棉花苗期根腐類病害生防細(xì)菌的篩選與鑒定

杜鵬程，劉海洋，張軍高，李 進(jìn)，周小云，劉夢麗，雷 斌，郭慶元

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院核技術(shù)生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】我國是棉花(GossypiumhirsutumL.)生產(chǎn)大國和消費(fèi)大國，新疆是我國最大的優(yōu)質(zhì)棉生產(chǎn)基地。2018年新疆棉花種植面積占全國的74.3%，產(chǎn)量占全國的83.8%，單產(chǎn)、總產(chǎn)穩(wěn)居全國首位[1]。新疆土壤、氣候條件與內(nèi)地差異大，棉花苗期病害發(fā)生及危害特點(diǎn)與內(nèi)地其他棉區(qū)不同[2]。由于常年連作、早春“倒春寒”頻繁發(fā)生等因素導(dǎo)致新疆棉花病害發(fā)生日益嚴(yán)重[3-4]，致使田間出苗、保苗差，缺苗斷壟普遍發(fā)生，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)，篩選對棉花苗期根腐類病害具有較強(qiáng)拮抗作用的生防細(xì)菌，對防治棉花苗期根腐類病具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】以往主要通過化學(xué)農(nóng)藥處理種子的措施防治棉花苗期病害，但隨著化學(xué)農(nóng)藥的長期使用，存在有害生物抗藥性強(qiáng)，農(nóng)藥防效低、用量大、利用率低、污染環(huán)境重等弊端。生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、有害生物不易產(chǎn)生抗藥性、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，從棉花、小麥根際土壤、植株中分離出枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等生防菌株對棉花枯萎病、黃萎病病原菌具有良好的拮抗作用[5-9]。【本研究切入點(diǎn)】對于棉花苗期立枯病和紅腐病的相關(guān)研究較少。棉花苗期根腐類病害研究及生物防治研究基礎(chǔ)還比較薄弱、可借鑒少，周揚(yáng)等[10]研究發(fā)現(xiàn)新疆棉花苗期根腐類病害主要為立枯病和紅腐病，其致病菌為立枯絲核菌(R.solani)、擬輪枝鐮孢霉(F.verticilliodes)等。研究篩選與鑒定棉花苗期根腐類病害生防細(xì)菌?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從土壤、植株中分離、篩選出對棉花根腐類病害抑菌活性強(qiáng)的生防菌株。通過對新疆棉田土壤中分離出的有益生防菌株進(jìn)行篩選、鑒定、抑菌能力測定，以及田間對棉花苗期根腐類病害生防效果驗(yàn)證，并通過培養(yǎng)，研究發(fā)酵液浸種對棉花苗期根腐類病害的防治效果。

1 材料與方法

1.1 材 料

生防菌菌株：A57、A178、M729、LB1、TWt1、TWt34、UB17-2、HBt8、HBt14、HBt26、HWt26、HWt34、LA1、LA2、LD19-1，由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病理實(shí)驗(yàn)室提供。

靶標(biāo)菌：立枯絲核菌(R.solani) 、擬輪枝鐮孢霉(F.verticilliodes)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院病理實(shí)驗(yàn)室提供。大麗輪枝菌(V.dahlia)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所病理實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基：Luria-Bertani培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL)

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司提供。

棉花品種：新陸中46號，新疆承天種業(yè)科技股份有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 生防細(xì)菌抑菌能力測定

將保存在試管中的菌株轉(zhuǎn)接到平板培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3～5 d。采用平板對峙法，先用打孔器(6 mm)將靶標(biāo)菌做成適量菌餅，采用五點(diǎn)法接種，將菌餅轉(zhuǎn)接新的PDA培養(yǎng)基中央，在距培養(yǎng)皿邊緣2 cm處用牙簽進(jìn)行生防細(xì)菌菌株接種。每個(gè)處理重復(fù)3次，生長3～5 d觀察生長情況，測量并計(jì)算每株生防菌菌株的抑菌帶寬度，并篩選出抑菌率高的生防菌株。7～15 d觀察抑菌帶變化情況。

1.2.2 生防細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定1.2.2.1 目標(biāo)基因片段PCR擴(kuò)增

16S rDNA 序列擴(kuò)增：采用細(xì)菌16S rDNA 序列通用引物F16S-27:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和R16S-1492:TACGGYTACCTTGTTACGACTT進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2×TaqMaster Mix 25 μL，27F (10 μmol/L)和 1 492R (10 μmol/L)各 1 μL，DNA 模板 1 μL，補(bǔ)dd H2O 到 50 μL。PCR 擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s 35 cycles，延伸72℃ 1.5 min；延伸72℃ 10 min。

gyrA 序列擴(kuò)增：采用細(xì)菌gyrA基因通用引物42F: CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT和1 066R: CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2×TaqMaster Mix 25 μL，42F (10 μmol/L)和 1 066R (10 μmol/L)各 1 μL，DNA 模板 1 μL，補(bǔ)dd H2O 到 50 μL。PCR 擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，退火54℃ 30 s 35 cycles，延伸72℃ 1.5 min；延伸72℃ 10 min。

