DNA聚合酶Ⅲ全酶的功能和結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)

向義和

教授，清華大學(xué)物理系，北京100084

DNA聚合酶Ⅲ全酶的功能和結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)

向義和

教授，清華大學(xué)物理系，北京100084

DNA聚合酶Ⅲ DNA聚合酶Ⅲ＊共聚物酶Ⅲ＊α核心聚合酶 ε亞基 β亞基滑動夾子 γ復(fù)合物

介紹了DNA聚合酶Ⅲ和聚合酶Ⅲ＊的發(fā)現(xiàn)，DNA聚合酶Ⅲ全酶形式的提出以及全酶亞基的分離。同時，介紹了DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能，其中包括α核心的聚合酶功能，ε亞基的3′→5′外切核酸酶活性，β亞基滑動夾子的功能以及γ復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能。

DNA聚合酶Ⅲ全酶（DNA polymeraseⅢholoenzyme）是DNA復(fù)制中最主要的酶，是能夠進(jìn)行引物鏈的延伸并完成DNA的前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成的酶。全酶是一個多亞基酶。它具有很快的復(fù)制速率和很高的延伸能力，大約每秒合成750個核苷酸，與在大腸桿菌中觀察到的復(fù)制叉運(yùn)動速率是一致的，比DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）的每秒合成10～20個核苷酸的速率快。這樣快的速率來自于全酶的高度持續(xù)合成能力。

筆者分4部分介紹了DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)現(xiàn)的歷程。第1部分介紹了DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）的發(fā)現(xiàn)。第2部分介紹了DNA聚合酶Ⅲ＊的發(fā)現(xiàn)和全酶形式的分離。第3部分介紹了DNA聚合酶Ⅲ全酶亞基的分離。第4部分介紹了DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)和功能，其中包括核心α的聚合酶功能，ε亞基的3′→5′外切核酸酶活性，β亞基滑動夾子的功能以及γ復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能。

1 DNA聚合酶Ⅲ的發(fā)現(xiàn)

在DNA聚合酶Ⅰ被分離出來后不久，大量實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明它不適于龐大的DNA復(fù)制過程。第一，它添加核苷酸的速度（600個／min）僅為大腸桿菌細(xì)胞中復(fù)制叉移動速度的1／100左右。第二，DNA聚合酶Ⅰ的連續(xù)合成的能力相對較低。第三，對基因的研究表明，許多基因和蛋白質(zhì)參與了復(fù)制過程，顯然DNA聚合酶Ⅰ不會單獨(dú)起作用。第四，約翰·凱恩斯（John Cairns）分離出一個因基因突變而不能合成有活性的DNA聚合酶Ⅰ的菌株。雖然該菌株對那些可能破壞DNA的試劑異常敏感，但確實(shí)存在。

1969年冷泉港實(shí)驗(yàn)室的研究員凱恩斯和露西亞（Paula De Lucia）在編碼polⅠ的polA基因中分離出一種具有缺陷的突變體。這個突變體（polAⅠ）缺少polⅠ活性，但它還是有活力的，從而有力地提出polⅠ實(shí)在不是DNA復(fù)制酶，而好像是在DNA損害的修復(fù)中起著主要的作用。它填充在排除錯誤堿基后留下的空隙。這年12月他們在Nature第224卷上發(fā)表題為《受突變影響的大腸桿菌菌株DNA聚合酶的分離》的論文。在文章一開始就寫道：“科恩伯格關(guān)于在試管中能夠精確復(fù)制DNA的酶的發(fā)現(xiàn)在分子生物學(xué)歷史上是關(guān)鍵的一步。因?yàn)樗喂痰卮_立了這個事實(shí)，對于能夠復(fù)制全體的機(jī)制的編碼只需要細(xì)胞DNA的一小部分。在那時正確地判斷在體內(nèi)負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的酶是不是這個酶是不太重要的。然而，從那時以來已經(jīng)累積的間接的證據(jù)表明，無論如何在細(xì)菌中這個特殊的酶是用于DNA的修復(fù)而不是它的復(fù)制。在高溫下不可能復(fù)制它們的DNA的大腸桿菌和枯草桿菌的各種各樣突變體，已經(jīng)完全表明在不容許的溫度下包含了正常的聚合酶和脫氧核苷三磷酸庫，至少其中之一已經(jīng)表明在高溫下進(jìn)行了修復(fù)合成?！保?］

在凱恩斯文章發(fā)表的同時，愛丁堡大學(xué)分子生物系教授J.Gross和 M.Gross［2］在1969年Nature第224卷上發(fā)表題為《具有影響DNA聚合酶突變的大腸桿菌菌株的基因分析》的論文。他們在文章一開始就寫道：“凱恩斯和露西亞已經(jīng)報告了分離的大腸桿菌突變株不同于親代株的3大特征：在提取物中極大地減少了DNA聚合酶活性，增加了對紫外光輻射的敏感性和增加了對磺化甲基甲烷的敏感性。由凱恩斯和露西亞提出的證據(jù)表明，這些性質(zhì)大致是單個損傷定位在DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)基因上的結(jié)果。我們建議相應(yīng)的基因座稱為polA，而在此研究的特殊突變是polAⅠ?！蓖ㄟ^實(shí)驗(yàn)他們證實(shí)polA定位在染色體的metB區(qū)域，polAⅠ是琥珀型突變（amber mutant）［2］。

1969年約翰·凱恩斯從大腸桿菌中分離到的一種缺少DNA聚合酶仍然以正常的速率生長和繁殖的突變株，成為了責(zé)難DNA聚合酶和科恩伯格的有力證據(jù)。polⅠ不是主要復(fù)制酶的發(fā)現(xiàn)，激勵起了對真實(shí)DNA復(fù)制的重新研究。在1971年，哥倫比亞大學(xué)湯姆·科恩伯格（Thomas Kornberg）和馬爾克姆·杰夫塔（Malcolm Gefter）發(fā)現(xiàn)了兩個新的聚合酶活性：DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ（polⅡ和polⅢ）。我們將看到polⅢ是有效的復(fù)制酶。

1970年在《自然·新生物學(xué)》（Nature：NewBiology）雜志上發(fā)表了一系列針對DNA聚合酶和科恩伯格的責(zé)難性評論。在這個時候，阿瑟· 科恩伯格的兒子湯姆·科恩伯格加入到?jīng)_突中。1970年5月湯姆因左手食指上的腫瘤惡化而使他在朱利亞音樂學(xué)院的大提琴課程不可能繼續(xù)下去。其次，他就讀的哥倫比亞大學(xué)，在生物學(xué)課程中，DNA聚合酶受人蔑視，他為此感到傷心。既然他無法再演奏大提琴，湯姆想知道他是否能參與在凱恩斯突變株中尋找失蹤的聚合酶［3］。

