產(chǎn)的Crystal Screen Kit I、II，Index，PEG/ION I、II，Salt Rx I、II，PEGRxI、II和Emerald BioSystems公司的Wizard I、II、III、IV等晶體生長試劑盒。

2 試驗結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

通過PCR技術(shù)擴(kuò)增PgPPX蛋白基因PGN_0378。重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果經(jīng)過比對后表明，pGEX-6p-1載體中克隆入的外源目的基因序列與NCBI的Nucleotide庫中PGN_0378的DNA序列信息相吻合，一致性達(dá)到100%。說明已成功將PgPPX蛋白的基因構(gòu)建到pGEX-6p-1載體中，得到重組質(zhì)粒。

2.2 PgPPX蛋白的表達(dá)和純化

分別取HRV3C蛋白酶酶切前的柱上樣和酶切后的流穿樣制樣。由圖1可知，PgPPX-GST融合蛋白(泳道2，分子質(zhì)量約為60 kDa)已被蛋白酶切開，洗脫的目的蛋白電泳條帶位置(泳道1)與預(yù)測的分子質(zhì)量(33.7 kDa)接近。

圖1 融合蛋白GST親和層析后的13%SDS-PAGE檢測

PgPPX蛋白的陰離子交換層析圖譜如圖2所示，其中藍(lán)色曲線表示蛋白質(zhì)在280 nm波長處的吸光值，棕色曲線表示線性NaCl的濃度梯度(Buffer B的混合百分比)。由圖2可知，PgPPX蛋白在離子強(qiáng)度梯度提高過程中形成了一個分布比較集中、對稱的洗脫峰，洗脫峰出現(xiàn)在29%Buffer B附近。離子交換層析圖譜表明PgPPX蛋白有較高的電荷均一性。

圖2 陰離子交換層析圖譜

SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖3所示，表明PgPPX純度較前一步驟得到了進(jìn)一步的提高。

圖3 陰離子交換層析后收集部分的13%SDS-PAGE檢測

PgPPX蛋白的凝膠過濾層析色譜圖如圖4所示，在14.3 mL附近有一個峰型較為對稱的目的蛋白洗脫峰，將其與標(biāo)準(zhǔn)樣品在Superdex200 10/300 GL凝膠過濾層析柱的洗脫圖譜進(jìn)行比較，得知蛋白樣品洗脫峰對應(yīng)分子質(zhì)量約為67 kDa，表明PgPPX蛋白在此溶液中主要為二聚體形式。

圖4 凝膠過濾層析圖譜

凝膠電泳結(jié)果(圖5)表明，主要洗脫峰均為PgPPX蛋白，且純度已經(jīng)達(dá)到95%以上。

圖5 凝膠過濾層析后收集部分的13%SDS-PAGE檢測

2.3 PgPPX蛋白的濃度鑒定

收集凝膠過濾層析后的目的蛋白洗脫峰進(jìn)行超濾濃縮，利用Nanodrop超微量分光光度計檢測蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果表明，LB培養(yǎng)基的PgPPX表達(dá)量高達(dá)30 mg/L。

2.4 PgPPX結(jié)晶條件的篩選

晶體培養(yǎng)約7 d后，在顯微鏡下觀察到有3個條件中均有晶體長出，分別是PEG/ION的32號條件[0.2 mol/L MgSO4·6H2O、20% PEG3350(m/V)]，PEG/ION的39號條件[0.2 mol/L NaH2PO4·H2O、20% PEG3350(m/V)]和Wizard IV的29號條件[pH=4.0、0.1 mol/L C6H5Na3O7/C6H8O7,0.2 mol/L C6H5Na3O7，20% PEG3350(m/V)]，獲得的晶體如圖6所示，形狀分別為棍狀、針狀、薄片狀簇生。其中，PEG/ION-32條件下獲得的晶體形狀最好，為較粗的長棍狀，而其他兩個條件下獲得的晶體形狀不規(guī)則且為攣晶，這與在室內(nèi)Rigaku MicroMax-007 HF旋轉(zhuǎn)陽極X射線衍射儀下的初步衍射結(jié)果一致。

