Er(Ⅲ)對油菜線粒體的作用

汪冬芳，江博，閆寶亨，劉瑞強，周琴，李大彬，戴捷，*

1. 長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，荊州 434023 2. 湖北省生態(tài)環(huán)境廳荊州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，荊州 434000

稀土元素因其獨特的理化特征，而廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、電子、鋼鐵和醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。研究表明，較低濃度的稀土元素能夠促進種子發(fā)芽，刺激植物根部生長，提高農(nóng)作物的抗性，進而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，而高濃度稀土離子將對農(nóng)作物生長產(chǎn)生抑制作用[2-3]。隨著環(huán)境污染的日趨嚴重以及稀土微肥的廣泛使用，土壤中稀土離子含量不斷提高，對植物產(chǎn)生毒害作用，并通過食物鏈進入人體，對人類健康構(gòu)成威脅，因此有必要探究稀土元素對植物的影響[4]。

線粒體是細胞進行的有氧呼吸場所，為細胞的各項生命活動提供能量。此外，線粒體還可調(diào)控細胞程序化死亡，對細胞代謝產(chǎn)生重要影響[5]。研究表明，鑭、鈰和釓等稀土離子對水稻離體線粒體代謝及呼吸功能表現(xiàn)出抑制作用，高濃度稀土甚至導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜破裂[6]；Dai等[7]的研究表明，稀土鑭和鈰在低濃度時經(jīng)體內(nèi)途徑對水稻線粒體代謝活性有促進作用，但高濃度則產(chǎn)生抑制作用。關(guān)于稀土元素對線粒體的影響的研究大多集中于輕稀土和中稀土，而對重稀土的研究工作較少。Li等[8]的研究表明，安徽省土壤中鉺(Er)含量達到了3.88 mg·kg-1，相對其土壤背景值增加了61.6%，較高濃度的Er會對動植物產(chǎn)生不利影響，本研究重點關(guān)注Er(Ⅲ)與植物的相互作用。

以油菜線粒體為對象，采用光譜法和Clark氧電極法研究重稀土離子Er(Ⅲ)對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的影響，并且采用透射電子顯微鏡(TEM)表征了不同濃度Er(Ⅲ)作用下線粒體的微觀結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

BPN-50CH(UV)恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，中國)；TGL-20M高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，中國)；UV-6100S雙光束紫外-可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司，中國)；LS-55熒光光度計(Perkin Elmer，美國)；Clark溶氧電極系統(tǒng)(Pnsatech Instruments Ltd.，英國)；移液器(Eppendorf，德國；BioHit，芬蘭)；Sartorius普及型pH計(Sartorius，德國)；微量進樣器(海高鴿工貿(mào)有限公司，中國)；JEM-100CXⅡ透射電子顯微鏡(日本電子公司)等。

蔗糖、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)、L-半胱氨酸、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、甘露醇、六水合氯化鎂、磷酸二氫鉀、六水合丁二酸鈉、乙酸鉀、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、硝酸鉀、氯化鉀、β-巰基乙醇、六水合氯化鉺、牛血清白蛋白(BSA)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPs)魚藤酮、纈氨霉素、二磷酸腺苷(ADP)和血卟啉(HP)等購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