結(jié)果沒讓人失望。湯姆在哥倫比亞大學(xué)生物系的馬爾科姆·杰夫塔實(shí)驗(yàn)室獲得了一席之地，接著在3個星期內(nèi)，他就在大腸桿菌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種DNA多聚酶，這種酶與他父親已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的不一樣。1970年9月，僅僅在他進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室3個月后，他向每3年一次在瑞典舉辦的生物化學(xué)國際會議提交了他轟動性的發(fā)現(xiàn)。在第2年，湯姆以研究生的身份提純了這種新的多聚酶，并命名之DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ）。他可以清楚地將它和DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ）分開。在色譜分析過程中，他注意到還有一條聚合酶帶從DNA聚合酶Ⅱ中完全分離出來，它所在的位置在普通細(xì)胞制劑中被DNA聚合酶Ⅰ占據(jù)，從而使之隱藏。盡管富有經(jīng)驗(yàn)的酶學(xué)專家提出強(qiáng)烈的反對意見，認(rèn)為這個新的染色體帶像是技術(shù)假象，湯姆堅持己見，并證實(shí)它是一個不同的實(shí)體，將其命名為 DNA 聚合酶Ⅲ（polⅢ）［3］。

1971年12月湯姆·科恩伯格等［4］在《美國國家科學(xué)院院報》第68卷上發(fā)表題為《在大腸桿菌突變體中對DNA聚合酶在DNA合成中的熱敏性的分析》的論文。這篇文章介紹了他們構(gòu)建了一系列含有DNA合成熱敏性突變（dnaA，B，C，D，E，F(xiàn)，G）和凱恩斯與露西亞的polAⅠ的雙突變體。在每個突變體中他們測量了DNA聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ的活性。在測試的所有株中DNA聚合酶Ⅱ的活性是正常的。在dnaE基因座上在具有熱敏性突變的這些株中DNA聚合酶Ⅲ的活性是特別熱敏的。從這些結(jié)果他們得出結(jié)論：DNA聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ是獨(dú)立的酶，DNA聚合酶Ⅲ是大腸桿菌中DNA復(fù)制最主要的酶［4］。

文章一開始他們寫道：“由凱恩斯和露西亞對缺少DNA聚合酶Ⅰ活性的大腸桿菌突變體polAⅠ的分離，已經(jīng)促使許多人研究這類菌株的DNA合成能力。我們和其他人已經(jīng)報告了DNA聚合酶Ⅱ的提純和特征。此外，我們又報告了在大腸桿菌中第3種DNA聚合酶（DNA聚合酶Ⅲ）的存在，但是還沒有測定這些酶的生理學(xué)功能?！?/p>

他們接著指出：“沒有適量DNA聚合酶Ⅰ活性的具有生存能力的細(xì)胞表明，DNA聚合酶Ⅰ不是大腸桿菌DNA復(fù)制機(jī)制的必須的組分。為了確定聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ是不是復(fù)制的主要組分，我們檢驗(yàn)了對DNA復(fù)制溫度敏感的大腸桿菌突變體的DNA聚合酶，試圖使試管中的基因突變與改變的DNA聚合酶活性建立聯(lián)系。我們提出的證據(jù)表明DNA聚合酶Ⅲ是在dnaE基因座上基因表達(dá)的主要產(chǎn)物?！保?］

文章的最后報告了他和杰夫塔在磷酸纖維素層析的基礎(chǔ)上區(qū)別DNA聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ（圖1）。其中圖1（a）是從polAⅠ株的無細(xì)胞提取物中分離DNA聚合酶，圖1（b）是來自野生型大腸桿菌細(xì)胞中分離DNA聚合酶。測定每個組分的DNA聚合酶Ⅰ活性，分別在35～45和12～19組分中洗脫聚合酶Ⅱ和聚合酶Ⅲ活性。典型分離的結(jié)果如圖1所示，在圖1（a）中polⅡ與polⅢ和polⅠ分離得很好，但在野生型細(xì)胞中polⅢ被polⅠ掩蓋，見圖1（b）［5］。

圖1 DNA聚合酶的磷酸纖維素層析分離（縱坐標(biāo)為DNA聚合酶活性，橫坐標(biāo)為組分?jǐn)?shù)）（a）在pol AⅠ中，（b）在野生型細(xì)胞中

2 DNA聚合酶Ⅲ＊的發(fā)現(xiàn)和全酶形式的分離

1973年6月，科恩伯格和他的同事發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅲ的新形式polⅢ＊和共聚物酶CopolⅢ＊，提出全酶是由兩個polⅢ亞基和兩個CopolⅢ＊亞單位組成的四聚體。1974年科恩伯格和他的同事進(jìn)一步研究了DNA聚合酶Ⅲ全酶形式（holoenzyme form）的分離和性質(zhì)。

2.1 DNA聚合酶Ⅲ＊和共聚物酶Ⅲ＊的發(fā)現(xiàn)

1973年6月，科恩伯格和他在斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的同事［6］在《美國國家科學(xué)院院報》第70卷上發(fā)表題為《DNA聚合酶Ⅲ的新形式和共聚物酶復(fù)制長的單鏈引物模板》的論文。在摘要中介紹了DNA聚合酶Ⅲ的新形式和共聚物酶的發(fā)現(xiàn)。他們寫道：“一種稱為polⅢ星（polⅢ＊）的DNA聚合酶Ⅲ的新形式已經(jīng)從大腸桿菌提純到均一性。像對polⅢ描述的一樣，當(dāng)從熱敏的dnaE突變株分離時polⅢ＊是溫度敏感的。polⅢ＊和polⅢ是通過凝膠過濾分離的。polⅢ＊利用包含短缺口的雙鏈體模板，具有像polⅢ一樣相同的催化性質(zhì)。然而，如果提供以下物品：亞精胺，引物片段和稱為共聚物酶Ⅲ＊（CopolⅢ＊）的新蛋白質(zhì)，polⅢ＊可以復(fù)制長的單鏈模板，例如同聚物鏈，M13和ΦX174的病毒圓環(huán)。已提純到均一性的CopolⅢ＊沒有已知的獨(dú)立酶的活性，而維持合成是由polⅢ＊而不是由polⅠ，polⅡ或polⅢ?！保?］

文章一開始概括地敘述了polⅢ＊和CopolⅢ＊發(fā)現(xiàn)的背景。他們寫道：“在大腸桿菌提取物中發(fā)現(xiàn)M13和ΦX174單鏈圓環(huán) DNA（single-stranded DNA，ssDNA）轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制形式（replicating form，RF）依賴于特殊的熱酶系統(tǒng)。M13復(fù)制需要RNA聚合酶起始合成，而ΦX需要一個新型的RNA合成系統(tǒng)，而且也包含dnaA，dnaB，dnaC—D和dnaG基因產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn) M13和ΦX兩者的復(fù)制需要dnaE基因產(chǎn)物，杰夫塔等人認(rèn)為是 DNA 聚合酶Ⅲ（polⅢ）?！保?］

接著又寫道：“在提純復(fù)制 M13和ΦXDNA的酶時，我們發(fā)現(xiàn)提純的polⅢ沒有活性，而是這種酶的一種新型的，大概更復(fù)雜的形式，在此稱之為polⅢ＊的負(fù)責(zé)鏈的生長。一種附加的蛋白質(zhì)，共聚物酶Ⅲ＊（CopolⅢ＊）對于polⅢ＊作用是必不可少的?！保?］

接著敘述了polⅢ＊和CopolⅢ＊復(fù)制系統(tǒng)的提純過程，通過在凝膠電泳中呈現(xiàn)單帶，可以判斷polⅢ＊和CopolⅢ＊是均一的，相對分子質(zhì)量分別為90和77 kDa。

