蒙藥黃柏膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究＊

白文明，王來(lái)兵，包勒朝魯，那生桑

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 呼和浩特 010110）

藥用黃柏膏是蕓香科植物黃皮樹（Phellodendron chinense Schneid.）的干燥樹皮經(jīng)水提取后的浸膏劑。蒙醫(yī)用黃柏膏方劑最早記載于《醫(yī)經(jīng)八支精義集要》，是治療血熱赤眼、寒風(fēng)赤眼、痛風(fēng)、風(fēng)濕、熱性黃水病、黃水瘡、斑禿、癬、鼻衄、吐血、崩漏等癥的涼性膏劑型蒙成藥，又名“希拉·毛敦·罕達(dá)”，被西醫(yī)診斷為急慢性結(jié)膜炎，沙眼等癥均可服用此藥[1]。蒙藥是蒙古民族通過(guò)長(zhǎng)期的生活實(shí)踐積累下來(lái)的寶貴醫(yī)藥財(cái)富，現(xiàn)代藥理研究證實(shí)黃柏膏中含有多種藥理活性成分，這些成分具有抗炎[2]、抗菌[3-5]、抗?jié)僛6]、抗氧化[7，8]等作用。因其具有內(nèi)服兼外敷的用藥特點(diǎn)，流傳至今仍是蒙醫(yī)臨床用藥的常用制劑。傳統(tǒng)中醫(yī)藥書籍《圣濟(jì)總錄》《圣惠》《衛(wèi)生總微》《仁術(shù)便覽》等雖然對(duì)黃柏膏進(jìn)行了記載，但與蒙藥用黃柏膏相比，方劑有較大差異，藥效及用法亦不同。2015 版《中國(guó)藥典》一部對(duì)黃柏膏制劑原料的黃柏及其炮制品鹽黃柏、黃柏炭等制定了科學(xué)、系統(tǒng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是現(xiàn)行黃柏藥材及其炮制品質(zhì)量控制的法理依據(jù)，但對(duì)黃柏膏未制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，且至今未有任何相關(guān)的文獻(xiàn)或研究報(bào)道。

對(duì)蒙藥用制劑進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究是傳承發(fā)展傳統(tǒng)蒙醫(yī)藥、提高蒙醫(yī)藥事業(yè)現(xiàn)代化程度及科學(xué)性的前提條件和基礎(chǔ)，有非常廣泛且實(shí)際的需求。本文從性狀、檢查、鑒別及含量測(cè)定等多角度對(duì)蒙藥用黃柏膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了科學(xué)、系統(tǒng)的研究，制定了符合實(shí)際情況的科學(xué)、合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，為建立黃柏膏制劑的質(zhì)量控制方法提供理論支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

iChrom 5100型高效液相色譜儀（大連伊利特分析儀器有限公司）；ODS 色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5μm，大連伊利特）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KH5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山和創(chuàng)超聲儀器有限公司）；DHT 型磁力攪拌恒溫電熱套（山東菏澤石曲化工學(xué)校儀器設(shè)備廠）。

1.2 試藥

各批次黃柏（成都藥市，批號(hào)150201和160309；呼和浩特藥市，批號(hào)160501和180701）經(jīng)鑒定，為蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮，即習(xí)稱的“川黃柏”。

圖1 薄層色譜圖

表1 三批黃柏中小檗堿及黃柏堿含量

1.3 化學(xué)試劑

鹽酸黃柏堿對(duì)照品（111895-201504，94.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（110713-201212，86.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；黃柏對(duì)照藥材（Z8ZJ-Y8WD，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；磷酸和乙腈為色譜級(jí)試劑，冰乙酸、三氯甲烷、氨水、碘化鉀、次硝酸鉍均為市售分析純。

2 原藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)

蒙藥用黃柏膏是黃柏原藥材經(jīng)水提而得的浸膏劑。在制備黃柏膏前，須對(duì)原藥材黃柏的質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，以保障黃柏膏制劑的藥效穩(wěn)定性和制備樣品的代表性。本研究依據(jù)收錄于2015 版《中國(guó)藥典》一部的黃柏項(xiàng)下的薄層鑒別及含量測(cè)定方法對(duì)制劑用原藥材的質(zhì)量進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果如下。

2.1 薄層鑒別

參照2015 版《中國(guó)藥典》一部黃柏項(xiàng)下的薄層鑒別方法，各批次供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)（圖1）。

2.2 含量測(cè)定

參照2015 版《中國(guó)藥典》一部黃柏項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，4 個(gè)批次黃柏藥材的鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的含量均符合2015版《中國(guó)藥典》一部要求（小檗堿含量不少于3.0%，黃柏堿含量不少于0.34%，表1）。

結(jié)果表明，從鑒別和指標(biāo)成分含量測(cè)定的角度，本研究用于制備黃柏膏的4個(gè)批次原藥材的質(zhì)量均符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》的要求，是合格的黃柏原藥材。