研磨緩沖液(pH=7.5)：0.5 mol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl、5 mmol·L-1EDTA、0.1% BSA和5 mmol·L-1β-巰基乙醇。洗滌緩沖液(pH=7.5)：0.5 mol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl和10 mmol·L-1MgCl2溶液。懸浮緩沖液(pH=7.5)：0.6 mol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1Tris-HCl和20 mmol·L-1EDTA。Buffer C (pH=7.5)：250 mmol·L-1蔗糖、20 mmol·L-1HEPES、2 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-1KH2PO4、20 mmol·L-1丁二酸鈉和1 μmol·L-1魚藤酮。呼吸耗氧溶液(pH=7.5)：100 mmol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1Tris、10 mmol·L-1MOPs、1 mmol·L-1Na2EDTA、2 mmol·L-1MgCl2、50 mmol·L-1KH2PO4和4 μmol·L-1魚藤酮。H+滲透性溶液：135 mmol·L-1乙酸鉀、5 mmol·L-1HEPES、0.1 mmol·L-1EGTA、0.2 mmol·L-1Na2EDTA、1 μg·mL-1纈氨霉素和2 μmol·L-1魚藤酮，溶液調(diào)至pH=7.1。K+滲透性溶液：13.5 mmol·L-1KNO3、5 mmol·L-1HEPES、0.1 mmol·L-1EGTA、0.2 mmol·L-1Na2EDTA和2 μmol·L-1魚藤酮，溶液調(diào)至pH=7.1。以上溶液與Er(Ⅲ)溶液均采用超純水配制。

華油雜62，購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)種子直銷公司。

1.2 實驗方法

油菜黃化苗培養(yǎng)：將油菜種子用75%的酒精清洗5～10 s后浸入4% NaClO進行表面消毒5～10 min。已消毒的種子用二次水浸泡10～16 h后置于培養(yǎng)盤中，在22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，黃化苗長至6～10 cm待用。

油菜線粒體提取：油菜線粒體的提取方法參照文獻[9-10]的方法。黃化苗加研磨緩沖液在研缽中搗碎后過濾得到線粒體的粗提取液。將粗提取液在3 100 g轉(zhuǎn)速下離心10 min，隨后將離心所得上清液于17 600 g轉(zhuǎn)速下再次離心8 min，得到的沉淀為粗線粒體。線粒體純化過程主要是將沉淀懸浮于懸浮緩沖液中，再將其均勻鋪展在洗滌緩沖液中以17 600g離心8 min，此純化步驟重復(fù)2次得到的沉淀即為線粒體。

線粒體腫脹度測定：將線粒體均勻分散于2 mL Buffer C中，在常溫條件下，測定線粒體懸浮液于540 nm波長處的吸光度，檢測時間為600 s[11]。

線粒體H+/K+滲透性測定：將線粒體均勻分散于2 mL對應(yīng)的H+/K+滲透緩沖液中，在常溫條件下，測定線粒體懸浮液于540 nm波長處的吸光度，檢測時間為600 s[12]。

線粒體膜流動性測定：以HP為探針，采用熒光分光光度計測定不同濃度Er(Ⅲ)對線粒體膜流動性的影響[13]：將線粒體均勻分散到含有6 μmol·L-1HP的2 mL Buffer C中，在激發(fā)和發(fā)射波長分別為520 nm和626 nm條件下測量線粒體懸浮液熒光各向異性(r)。r的定義如方程(1)所示：

r=(I∏-GI⊥)/(I∏+2GI⊥)

(1)

式中：I∏和I⊥表示激發(fā)偏振器與發(fā)射偏振器取向分別為相互平行和相互垂直時所測得的偏振發(fā)射光強度。G=I∏/I⊥，為儀器光柵的修正因子[14]。

Clark氧電極法：采用Clark氧電極測定不同濃度Er(Ⅲ)作用下線粒體的呼吸耗氧情況。將4 mg·mL-1的線粒體溶解于1 mL的呼吸耗氧溶液中，以5 mmol·L-1丁二酸鈉與0.25 mmol·L-1ADP作為呼吸底物，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)，測定線粒體呼吸狀態(tài)3(state 3)下的耗氧速率[15]。

TEM表征線粒體超微結(jié)構(gòu)：將含不同濃度Er(Ⅲ)的線粒體在戊二醛/磷酸鹽緩沖液中固定30 min后，用磷酸鹽緩沖液清洗3次并固定于1%的四氧化鋨溶液，經(jīng)脫水、超薄切片和染色處理后，用TEM表征線粒體形貌[16]。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Er(Ⅲ)誘導(dǎo)線粒體腫脹