關(guān)于CopolⅢ＊對于polⅢ＊的特殊性，作者寫道：“對于在一條長的單鏈模板，例如RNA引導(dǎo)的ΦX單鏈上polⅢ＊的作用，CopolⅢ＊是必不可少的（表1），但是對于具有短缺口的雙鏈DNA的復(fù)制不是必須的。像從科恩伯格和杰夫塔的研究中所預(yù)期的一樣，用單鏈模板polⅢ是沒有活性的，而CopolⅢ＊沒有影響（表1），CopolⅢ＊既不影響polⅠ的作用，也不影響polⅡ的作用?！保?］

表1 模板和CopolⅢ＊的酶的特殊性

通過凝膠過濾和磷酸纖維素層析，他們從polⅢ分離出polⅢ＊，又從polⅢ＊與polⅢ的比較中，發(fā)現(xiàn)復(fù)制帶有缺口的雙鏈模板顯示了polⅢ＊不同于polⅢ的特征。最后在討論polⅢ＊與polⅢ的聯(lián)系時，他們寫道：“我們對酶促M(fèi)13和ΦX單鏈病毒圓環(huán)轉(zhuǎn)變到雙鏈復(fù)制形式的研究已經(jīng)把DNA聚合酶Ⅲ的新形式顯示為這個酶是造成這個復(fù)制的主要原因。這個稱為polⅢ＊的新酶顯然是以下面方式與polⅢ相聯(lián)系的：（a）dnaE基因的產(chǎn)物，（b）在復(fù)制具有短缺口的雙鏈體模板具有相同的特征（用鹽抑制，用于脫氧核苷三磷酸的高米氏常數(shù)Km的促進(jìn)），（c）通過加熱polⅢ＊轉(zhuǎn)變成polⅢ。polⅢ＊與polⅢ的不同之處是：（a）當(dāng)另一個蛋白質(zhì)CopolⅢ＊也存在時，polⅢ＊具有復(fù)制長的單鏈模板的能力，（b）在瓊脂糖凝膠上和在磷酸纖維素層析上分離這兩種酶的物理特征?！?/p>

接著寫道：“polⅢ＊和CopolⅢ＊也已經(jīng)分離成接近均一的狀態(tài)，人們有可能確定一方面是polⅢ＊和polⅢ之間物理特性的不同，另一方面是polⅢ＊和CopolⅢ＊的相互作用。polⅢ＊可能是由包括polⅢ的核心單位、具有同樣尺寸的亞單位組成的全酶，或者它可能簡單地是polⅢ的多聚的不對稱的形式?！保?］

2.2 DNA聚合酶Ⅲ全酶形式的分離

1974年10月，科恩伯格和他在斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的同事 W.Wickner［7］在《生物化學(xué)雜志》第249卷上發(fā)表題為《DNA聚合酶Ⅲ全酶形式的分離和性質(zhì)》的論文，提出了DNA聚合酶Ⅲ的全酶形式和全酶的亞基結(jié)構(gòu)。

文章一開始作者就敘述了在ssDNA復(fù)制成雙鏈復(fù)制形式的時候，DNA聚合酶Ⅲ＊（polⅢ＊）和共聚物酶Ⅲ＊（CopolⅢ＊）是必不可少的。他們寫道：“DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）是dnaE基因的產(chǎn)物，在ΦX174和M13單鏈病毒DNA（ssDNA）轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制形式時是沒有活性的。然而，這個酶的一種比較復(fù)雜的形式DNA聚合酶Ⅲ＊（polⅢ＊），在附加的蛋白質(zhì)共聚物酶Ⅲ＊（CopolⅢ＊）存在時，能夠催化這個轉(zhuǎn)變。用RNA引導(dǎo)的ssDNA模板作為開始，在這個過程中的第一步是由引物模板，亞精胺（或DNA解鏈蛋白），ATP和兩個蛋白質(zhì)polⅢ＊和CopolⅢ＊組成的初始復(fù)合物的形成。在這一步，ATP分裂成ADP和無機(jī)磷酸。一旦形成這個復(fù)合物，ssDNA復(fù)制成雙鏈復(fù)制形式，就既不需要ATP也不需要CopolⅢ＊。在這個反應(yīng)中，polⅢ不能代替polⅢ＊，在物理性質(zhì)和催化性質(zhì)上polⅢ＊不同于polⅢ，polⅢ＊好像是polⅢ的多聚形式?！保?］

在此基礎(chǔ)上他們概括出DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）的3種形式，寫道：“稱為全酶的DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）的新形式已經(jīng)從慢慢溶解的大腸桿菌提純到明顯的均一性。在它們的不同的物理特征和它們利用主要的單鏈模板的能力的基礎(chǔ)上現(xiàn)在已經(jīng)辨別出polⅢ的3種形式：（a）polⅢ是90 kDa亞基的二聚體，在單鏈環(huán)形的DNA上沒有活性；（b）polⅢ＊是polⅢ的較高的多聚體，只有在具有77 kDa的多肽，共聚物酶Ⅲ＊（CopolⅢ＊）存在時才在ssDNA上具有活性；（c）全酶是具有330 kDa的四體，由兩個polⅢ亞基和兩個CopolⅢ＊亞單位組成，根據(jù)在附加的CopolⅢ＊不存在時在ssDNA上它的活性，把全酶和polⅢ或polⅢ＊區(qū)別開。通過在磷酸纖維素上層析，全酶分離成polⅢ＊和CopolⅢ＊；通過加熱、稀釋或冷卻，polⅢ＊轉(zhuǎn)變成polⅢ。像polⅢ＊一樣，全酶需要ATP以便形成具有引物模板的初始復(fù)合物。”［7］

接著，他們又補(bǔ)充說明，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)polⅢ的第三種形式polⅢ全酶是更天然的形式。用polⅢ全酶復(fù)制ssDNA模板不需要附加的CopolⅢ＊，而類似于在全酶對CopolⅢ＊抗體敏感中和對ATP的依賴中由polⅢ＊和CopolⅢ＊的混合物共同催化。通過在磷酸纖維素上層析，全酶分離成polⅢ＊，dnaE多肽和CopolⅢ＊的四聚體；當(dāng)分離dnaE突變株細(xì)胞時，polⅢ＊是熱敏的。通過冷卻，稀釋或溫和地?zé)崽幚韕olⅢ＊能夠可逆地轉(zhuǎn)變成polⅢ。

亞基（subunit）是蛋白質(zhì)的最小共價單位，它可以由一條多肽鏈或以共價鍵連接在一起的幾條多肽鏈組成。作者在全酶的亞基結(jié)構(gòu)一節(jié)中寫道：“在1%十二烷基硫酸鈉，1%β-硫基乙醇中加熱全酶（10μg）并經(jīng)受聚丙烯酰胺凝膠電泳（圖2）。在90 kDa和77 kDa處看到兩條顯著的蛋白質(zhì)帶。給同樣的凝膠加上2，4和6μg提純的全酶。在用Coomassie藍(lán)著色后，在580 nm處掃描凝膠，切下90和77 kDa的峰顯跡并稱重。當(dāng)對兩個峰的重量比作相對分子質(zhì)量方面的校正時，觀察到了兩個多肽相等的克分子數(shù)的比率（表2）。假定這個90 kDa多肽是polⅢ是dnaE多肽，而77 kDa多肽是CopolⅢ＊?！保?］