1.2.2.2 回收PCR產(chǎn)物

(1)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片斷；

(2)加入回收試劑溶液A 300 μL/0.1g，60℃水浴至膠完全溶化；

(3)加入50 μL回收試劑溶液B，混勻 ；

(4)將溶液置于離心柱中，靜置5 min，12 000 r/min，1 min，棄液體；

(5)加入500 μL 80%乙醇，12 000 r/min，離心1 min，棄液體，重復(fù)1次；

(6)12 000 r/min，離心5 min，甩干余液，棄液體，晾干5～8 min；

(7)將離心柱置于新的離心管中，加入30 μL滅菌雙蒸水，靜置10 min；

(8)13 000 r/min，離心3 min，管底即為純化產(chǎn)物，取3 μL電泳檢測。

1.2.3 生防細(xì)菌田間防治效果

在新疆哈密西戈壁試驗(yàn)田進(jìn)行，選擇棉花苗期根腐類病害發(fā)病重的地塊，該地塊棉花立枯病和棉花紅腐病為混合侵染發(fā)生。分別設(shè)不浸種空白對照、HWt34浸種、TWt34浸種、TWt1浸種、LA1浸種，共5個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。每個(gè)小區(qū)面積20 m2，共18個(gè)小區(qū)。在棉花苗期分別調(diào)查出苗率、發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

棉花棉期根腐類病害分級標(biāo)準(zhǔn)[11]

0級：莖基部和根部無病斑；

1級：莖基部出現(xiàn)少量褐色病斑，根部病斑占整個(gè)根部面積的 10%以下，或下部葉片變黃，變黃葉片占整株葉片的10%；

3級：莖基部棕褐色病斑凹陷，根部病斑占整個(gè)根部面積的11%～25%，變黃萎蔫葉片占整株葉片的25%；

5級：莖基部病斑棕褐色擴(kuò)展，莖基部變細(xì)，根部病斑占整個(gè)根部面積的26%～50%，變黃萎蔫葉片占整株葉片的50%；

7級：莖基部黑褐色病斑繞莖1周， 縊縮變細(xì)，根部病斑占整個(gè)根部面積的51%～75%，變黃萎蔫葉片占整株葉片的75%；

9級：整株萎蔫造成死亡。發(fā)病率 (%) =發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%。

病情指數(shù)=∑ (各級病株數(shù)×相對級數(shù)值) / (調(diào)查總株數(shù)×6) ×100。

防治效果 (%) = (空白對照病情指數(shù)-藥劑處理病情指數(shù)) /空白對照病情指數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得 PCR 產(chǎn)物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定，測得的序列經(jīng)在NCBI 進(jìn)行 BLAST 在線同源比對，選用同源性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為參照對象，利用 Bioedit和MEGA 7.0 軟件進(jìn)行序列編輯和多序列比對，采用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過Microsoft Office Execl 2010整理，利用SPSS 21.0軟件，用Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，比較各處理之間的差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防細(xì)菌抑菌能力

研究表明，生防菌株TWt34和HWt34抑菌能力較強(qiáng)，對立枯絲核菌的抑菌帶寬度分別為8.14 和8.29 mm，對擬輪枝鐮孢霉分別為6.20 和6.60 mm，對尖孢鐮刀菌分別為7.63和7.70 mm，對大麗輪枝菌的抑菌寬度最大分別為12.60和13.15 mm。與其它生防菌有明顯的差異。圖1

1.立枯絲核菌; 2.擬輪枝鐮孢霉; 3.尖孢鐮刀菌; 4.大麗輪枝菌的拮抗作用
1Rhizoctoniasolani2Fusariumverticilliodes3Fusariumoxysporum4Verticilliumdahliae
圖1 生防菌TWt34、TWt1、LA1拮抗作用
Fig. 1 Antagonistic Effects of Bacteria TWt34, TWt1, LA1

2.2 生防菌株的分子生物學(xué)鑒定

HWt34和TWt34 2株生防菌株通過 16S r DNA 擴(kuò)增進(jìn)行DNA測序，序列長度分別為1 443和1 433 bp?；蛐蛄性?NCBI 中進(jìn)行 BLAST 序列同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示， HWt34與B.mojavensis(AB021191.1)、B.mojavensis(JX126863.1) 處于同一支，TWt34菌株與Bacilluspseudomycoides(ACMX01000133.1) 處于同一支。 通過gyrA 基因擴(kuò)增進(jìn)行 DNA測序，序列長度分別為 1 012 和1 006 bp?；蛐蛄性?NCBI 中進(jìn)行 BLAST 序列同源性比較，HWt34、TWt34與B.mojavensis的gyrA 基因序列最為相似，同源性達(dá) 99%。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明,HWt34、TWt34處于同一分支且與B.mojavensis處于同一個(gè)分支。生防菌株HWt34和TWt34可以確定為B.mojavensis。表1，圖2～4