采用紫外-分光光度計測定了不同Er(Ⅲ)濃度下線粒體在540 nm處吸光度，吸光度降低則說明線粒體腫脹[17]。結(jié)果如圖1所示，不同濃度的Er(Ⅲ)均引起了吸光度不同程度的降低，當Er(Ⅲ)濃度為0～100 μmol·L-1時，吸光度下降程度較小，腫脹程度并不明顯；隨著Er(Ⅲ)濃度的增大，線粒體腫脹現(xiàn)象越來越明顯，當Er(Ⅲ)濃度達到600 μmol·L-1時，吸光度迅速下降至0.32，說明此時線粒體的腫脹現(xiàn)象非常明顯。

圖1 不同濃度鉺離子(Er(Ⅲ))引起油菜離體線粒體腫脹注：a～f表示Er(Ⅲ)濃度分別為0、50、100、200、400和600 μmol·L-1。Fig. 1 Swelling of isolated rape mitochondria caused by different concentrations of erbium (Er(Ⅲ))Note: a～f represent concentrations of Er(Ⅲ) are 0, 50, 100, 200, 400 and 600 μmol·L-1.

2.2 Er(Ⅲ)對線粒體膜H+/K+滲透性的影響

Er(Ⅲ)對線粒體內(nèi)膜H+/K+滲透性的影響均通過去能的線粒體腫脹程度判斷。如圖2(a)所示，隨著Er(Ⅲ)的加入，吸光度下降，線粒體出現(xiàn)了纈氨霉素依賴性的腫脹，這說明Er(Ⅲ)促進了線粒體內(nèi)膜對H+的滲透作用。如圖2(b)所示，隨著Er(Ⅲ)濃度的增加，540 nm處吸光度迅速降低，線粒體逐漸膨脹，說明Er(Ⅲ)促進了線粒體內(nèi)膜對K+的滲透。

圖2 不同濃度Er(Ⅲ)對于線粒體內(nèi)膜H+(a)/K+(b)滲透的影響注：a～f表示Er(Ⅲ)濃度分別為0、50、100、200、400和600 μmol·L-1。Fig. 2 Mitochondrial inner membrane permeabilization to H+(a)/K+(b) influenced by different concentrations of Er(Ⅲ)Note: a～f represent concentrations of Er(Ⅲ) are 0, 50, 100, 200, 400 and 600 μmol·L-1.

2.3 Er(Ⅲ)對線粒體膜流動性的影響

線粒體的腫脹通常伴隨著線粒體膜流動性的改變，為此檢測了不同濃度Er(Ⅲ)作用后的線粒體結(jié)合HP的熒光各向異性，熒光各向異性增大表明膜流動性降低[18]。如圖3所示，隨著Er(Ⅲ)濃度的增大，線粒體熒光各向異性逐漸增大，說明Er(Ⅲ)降低了線粒體膜的流動性。尤其是當Er(Ⅲ)濃度超過50 μmol·L-1后，線粒體的熒光各向異性明顯增大，說明高濃度Er(Ⅲ)會明顯降低線粒體膜的流動性。

圖3 不同濃度Er(Ⅲ)引起線粒體膜流動性的改變注：a～f表示Er(Ⅲ)濃度分別為0、50、100、200、400和600 μmol·L-1。Fig. 3 Changes of mitochondrial membrane fluidity caused by different concentrations of Er(Ⅲ)Note: a～f represent concentrations of Er(Ⅲ) are 0, 50, 100, 200, 400 and 600 μmol·L-1.

2.4 Er(Ⅲ)對線粒體呼吸作用的影響

采用Clark氧電極法考察了Er(Ⅲ)對線粒體第3階段(State 3)呼吸作用的影響。由圖4可知，隨著Er(Ⅲ)濃度逐漸增大，線粒體呼吸耗氧速率逐漸下降，這說明線粒體呼吸作用減弱，Er(Ⅲ)抑制了線粒體呼吸鏈的功能。

圖4 Er(Ⅲ)對于油菜離體線粒體State 3下呼吸速率的影響注：數(shù)字表示加入相應(yīng)濃度的Er(Ⅲ)后的耗氧率。Fig. 4 Effect of Er(Ⅲ) on the State 3 respiration rate of isolated rape mitochondriaNote: The number indicates oxygen consumption rate after adding corresponding concentration of Er(Ⅲ).