圖2 全酶的凝膠電泳（Rf為相對遷移率，OD580為580 nm時的光密度）

表2 在全酶中亞基的比率

為了確定全酶的相對分子質(zhì)量，通過生物凝膠A-5 m柱過濾它并在甘油梯度中沉降，凝膠過濾和甘油梯度沉降兩者表明，全酶相對分子質(zhì)量大于過氧化氫酶（247 kDa），但是小于RNA聚合酶（490 kDa）。在這些數(shù)據(jù)和90與77 kDa多肽的等克分子數(shù)比率（表2）的基礎(chǔ)上，假定全酶是大于二體（167 kDa）而小于六體（501 kDa），因此最可能是具有334 kDa相對分子質(zhì)量由兩個polⅢ多肽和兩個CopolⅢ＊多肽組成的四體。

關(guān)于polⅢ＊和Copol＊Ⅲ的結(jié)構(gòu)，作者敘述道：“已經(jīng)顯示polⅢ＊是由90 kDa的亞基組成和它在具有β－半乳糖甘酶的凝膠過濾上的混合色譜分析。這個polⅢ＊凝膠過濾圖像的未預(yù)料到的寬度可能反映從2個到6個或更多個亞基范圍的寡聚體的存在。甘油梯度沉降對于polⅢ＊給出了一個7.25 S的沉降系數(shù)。這些數(shù)據(jù)對于球形蛋白質(zhì)給出了完全不同的相對分子質(zhì)量；它們是與相對分子質(zhì)量為360 kDa的不對稱分子一致的，表明polⅢ＊是由4個90 kDa多肽組成的四體。CopolⅢ＊大約有77 kDa的相對分子質(zhì)量，是由一個77 kDa的多肽組成的。”［7］

關(guān)于polⅢ＊轉(zhuǎn)變到polⅢ，作者寫道：“根據(jù)復(fù)制長的單鏈區(qū)域模板能力局部的損失和根據(jù)它的凝膠過濾圖像移動到polⅢ判斷，通過溫和地?zé)崽幚韕olⅢ＊能夠轉(zhuǎn)變到polⅢ。來自凝膠過濾和甘油梯度沉降的數(shù)據(jù)表明，polⅢ的相對分子質(zhì)量是與90 kDa dnaE多肽的二聚體一致的?！?/p>

最后，作者討論了全酶的組成，提出了全酶的假想形式。他們寫道：“通過研究單鏈 M13和ΦX174病毒DNA的復(fù)制，我們已經(jīng)觀察到DNA聚合酶Ⅲ的兩種新形式，它們在物理上和功能上與以前描述的polⅢ是有區(qū)別的。這個新形式具有polⅢ利用帶有間隙的雙鏈模板的能力，但是又能夠復(fù)制一個延伸的單鏈DNA。在這個報告中敘述的形式，大概是接近于在體內(nèi)起作用的聚合酶形式。它表示在細(xì)胞的平緩的溶胞產(chǎn)物中辨認(rèn)的所有polⅢ，它是由兩個90 kDa聚合酶組成的多肽和兩個77 kDa共聚物酶的多肽組成的四聚體蛋白質(zhì)（圖3）。通過在磷酸纖維素上的層析（phosphocellulose chromatography）能夠把全酶分解成這些組分。這個“核心”聚合酶活性以前被分解成稱為聚合酶Ⅲ＊的polⅢ多肽一個寡聚體（大概是四聚體）；這個稱為共聚物酶Ⅲ＊的共聚物酶對于在單鏈上polⅢ＊的活性是必不可少的。對于polⅢ＊和共聚物酶Ⅲ＊的復(fù)合物，我們使用全酶的術(shù)語是基于它與核心聚合酶和組成RNA聚合酶的σ亞基的復(fù)合物類似。像σ亞基一樣，共聚物酶Ⅲ＊適用于形成具有模板的復(fù)合物的初始階段，但是在復(fù)制自己的過程中好像是不必要的?！保?］

圖3 聚合酶Ⅲ的假設(shè)形式

最后，作者提出了全酶的催化機(jī)制問題。他們寫道：“在大腸桿菌染色體的復(fù)制中，polⅢ的幾種形式的催化活性還沒有弄清楚。我們對在催化中這些酶的結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)，聚合酶和共聚物酶單位開始時在引物模板上形成一個復(fù)合物。仍然不確定的是蛋白質(zhì)的化學(xué)計量法和在這個復(fù)合物中它們的空間排列，它們或者起著全酶的作用，或者以polⅢ＊-CopolⅢ＊對某種其他的形式起作用。即使在和緩的溶胞產(chǎn)物中所有聚合酶Ⅲ好像是polⅢ全酶，這個復(fù)合物仍然可能與細(xì)胞中附加的復(fù)制成分有聯(lián)系?！保?］

3 DNA聚合酶Ⅲ全酶亞基的分離

1977年科恩伯格等人從大腸桿菌提純出DNA聚合酶Ⅲ全酶，并分離出α，β，γ和δ亞基。全酶中包含的γ和δ亞基是以前沒有觀察到的。1979年德克薩斯醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)和分子生物系C.Mchenry和W.Crow從提純的DNA聚合酶Ⅲ全酶分離出ε和θ亞基。于是，DNA聚合酶Ⅲ全酶至少包含了6個不同的亞基。1982年C.Mchenry從提純的DNA聚合酶Ⅲ全酶分離出τ亞基。1988年科恩伯格和他的同事確立了DNA聚合酶Ⅲ全酶是由10個亞基組成，除前面談到的7個亞基外，其他3個亞基是δ′，χ和Ψ。

3.1 DNA聚合酶全酶α，β，γ和δ亞基的分離

1977年科恩伯格和德克薩斯醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)和分子生物系C.Mchenry［8］在《生物化學(xué)雜志》第252卷上發(fā)表題為《大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的提純和分離成亞基》的論文。報告了他們從大腸桿菌HMS-83中已經(jīng)提純出DNA聚合酶Ⅲ全酶，用于試驗(yàn)時，把大腸桿菌噬菌體G4單鏈DNA轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制形式。通過磷酸纖維素層析從全酶分離出相對分子質(zhì)量分別為140，40，52和32 kDa的α，β，γ和δ亞基，并指出這個α亞基是DNA聚合酶Ⅲ，dnaE基因的產(chǎn)物，而亞基β類似于共聚物酶Ⅲ＊（CopolⅢ＊）。這個全酶與以前從大腸桿菌H560中分離的，在磷酸纖維素層析上能夠分離成包含polⅢ亞基和CopolⅢ＊的共聚物類似。但是，全酶中包含的γ和δ亞基是以前沒有觀察到的。［8］

在“全酶的組分”一節(jié)中敘述了全酶的分離和全酶組分亞基的識別。他們使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離聚合酶并測定其相對分子質(zhì)量。他們在“全酶的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳”一段中寫道：“用重氮化的［35S］磺酸標(biāo)記全酶（0.2μg），變性后，在聚丙烯酰胺凝膠上電泳顯示出4條蛋白質(zhì)帶。已經(jīng)證明它們是為引導(dǎo)G4模板延伸所需要的組分。這個140 kDa蛋白質(zhì)（α）大概是polⅢ，dnaE基因的產(chǎn)物。其他人已經(jīng)提純polⅢ，發(fā)現(xiàn)它基本上是包含了這個量值的組分。第2個40 kDa的亞基β可能是以前分離的CopolⅢ＊，被認(rèn)為是77 kDa的多肽。兩個組分γ和δ（相對分子質(zhì)量分別為52和32 kDa）已經(jīng)提純?yōu)橐粋€α和β作用所需要的復(fù)合物?；趯Ζ?，β-，γ－和δ－帶的光密度計掃描，這個全酶制劑至少60%的提純是這4個亞基的含量。還存在83和25 kDa兩個附加的蛋白質(zhì)，在提純到這個程度的整個過程中它們?nèi)匀慌c全酶牢固地聯(lián)系在一起，在甘油梯度中帶著全酶活性沉降。”［8］