圖6 篩選得到的晶體

3 討論

Porphyromonasgingivalis表現(xiàn)出一定的抗生素耐藥性，是造成最嚴(yán)重的抗生素耐藥問題的少數(shù)病原體之一[16]。除牙周炎之外[15-19]，大量研究表明Porphyromonasgingivalis還與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和阿爾茨海默癥等多種系統(tǒng)性疾病相關(guān)[20-21]。相比于骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，牙周炎的發(fā)病率更高，發(fā)病情況更加嚴(yán)重[26]。此外，Porphyromonasgingivalis能通過降低與B細(xì)胞激活相關(guān)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制阿爾茨海默癥患者中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[27]；最新研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默癥患者的認(rèn)知衰退越嚴(yán)重，其大腦中的Porphyromonasgingivalis數(shù)量越多；小鼠試驗證實了Porphyromonasgingivalis進(jìn)入大腦后釋放的一種分泌蛋白才是導(dǎo)致阿爾茨海默癥的真正原因[21]。綜上所述，病原菌Porphyromonasgingivalis不容小覷，除病理學(xué)研究外，還急需對影響其生存、感染的蛋白質(zhì)展開生化研究。

牙周炎患者牙周袋中惡劣的炎癥環(huán)境表明，Porphyromonasgingivalis一定有能力幫助其應(yīng)對和適應(yīng)外界的氧化、營養(yǎng)等壓力。由于病原菌抵抗外界環(huán)境壓力的嚴(yán)緊反應(yīng)也是其致病性的關(guān)鍵因素之一。因此，應(yīng)針對Porphyromonasgingivalis中和病理生理學(xué)以及嚴(yán)緊反應(yīng)相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，以期為抗Porphyromonasgingivalis藥物的開發(fā)，以及有效預(yù)防和治療牙周炎奠定基礎(chǔ)。然而，至今關(guān)于Porphyromonasgingivalis中與病原菌的致病性、嚴(yán)緊反應(yīng)和對抗生素耐藥起關(guān)鍵作用的PPX/GppA家族同源蛋白的表達(dá)、純化以及結(jié)構(gòu)與功能的報道仍處于空白。

為此，通過對PorphyromonasgingivalisATCC 33277中編碼外切聚磷酸酶的基因PGN_0378進(jìn)行重組載體構(gòu)建和外源表達(dá)。利用GST親和層析純化融合蛋白后，切除GST標(biāo)簽。由于蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)的研究工作需要獲得大量的性質(zhì)均一、穩(wěn)定的目的蛋白，從而來進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)及優(yōu)化。因此，依次采用3種層析技術(shù)對PgPPX蛋白進(jìn)行了純化，成功得到了純度極高、性質(zhì)均一的大量目的蛋白。

PgPPX蛋白的預(yù)測分子質(zhì)量為33.7 kDa，而其凝膠過濾層析色譜圖表明PgPPX蛋白在此溶液中主要為二聚體形式。這種現(xiàn)象與其他PPX/GppA家組蛋白的情況一致，例如大腸桿菌PPX和GppA蛋白[12-13]以及運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis)的假定外切聚磷酸酶[14]。此結(jié)果有利于結(jié)構(gòu)解析時進(jìn)行晶體空間群的確定。

由PgPPX蛋白的晶體生長條件篩選結(jié)果可知，3種條件中均含有20% PEG3350(m/V)，說明該濃度條件下的PEG3350對PgPPX晶體的生長極其重要，而0.2 mol/L MgSO4·6 H2O影響晶體的形狀。后續(xù)需要采用坐滴法或篩選添加劑等方法依據(jù)PEG/ION-32的成分組成對PgPPX晶體進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，以期獲得衍射能力更好的晶體，為后期對該致病菌中如此重要的外切聚磷酸酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)，并為基于結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的抗牙周炎藥物設(shè)計提供一個起點。

4 結(jié)論

(1)構(gòu)建載體PgPPX-pGEX-6p-1和轉(zhuǎn)化菌株BL21(DE3)-PgPPX-pGEX-6p-1，經(jīng)過多種純化技術(shù)后得到純度、表面電荷性質(zhì)和聚合狀態(tài)均一程度均較滿意的PgPPX蛋白，而且蛋白表達(dá)量高達(dá)30 mg/L。

(2)通過篩選條件，PgPPX在0.2 mol/L MgSO4·6 H2O，20% PEG3350(m/V)條件下獲得的晶體形狀較好，為后續(xù)的X-射線晶體學(xué)研究和蛋白酶活性測定試驗奠定了基礎(chǔ)。