2.5 線粒體TEM圖譜

TEM表征線粒體超薄切片的圖譜如圖5所示。由圖5(a)可知，線粒體外膜完整，呈橢圓形，電子密度高，部分區(qū)域可以觀察到緊湊的嵴。由圖5(b)可知，100 μmol·L-1Er(Ⅲ)溫育后的線粒體電子密度明顯變低，線粒體體積變大，嵴已經(jīng)很難辨認，這與線粒體發(fā)生腫脹的實驗結(jié)果相符。由圖5(c)可知，為500 μmol·L-1Er(Ⅲ)溫育后的線粒體外膜有一定程度破壞。研究表明，線粒體可通過線粒體孔道釋放細胞色素c調(diào)控細胞死亡，當線粒體外膜受損，線粒體內(nèi)的細胞色素c釋放過多，將導(dǎo)致細胞死亡[19]。

圖5 0 μmol·L-1 (a)、100 μmol·L-1 (b)和500 μmol·L-1 (c) Er(Ⅲ)溫育的線粒體超微結(jié)構(gòu)的TEM表征Fig. 5 TEM images of the ultra-structure of mitochondria incubated with Er(Ⅲ) of 0 μmol·L-1 (a), 100 μmol·L-1 (b) and 500 μmol·L-1 (c)

3 討論(Discussion)

線粒體懸浮液在540 nm處的吸光度變化可以表征Er(Ⅲ)對線粒體腫脹程度的影響，吸光度下降表明線粒體腫脹。研究表明，Er(Ⅲ)濃度的增加引起了吸光度不同程度的降低，說明線粒體基質(zhì)擴張，線粒體腫脹。在較高濃度Er(Ⅲ)誘導(dǎo)下，線粒體內(nèi)膜的通透性增大，大量溶質(zhì)進入線粒體基質(zhì)，膠體滲透壓增加，線粒體發(fā)生腫脹，這可能會進一步導(dǎo)致線粒體外膜破損。

當線粒體基質(zhì)體積變大時，內(nèi)膜嵴展開，部分蛋白的構(gòu)象可能會發(fā)生變化，導(dǎo)致膜流動性變化[22]。有報道稱，HP會集中在內(nèi)膜上的特殊極性及蛋白區(qū)域，通過HP標記線粒體，測量其熒光各向異性變化可反映線粒體膜流動性的改變。如圖3所示，熒光各向異性的變化表明，隨Er(Ⅲ)濃度增加，線粒體膜的流動性降低，說明線粒體內(nèi)膜上的部分蛋白質(zhì)發(fā)生變化，這可能會造成線粒體功能紊亂。

以上研究結(jié)果表明，Er(Ⅲ)誘導(dǎo)線粒體發(fā)生了膜滲透性轉(zhuǎn)化(MPT)，TEM圖譜觀察到在較高濃度Er(Ⅲ)作用下，線粒體外膜明顯受損，這進一步驗證了MPT的發(fā)生。MPT會引起線粒體正常功能出現(xiàn)異常，而線粒體最重要的功能之一是通過呼吸作用為細胞供能。State 3下，線粒體通過電子傳遞鏈和ATP合成酶，將ADP合成為ATP，這個過程主要受到呼吸鏈和ATP合成酶的控制。Clark氧電極實驗結(jié)果表明，較高濃度的Er(Ⅲ)會抑制線粒體呼吸作用，影響線粒體呼吸鏈功能，破壞了線粒體功能。本研究結(jié)果證實，較高濃度的Er(Ⅲ)對于油菜線粒體的結(jié)構(gòu)與功能均具有破壞作用。