最后，他們指出：“DNA聚合酶Ⅲ全酶不是一個物理上的整體，它的活性來源于4個分離的蛋白質(zhì)的混合物?！保?］

3.2 DNA聚合酶全酶ε，θ，τ亞基的分離

1979年德克薩斯醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)和分子生物系C.Mchenry等［9］在《生物化學(xué)雜志》第254卷上發(fā)表題為《大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ亞基的提純和識別》的論文。文章指出，這個DNA聚合酶Ⅲ全酶的核心已經(jīng)從大腸桿菌HMS-83中提純28 000倍到97%的均一性。這個酶包含相對分子質(zhì)量分別為140，25和10 kDa的α，ε和θ亞基。這個α亞基以前已經(jīng)表示為DNA聚合酶Ⅲ和更為復(fù)雜的DNA聚合酶Ⅲ全酶兩者的組分。在此證實(shí)ε和θ亞基也是DNA聚合酶Ⅲ全酶的亞基。于是，DNA聚合酶Ⅲ全酶至少包含了6個不同的亞基。在這篇論文中作者報告了DNA聚合酶Ⅲ提純到均一性和DNA聚合酶Ⅲ和DNA聚合酶Ⅲ全酶兩者的兩個補(bǔ)充亞基的識別。［9］

1982年C.Mchenry［10］在《生物化學(xué)雜志》上發(fā)表題為《DNA聚合酶Ⅲ′的提純和特征與DNA聚合酶Ⅲ全酶的τ亞基的識別》的論文。在這篇論文中作者指出：“DNA聚合酶Ⅲ′是DNA聚合酶Ⅲ的新形式，已經(jīng)從大腸桿菌K12株提純15 000倍到90%的均一性。DNA聚合酶Ⅲ′是DNA聚合酶Ⅲ全酶4個亞基的組件，它具有在核心DNA聚合酶Ⅲ和全酶之間的功能和物理性質(zhì)。在變性條件下完成的聚丙烯酰胺凝膠電泳表明DNA聚合酶Ⅲ′是DNA聚合酶Ⅲ的α，ε和θ亞基和新測定的DNA聚合酶全酶的τ亞基（Mτ＝83 kDa）的復(fù)合物。通過凝膠過濾和磷酸纖維素層析從DNA聚合酶Ⅲ′分離DNA聚合酶Ⅲ。所有酶形式能夠利用包含短間隙的雙鏈體模板。DNA聚合酶Ⅲ′像DNA聚合酶Ⅲ全酶一樣，在存在5 mM（毫摩爾）亞精胺時能夠在長的單鏈模板上合成DNA；而DNA聚合酶Ⅲ不能夠。在G4自然復(fù)制系統(tǒng)中DNA聚合酶Ⅲ′沒有作用，而DNA聚合酶Ⅲ全酶是有活性的。相對分子質(zhì)量和亞基的化學(xué)計量法確定DNA聚合酶Ⅲ′包含兩個單位的核心DNA聚合酶Ⅲ和兩個τ亞基。”［10］

作者又指出：“在這篇論文中，我報告了一種同樣定義的，其功能和結(jié)構(gòu)介于DNA聚合酶Ⅲ和DNA聚合酶Ⅲ＊之間的聚合酶形式的提純和特征。它的提純已經(jīng)導(dǎo)致新的全酶亞基τ的測定和這個亞基對全酶反應(yīng)的貢獻(xiàn)部分的理解?！保?0］

在介紹了DNA聚合酶Ⅲ′的提純后，作者敘述了新的全酶亞基τ的測定。他寫道：“變性DNA聚合酶Ⅲ′的級分Ⅵ（10μg），并在SDS 聚丙烯酰胺凝膠上電泳，出現(xiàn)為140，83，25和10 kDa的4條主要的蛋白質(zhì)帶（圖4）。最大的和兩個最小的組分是核心DNA聚合酶Ⅲ的亞基，稱為τ的第4個組分（83 kDa）不是核心聚合酶的一部分。光密度計掃描表明α∶τ的比率是1∶1.1，在不同的制劑中兩個較小的亞基ε和θ的比率在1和2之間改變。由于結(jié)合到很不同的相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)的染料的變化，我將不測定ε和θ的化學(xué)計量。光密度計掃描也表明DNA聚合酶Ⅲ制劑提純到90%”。［10］

圖4 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的光密度掃描（縱坐標(biāo)為光密度，橫坐標(biāo)為組分?jǐn)?shù)）

接著作者敘述了在DNA聚合酶Ⅲ全酶中τ亞基的存在，他寫道：“DNA聚合酶Ⅲ′的τ亞基存在于高度提純的DNA聚合酶Ⅲ全酶中（圖4）。τ與存在于所有全酶制劑中的83 kDa組分一起遷移。使用的全酶級分是可能得到的高度提純的制劑。它用的提純程序顯然不同于DNA聚合酶Ⅲ′使用的提純程序。基于這個信息和下面要指出的功能信息，τ被確定為DNA聚合酶Ⅲ全酶的亞基。于是，DNA聚合酶Ⅲ′是4個全酶亞基的組件。”［10］

3.3 DNA聚合酶Ⅲ全酶的組成

1988年，科恩伯格和他在斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的同事H.Maki等［11］在《生物化學(xué)雜志》第249卷上發(fā)表題為《大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶Ⅳ：全酶是一個具有成對活性部位的不對稱的二聚體》的論文。一開始他們概述了DNA聚合酶Ⅲ全酶的組成。他們指出：polⅢ＊是只缺少輔助的β亞基的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的組件，已經(jīng)通過改進(jìn)的程序提純到均一。這個組件是由9個不同的多肽組成的。在凝膠過濾上這個組件相當(dāng)于大約為800 kDa的粒子，表示每種亞基含有兩個。保留β亞基（37 kDa）以及在polⅢ＊中的所有亞基；全酶的相對分子質(zhì)量估計是900 kDa。基于這些數(shù)據(jù)，斷定polⅢ全酶是具有成對的polⅢ核心活性部位和兩個不同組的輔助亞基的一個不對稱的二聚體，以便用來達(dá)到前導(dǎo)鏈和后續(xù)鏈二者基本上并行復(fù)制。

接著，作者介紹了DNA聚合酶Ⅲ的三個分離形式，寫道：“DNA聚合酶Ⅲ的三個分離形式很可能是全酶的組合件。由α，ε和θ亞基組成的核心（polⅢ）有一個165 kDa估計的相對分子質(zhì)量。它缺少連續(xù)合成的能力，但是保持了催化功能：在α亞基中聚合酶活性和在ε亞基中3′→5′外切核酸酶活性。第二種形式polⅢ′，包括核心和τ亞基。由于410 kDa的反常的量值，對于這個復(fù)合物提出二聚體結(jié)構(gòu)。polⅢ＊是缺少β的全酶，這個亞基對于連續(xù)性是關(guān)鍵的?；?60 kDa或540 kDa的相對分子質(zhì)量，polⅢ＊好像是polⅢ′和其他輔助亞基的混合物。解釋全酶為何具有與polⅢ′一樣相同的沉降系數(shù)是困難的。由于β亞基的低親和性，甚至在ATP穩(wěn)定的存在中全酶與polⅢ＊的聯(lián)系也是不清楚的。”［11］