表1 生防細(xì)菌平板對峙抑菌帶寬度Table 1 Bandwidth of antagonistic bacteriostasis of Biocontrol Bacterial plate

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母表示差異顯著P<0.05
Note: Data in the table are mean±SD, different lowercase letters marked in the columns indicate significant difference in the tableP<0.05

圖2 菌株 TWt34和HWt34 16S rDNA 和gyrA 基因的擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2 Amplification of strains TWt34 and HWt34 16S rDNA andgyrA genes

圖3 基于 16S rDNA 序列 BLAST 結(jié)果構(gòu)建的菌株 TWt34和HWt34 的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.3 Phylogenetic trees of strains TWt34 and HWt34 were constructed based on BLAST results of 16SrDNA sequence

圖4 基于gyrA 序列 BLAST 結(jié)果構(gòu)建的菌株 TWt34和HWt34 的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.4 The phylogenetic tree of strains TWt34 and HWt34 based on the results ofgyrA gene sequence

2.3 生防菌株田間防治效果

研究表明，生防菌株HWt34浸種處理出苗率最高為81.81%，TWt34浸種處理出苗率次之為83.63%，兩者之間沒有顯著性差異。生防菌株TWt1浸種處理出苗率為70.74% ，生防菌株HWt34、TWt34處理相比差異性顯著，但高于生防菌株LA1處理和空白處理；空白處理發(fā)病率明顯高于其它處理，其中生防菌株HWt34和TWt34浸種處理發(fā)病率較低且無明顯差異；生防菌株HWt34和TWt34浸種處理的病情指數(shù)低于其它處理，而兩者之間并無明顯差異，但與TWt1浸種和LA1浸種處理有差異；生防菌株HWt34和TWt34浸種處理防治效果分別為78.43%、76.47%，防治效果高于生防菌株TWt1和LA1浸種處理，且差異性顯著。表2

表2 生防菌株TWt34和HWt34浸種田間防治效果 Table 2 Field control effect of soil-resistant strains TWt 34 and HWt 34

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差，不同小寫字母表示差異顯著P<0.05
Note: Data in the table are mean±SD, different lowercase letters marked in the columns indicate significant difference in the tableP<0.05

3 討 論

生物農(nóng)藥具有選擇性強(qiáng)、有害生物不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，能夠克服化學(xué)農(nóng)藥抗藥性強(qiáng)、污染重等[12]。許多研究通過在植物體內(nèi)、深海微生物、根際土壤中分離得到多種具有防病或誘導(dǎo)抗病的生防細(xì)菌[13-14]，包括Bacillus屬[15]、Pseudomonas屬[16]、Agrobacterium屬[17]和Paenibacilluspolymyxa[18-19]等，其中Bacillus屬研究最為廣泛，而枯草芽孢桿菌(B.subtilis)是Bacillus屬的常見代表，劉海洋等[20-22]研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus屬其他細(xì)菌種類如解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)等棉花枯萎病和黃萎病具有良好拮抗作用，但是對于棉花苗期立枯病和紅腐病的相關(guān)研究較少。新疆屬于典型的大陸型氣候，土壤、氣候條件獨(dú)特決定了微生物種類的特殊性，因此，迫切需要結(jié)合新疆實(shí)際，加強(qiáng)防治立枯病和紅腐病等棉花苗期根腐類病害的生防菌研究。

李振東等[23-24]在高寒植物珠芽蓼和矮生嵩草中成功分離出的內(nèi)生菌莫海威芽孢桿菌，并通過試驗(yàn)證明其對玉米小斑病菌、立枯絲核菌等具有拮抗作用并對植物的生長具有促生作用，現(xiàn)已成為具有巨大潛力的新型生物農(nóng)藥來源[25]。

研究通過鑒定棉田根際土壤篩選出的生防細(xì)菌，并且利用2種分子學(xué)鑒定方式得到1株莫海威芽孢桿菌，試驗(yàn)證明莫海威芽孢桿菌對棉花立枯絲核菌(R.solani) 、擬輪枝鐮孢霉(F.verticilliodes)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)及大麗輪枝菌(V.dahlia)都有拮抗作用，這與前人研究結(jié)果一致，但其作用機(jī)理、應(yīng)用技術(shù)尚待進(jìn)一步深入研究。

B.mojavensisTWt34對棉花苗期根腐類病害具有很好的防治效果，該生防細(xì)菌選自新疆棉花根際土壤，能夠較好的適應(yīng)新疆生態(tài)環(huán)境，應(yīng)用前景廣闊。

4 結(jié) 論

生防細(xì)菌HWt34和TWt34經(jīng)16S rDNA和gyrA鑒定為莫海威芽孢桿菌B.mojavensis，對棉花苗期主要根腐類病害立枯病、棉花紅腐病具有較強(qiáng)拮抗作用。B.mojavensisHWt34浸種處理效果最好，B.mojavensisTWt34浸種處理次之，防病效果分別為78.43%和76.74%，棉田出苗率分別為84.81%和83.63%，均優(yōu)于對照。