在這篇文章中，他們報告了polⅢ＊和全酶的新的提純程序，并弄清楚兩種復(fù)合物的一些特征。polⅢ＊大約具有800 kDa的相對分子質(zhì)量，包含9個不同的很可能是相同相對分子質(zhì)量的多肽。全酶分離為具有兩個β二聚體的polⅢ＊的復(fù)合物，具有900 kDa的相對分子質(zhì)量?；谶@些量值和從亞基重新構(gòu)成的復(fù)合物的分解，斷定polⅢ＊和全酶兩者是具有輔助亞基非對稱分布的二聚型（圖5）。這種結(jié)構(gòu)可能提供在復(fù)制叉處具有催化前導(dǎo)鏈和后續(xù)鏈并行合成的能力。

4 DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)與功能

圖5 polⅢ全酶假定的結(jié)構(gòu)

1995年康奈爾大學(xué)微生物系的Z.Kelman教授等［12］在《生物化學(xué)年度評論》中發(fā)表題為《DNA聚合酶Ⅲ全酶：染色體復(fù)制機(jī)制的結(jié)構(gòu)和功能》的論文，全面評述了DNA聚合酶Ⅲ全酶的結(jié)構(gòu)與功能。DNA聚合酶Ⅲ全酶是能夠進(jìn)行引物鏈的延伸并完成DNA的前導(dǎo)鏈和后續(xù)鏈合成的酶。全酶是一個多亞基酶。他們發(fā)現(xiàn)全酶在DNA合成上特別迅速，大約每秒合成750個核苷酸，與在大腸桿菌中觀察到的復(fù)制叉運(yùn)動速率是一致的，比polⅠ的每秒合成10～20個核苷酸的速率快。這樣快的速率來自于全酶的高度持續(xù)的合成能力。

全酶合成DNA的高速度和連續(xù)性是與它由多亞基組成分不開的。在“全酶粒子”一節(jié)中作者指出：“現(xiàn)在已經(jīng)完成編碼全酶10個亞基的所有基因的識別，這些蛋白質(zhì)的過度表達(dá)和提純，以及從它們重新構(gòu)成全酶。在表3中按順序列出了10個不同的亞基，表明亞基以各種各樣全酶的組件形式存在。核心聚合酶由α，ε和θ亞基組成。polⅢ′組件由兩個核心酶和一個τ二聚體組成。在一個分子結(jié)構(gòu)中兩個聚合酶的存在支持這個假設(shè)，為了協(xié)調(diào)一個雙鏈體染色體的雙鏈的復(fù)制，復(fù)制的聚合酶要成對地起作用。polⅢ＊組件包含了9個不同的亞基，它只缺少β亞基?；诎褋喚罚瑂sDNA結(jié)合蛋白（SSB蛋白），乙醇加到試驗(yàn)中或者把鹽加到實(shí)驗(yàn)中能夠識別每個組件的聚合酶活性。一般來說，當(dāng)聚合酶亞基的復(fù)雜性增加時，聚合酶變得更有連續(xù)性，但是全酶很高的速度和連續(xù)性絕對需要β夾子（clamp）。這5個亞基的γ復(fù)合物是把水解的ATP結(jié)合到引物DNA上的載荷β夾子的媒介物?！保?2］

表3 DNA聚合酶Ⅲ全酶的亞基和組件

4.1 核心聚合酶

在1995年Kelman文章的“核心聚合酶”一節(jié)中介紹了核心聚合酶的構(gòu)成與功能。他寫道：“核心包含DNA聚合酶和校對外切核酸酶活性。在這個細(xì)胞中大約有40個核心分子，因此只有一半組裝進(jìn)全酶。核心的3個亞基牢固地聯(lián)結(jié)在一起，缺少變性不能分解。通過基因的使用提供了各個亞基。α的研究表明它是DNA聚合酶，具有每秒合成8個核苷酸的速率，但是它缺少外切核酸酶活性。這個分離的ε亞基是強(qiáng)有力的3′→5′外切核酸酶。這個α和ε亞基形成牢固的1∶1的復(fù)合物，導(dǎo)致聚合酶活性和外切核酸酶活性兩者的增加。由ε水解ssDNA的速率類似于由核心水解ssDNA的速率，但是對于有效的活性由ε水解雙鏈DNA需要α。大概識別α位置的引物模板攜帶著與配對堿基3′端接觸的ε。除了在錯配T-G堿基對上ε活性的微小激勵外，還發(fā)現(xiàn)了θ的功能。這個θ亞基結(jié)合ε而不是α，從而提出在核心中α－ε－θ的線型排列，而結(jié)構(gòu)分析顯示了每個亞基的單個拷貝?！保?2］

接著作者指出了核心酶合成DNA的速率和連續(xù)性。他寫道：“核心以大約每秒20個核苷酸的速率合成DNA，具有復(fù)制11個核苷酸的連續(xù)性，類似于polⅠ。然而在單個ssDNA病毒引物模板上，核心是已知的最微弱的聚合酶。無論怎樣加上許多核心或等待多長時間，核心都不能延伸環(huán)繞自然模板的獨(dú)特的完整的引物圓環(huán)。大概某些DNA結(jié)構(gòu)阻礙由核心引起的鏈的延伸?！保?2］

作者又補(bǔ)充寫道：“在核心的附屬蛋白質(zhì)存在時，核心成為了最快的聚合酶。在ε不存在時，α受附屬蛋白質(zhì)的激勵，但是持續(xù)合成能力降到500～1 500個核苷酸，而實(shí)際的速率是核心速率的一半。帶有附屬蛋白質(zhì)的這個αε復(fù)合物具有像核心一樣的復(fù)制速率和連續(xù)性。因此，ε對全酶的速率和持續(xù)作用能力有影響，不只是對精確度有影響。在其他方面，θ對αε的效率沒有影響。”［12］

4.2 ε亞基的外切核酸酶活性

1984年加利福尼亞大學(xué)分子生物系教授R.Scheuermann和 H.Echols［13］在《美國國家科學(xué)院院報》上發(fā)表題為《DNA復(fù)制的一個獨(dú)立編輯的外切核酸酶：大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的ε亞基》論文。文章一開始就闡述了確保復(fù)制精確度的機(jī)制。寫道：“大腸桿菌基因組的復(fù)制是一個特別精確的過程。每個堿基復(fù)制錯誤的頻率一般是10－9～10－10。這樣高的精確度被認(rèn)為是通過多級過程出現(xiàn)的：（1）在初始的5′→3′結(jié)合中互補(bǔ)堿基的選擇；（2）在生長點(diǎn)非互補(bǔ)堿基的外切核酸溶解的3′→5′刪除；（3）復(fù)制后錯配的修復(fù)。這些步驟的總和能夠達(dá)到觀察的精確性。DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）全酶是在大腸桿菌中鏈的延伸中包含的主要的酶，因此很可能是精確度的主要決定因素。為了研究在DNA復(fù)制中的保真機(jī)制和探索控制精確度的可能性，我們一直試圖確定polⅢ亞基對堿基選擇和刪除的貢獻(xiàn)?！保?3］

接著，他們分析了全酶核心的活性，并提出了3′→5′外切核酸酶活性定位在哪個亞基上的問題。寫道：“polⅢ全酶至少有7個亞基：α，ε，θ，τ，γ，δ和β。以自然形式制備的polⅢ全酶的最小組件是包含α，ε和θ亞基的polⅢ核心；α是dnaE基因的產(chǎn)物，而ε是dnaQ基因的產(chǎn)物。polⅢ核心帶有polⅢ全酶的聚合酶和3′→5′外切核酸酶活性。具有用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的亞基的酶測定表明這個大的α亞基具有聚合酶活性，也可能帶有3′→5′外切核酸酶活性。然而，已經(jīng)從觀察到dnaQ基因中增變突變（mutator mutation）使polⅢ全酶在刪除的外切核酸酶中存在缺陷，推斷在3′→5′外切核酸酶（和復(fù)制精確度）中ε的重要作用?！保?3］

隨后，他們敘述了通過ε亞基的過度表達(dá)和提純，證實(shí)ε亞基具有外切核酸酶活性。寫道：“為了確定在由polⅢ外切核酸裂解刪除中ε的作用，我們要從多亞基的polⅢ全酶的其他亞基分別地研究ε。為了提供過量的ε和使它的提純?nèi)菀?，我們使用了過量的菌株，在強(qiáng)有力啟動子，噬菌體λ的左側(cè)區(qū)域轉(zhuǎn)錄啟動子和有效的核糖體結(jié)合區(qū)域的控制下表達(dá)dnaQ基因。我們已經(jīng)把polⅢ的ε亞基提純到均一性。我們發(fā)現(xiàn)ε帶有類似于提純的polⅢ核心酶特征的3′→5′外切核酸酶活性。于是，polⅢ全酶的刪除和聚合作用活性存在于不同的亞基中。”［13］

4.3 β亞基滑動夾子的功能

1992年5月，洛克菲勒大學(xué)分子生物物理實(shí)驗(yàn)室X.Kong等［14］在Cell第69卷上發(fā)表題為《大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的β亞基的三維結(jié)構(gòu)：滑動的DNA夾子》的論文。說明當(dāng)把其余的機(jī)構(gòu)夾到模板上時，β亞基是一個沿著DNA滑動的環(huán)形蛋白質(zhì)，其他亞基共同起著把這個環(huán)裝配到DNA上的撮合者的作用。在文章的摘要中他們首先概述了這個結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，寫道：“已經(jīng)以2.5?的分辨距離確定了DNA聚合酶Ⅲ全酶的β亞基的晶體結(jié)構(gòu)。β亞基的二聚體（M＝2×40.6 kDa，2×366個氨基酸殘基）形成了用12個能環(huán)繞雙鏈體DNA的α螺旋嵌入的環(huán)形結(jié)構(gòu)。這個結(jié)構(gòu)是高度對稱的，具有包含三個相同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域的每個單體。這些螺旋的電荷分布和定位表明通過形成能夠在DNA上滑動的牢固的夾子，這個分子起著生物化學(xué)的作用。提出在β亞基和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA，真核生物聚合酶δ和ε持續(xù)合成能力因子），和噬菌體T4DNA聚合酶的基因45蛋白質(zhì)之間可能的結(jié)構(gòu)聯(lián)系?！保?4］

在文章的“引言”中，概述了polⅢ全酶各個亞基的作用。寫道：“未受損害的polⅢ全酶至少具有10個不同的蛋白質(zhì)亞基（α，ε，θ，τ，γ，δ，δ′，χ，Ψ 和β）。這個α亞基完成催化的聚合酶功能，而ε亞基是3′→5′外切核酸酶。這個包含了全酶的α，ε，和θ的3個亞基核心聚合酶組件，雖然它能夠插進(jìn)短的單鏈區(qū)域，但不可能獨(dú)自地連續(xù)地起作用。按照核心聚合酶與β亞基和5個蛋白質(zhì)的γ復(fù)合物（γ，δ，δ′，χ和 Ψ）的混合能夠重新構(gòu)成全酶的高度連續(xù)性特征。這個連續(xù)性聚合酶的重組是在兩個不同的階段進(jìn)行的（圖6）：在第一階段，這個γ復(fù)合物水解ATP，以便把β亞基轉(zhuǎn)移到引物模板；在第二階段，具有在DNA上的β亞基的核心聚合酶組件形成連續(xù)性的聚合酶。于是，β亞基把值得注意的連續(xù)性給予核心聚合酶。對為了組裝連續(xù)性的聚合酶所需要的最小亞基數(shù)的研究表明，為了把β從溶液轉(zhuǎn)移到引物模板只需要γ復(fù)合物的γ和δ亞基。對于連續(xù)的聚合作用需要作為αε復(fù)合物的兩個亞基α和ε。只要在DNA上的β亞基使αε聚合酶具有完整的連續(xù)性性能，γ復(fù)合物便接著被排除。”［14］

圖6 連續(xù)性聚合酶的兩階段組合

下面敘述了在DNA復(fù)制過程中β亞基，γ復(fù)合物與引物模板之間的相互作用。寫道：“一旦γ復(fù)合物完成把β亞基夾緊在DNA上的操作，β亞基就很牢固地被束縛在那里，它就不能很容易地與圓環(huán)DNA分離。然而，已經(jīng)顯示出它沿著雙鏈體DNA自由地滑動，與它把聚合酶核心束縛到模板上，在復(fù)制中與聚合酶一道運(yùn)動，起著夾子的作用是一致的。使用限制性內(nèi)切核酸酶的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)揭示，在β亞基被夾緊之后，如果圓環(huán)DNA被切割，β亞基就滑動到斷裂位置并跌落下來，完全與DNA分離。這些與在同樣的研究中有關(guān)的實(shí)驗(yàn)所表明的，與位置特異性結(jié)合蛋白，諸如轉(zhuǎn)錄因子或核酸酶形成特殊的氫鍵或其他的與DNA穩(wěn)定的相互作用不同，β亞基被束縛到DNA上主要是由于它的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而不是穩(wěn)定的相互作用。已經(jīng)提出β亞基可能形成一個閉合的環(huán)，γ復(fù)合物的一種作用可能是打開然后關(guān)閉這個環(huán)繞DNA的環(huán)，有效地把β亞基夾在DNA上?！保?4］

接著介紹了β亞基的三維結(jié)構(gòu)。寫道：“作為朝著polⅢ全酶連續(xù)性質(zhì)的分子基礎(chǔ)的詳細(xì)理解的一步，我們已經(jīng)使β亞基結(jié)晶，通過在2.5?分辨距離下的X射線衍射確定了它的三維結(jié)構(gòu)。在與以前的推測一致感到滿意時，我們發(fā)現(xiàn)這個結(jié)構(gòu)的確是閉合的環(huán)，整個形狀類似于油煎圈餅或環(huán)形線圈的形狀（圖7）?！保?4］

圖7 滑動的β亞基的三維結(jié)構(gòu)

在“結(jié)果和討論”一節(jié)中，作者具體介紹了β亞基二聚體的結(jié)構(gòu)。寫道：“這個β亞基在晶體中形成頭 尾二聚體，與以前觀察的這個在溶液中分離的蛋白質(zhì)是二聚體一致的。這個二聚體的多肽主鏈的圖像顯示在圖7a中?？偟慕Y(jié)構(gòu)是直徑大約為80?的星形環(huán)在中央具有一個直徑大約為35?的孔洞。這個雙重的二聚體的軸垂直于環(huán)面，環(huán)的厚度大約是雙鏈體B 形式DNA一整圈的大?。s34?）。”［14］圖7b表示T4噬菌體DNA夾是gp45蛋白的三聚體。1994年 X.Kong等［15］又在Cell第79卷上發(fā)表題為《真核生物DNA聚合酶持續(xù)合成能力因子細(xì)胞周期蛋白（PCNA）的晶體結(jié)構(gòu)》的論文，報告了他們的真核滑動DNA夾子是PCNA蛋白的三聚體（圖7c）。

4.4 γ復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能

在1995年Kelman文章的“作為復(fù)制機(jī)器的DNA聚合酶Ⅲ全酶”一節(jié)中介紹了γ復(fù)合物的構(gòu)成與功能。敘述了β圓環(huán)從γ復(fù)合物到核心的轉(zhuǎn)換。寫道：“為了持續(xù)合成這個γ復(fù)合物必須把環(huán)形β亞基結(jié)合到引物端上的組件，而核心必須與β亞基相互作用。因?yàn)楹诵暮挺脧?fù)合物兩者都識別引物模板結(jié)合處，它們可能與β環(huán)的同一個面相互作用（圖8）。比較來自7種不同的細(xì)菌的基因序列編碼表明，多數(shù)保守的殘基只處在一個面上：這個面包含兩個C端?！保?0］如圖8所示，全酶包含結(jié)合到τ二聚體兩個核心聚合酶和一個γ復(fù)合物夾子裝載器。這個γ復(fù)合物與β二聚體的C端相互作用，大概β的這個面朝著引物位置。像γ復(fù)合物一樣，核心與β上相同的C端殘基相互作用。因此，這個γ復(fù)合物在把β裝載到DNA上之后，這個核心可能進(jìn)入帶有β夾子的位置。在這個全酶中通過與τ的相互作用使γ復(fù)合物抓牢帶有核心和β的DNA。［12］

圖8 核心和γ復(fù)合物與β環(huán)同一面的相互作用

作者又問道：“為何核心和γ復(fù)合物在β上具有交疊結(jié)合位置？”他回答說：“這個γ復(fù)合物不只是把β裝載到DNA上，而且也從DNA上卸下β夾子。因此，這個雙重性的裝置能夠確保當(dāng)核心用β延伸DNA時，它防止γ復(fù)合物從DNA上卸下β?！保?2］

作者接著寫道：“使用組件（γ復(fù)合物，核心和β）的研究引起了這種想法，因?yàn)棣脧?fù)合物起催化作用，在鏈的延伸過程中在DNA上只存在核心和β。事實(shí)上γ復(fù)合物和核心在β二聚體上交疊結(jié)合的位置是與這個觀點(diǎn)一致的。然而，使用整個全酶的研究表明，這個γ復(fù)合物在DNA上仍然具有核心和β。在這個全酶中，τ作為核心和γ復(fù)合物之間的橋梁，使它們保持在一起。像圖8所示，這種結(jié)構(gòu)可以容許β從γ復(fù)合物位置改變到核心位置。把γ復(fù)合物的催化夾子裝載活性放在復(fù)制叉處的適當(dāng)位置，通過與全酶不變的聯(lián)系，對于在后隨鏈上許多初始事件將是有利的?！保?2］

（2012年1月3日收到）

［1］DE LUCIA P，CAIRNS J.Isolation of an E.coli strain with a mutation affecting DNA polymerase［J］.Nature，1969，224（5225）：1164-1166.

［2］GROSS J，GROSS M.Genetic analysis of an E.coli strain with a mutation affecting DNA polymerase［J］.Nature，1969，224（5225）：1166-1168.

［3］阿瑟·科恩伯格著.酶的情人：一位生物化學(xué)家的奧德賽 ［M］.崔學(xué)軍，等，譯.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2004：245.

［4］GEFTER M L，HIROTA Y，KORNBERG T，et al.Analysis of DNA polymerasesⅡandⅢin mutants ofEscherichiacolithermosensitive for DNA synthesis［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1971，68（12）：3150-3153.

［5］WEAVER R F.Molecular biology［M］.3th ed.Boston：McGraw-Hill，2004：687-691.

［6］WICKNER W，SCHEKMAN R，GEIDER K，et al.A new form of DNA polymeraseⅢand a copolymerase replicate a long，single-stranded primer-template［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1973，70（6）：1764-1767.

［7］WICKNER W，KORNBERG A.A holoenzyme form of deoxyribonucleic acid polymeraseⅢisolation and properties［J］.The Journal of Biological Chemistry，1974，249：6244-6249.

［8］MCHENRY C，KORNBERG A.DNA polymerase ofEscherichia colipurification and resolution into subunits［J］.The Journal of Biological Chemistry，1977，252：6478-6484.

［9］MCHENRY C S，CROW W.DNA polymeraseⅢofEscherichia colipurication and identification of subunits［J］.The Journal of Biological Chemistry，1979，254：1748-1753.

［10］MCHENRY C S.Purification and characterization of DNA polymeraseⅢ.Identification ofτas a subunit of the DNA polymeraseⅢ holoenzyme［J］.The Journal of Biological Chemistry，1982，257：2657-2663.

［11］MAKI H，MAKI S，KORNBERG A.DNA polymeraseⅢholoenzyme ofEscherichiacoliⅣ.The holoenzyme is an asymmetric dimer with twin active sites［J］.The Journal of Biological Chemistry，1988，263：6570-6578.

［12］KELMAN Z，O′DONNELL M.DNA polymeraseⅢholoenzyme：structure and function of a chromosomal replicating machine［J］.Annu Rev Biochem，1995，64：171-200.

［13］SCHEUERMANN R H，ECHOLS H.A separate editing exonuclease for DNA replication：theεsubunit ofEscherichiacoliDNA polymerase Ⅲ holoenzyme［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1984，81：7747-7751.

［14］KONG X，ONRUST R，O＇DONNELL M，et al.Three-dimensional structure of theβsubunit of E.coli DNA polymeraseⅢholoenzyme：a sliding DNA clamp［J］.Cell，1992，69（3）：425-437.

［15］KRISHNA T，KONG X，CARY S，et al.Crystal structure of the eukaryotic DNA polymerase processivity factor PCNA.1994，79（7）：1233-1243.

Discovery of Function and Structure of Deoxyribonucleic Acid PolymeraseⅢHoloenzyme

XIANG Yi-he
Professor，DepartmentofPhysics，TsinghuaUniversity，Beijing100084，China

The process of finding the structure and the function of DNA polymeraseⅢholoenzyme are introduced.The key events include that the discovery of DNA polymeraseⅢandⅢ＊，the proposition of DNA polymeraseⅢholoenzyme，the separation of holoenzyme subunit，the function of core polymerase，the 3→5 exonuclease activity ofεsubunit，the function ofβsubunit sliding clamp andγcomplex.

DNA polymeraseⅢ，DNA polymeraseⅢ＊，CopolymeraseⅢ＊，core polymerase，εsubunit，βsubunit sliding clamp，γ complex

10.3969／j.issn.0253-9608.2012.04.008

（編輯：段艷芳）