3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

3.1 成品性狀

棕黃色干膏（或粉末），氣微、味苦。

3.2 制法

取凈黃柏，照煎煮法（2015 版《中國(guó)藥典》第四部制劑通則0100）制成干膏，具體步驟如下：取黃柏粗粉，加水浸漬12 h，煎煮1 h，趁熱過(guò)濾得濾液，殘?jiān)铀?，煎? h，趁熱過(guò)濾，合并煎液，重復(fù)上述操作，合并濾液。濾液用水浴濃縮至粘稠狀，低溫干燥，研細(xì)，即得。共制得7個(gè)批次黃柏膏。

3.3 鑒別

3.3.1 顯微鑒別

用顯微鏡對(duì)藥材切片、粉末、表面制片及含藥材粉末的制劑進(jìn)行觀察，獲得藥材組織、細(xì)胞或內(nèi)容物等特征是鑒別藥材或制劑的常用方法之一。本研究中黃柏膏是水提取浸膏劑，無(wú)組織、細(xì)胞特征，所以沒(méi)有顯微鑒別的意義。所以，未建立相應(yīng)的顯微鑒別方法。

3.3.2 薄層鑒別

因2015 版《中國(guó)藥典》一部黃柏項(xiàng)下的薄層鑒別方法比較成熟，故參照此方法制定了黃柏膏制劑的薄層鑒別方法。

取黃柏膏粉末0.2 g，加入1%醋酸甲醇溶液40 mL，于60 ℃超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液。另取鹽酸黃柏堿對(duì)照品，加入甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。參照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》2015年版通則0502）實(shí)驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各3-5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板，以三氯甲烷∶甲醇∶水（30∶15∶2）的下層溶液為展開劑，置氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，分離度符合要求。各批次樣品均呈陽(yáng)性（圖2），故作為黃柏膏的薄層鑒別方法。

圖2 黃柏膏薄層色譜圖

表2 水分含量測(cè)定表

3.4 檢查

黃柏膏制劑易吸收空氣中的水分，因此在不同濕度的環(huán)境中，水分含量存在一定差異，而水分含量的較大差異可能直接影響黃柏膏制劑的藥效穩(wěn)定性。故本研究根據(jù)各批次制劑粉末中水分含量的測(cè)定結(jié)果，制定了含水量的限度值，作為黃柏膏質(zhì)量控制的指標(biāo)之一。

取本品約3.0 g，照《中國(guó)藥典》（2015 年版通則0832第二法）水分測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定（表2）。

結(jié)果顯示，7 個(gè)批次黃柏膏制劑的水分含量在1.51%-2.72%之間，平均值為2.19%。考慮不同儲(chǔ)存環(huán)境中干濕度的差異，擬定黃柏膏水分含量不得過(guò)5.00%。

3.5 含量測(cè)定

照《中國(guó)藥典》（2015 年版通則0512）高效液相色譜法，對(duì)鹽酸小檗堿及鹽酸黃柏堿含量進(jìn)行測(cè)定。

3.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

（1）鹽酸小檗堿

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，5μm，4.6 mm×250 mm

流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每100 mL加十二烷基磺酸鈉0.25 g）

檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm

柱溫：25 ℃

流速：1.0 mL·min-1

理論板數(shù)：按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于10000

（2）鹽酸黃柏堿

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，5μm，4.6 mm×250 mm

流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（每100 ml加十二烷基磺酸鈉0.25 g）（36∶64）

檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm

柱溫：25 ℃

流速：1.0 mL·min-1

理論板數(shù)：按鹽酸黃柏堿峰計(jì)算應(yīng)不低于15000

在上述色譜條件下，對(duì)鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿進(jìn)行測(cè)定（圖3、圖4、表3）。

結(jié)果顯示，在上述色譜條件下供試品溶液中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的各項(xiàng)系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)均符合要求。

3.5.2 對(duì)照品溶液的制備

取鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿對(duì)照品適量，精密稱定，分別加入乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）和乙腈-0.1%磷酸溶液（36∶64）的混合溶劑，制成每1 mL 含0.16 mg和0.4 mg的溶液，即得。

3.5.3 供試品溶液的制備

以流動(dòng)相為提取液，不同提取工藝條件下制備供試品溶液，分別測(cè)得含量數(shù)據(jù)（表4）。

圖3 鹽酸小檗堿對(duì)照品及黃柏膏的色譜圖

圖4 鹽酸黃柏堿對(duì)照品及黃柏膏的色譜圖

表3 系統(tǒng)適應(yīng)性數(shù)據(jù)

表4 鹽酸小檗堿（A）和鹽酸黃柏堿（B）的提取工藝考察

結(jié)果顯示，不同提取工藝條件下測(cè)得的鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量并無(wú)明顯差異?？紤]到提取方法的簡(jiǎn)易性，選擇25 ℃、超聲40 min、提取液體積100 mL 為黃柏膏中鹽酸小檗堿的提取工藝；25 ℃、超聲30 min、提取液體積25 mL為黃柏膏中鹽酸黃柏堿的提取工藝。

3.5.4 測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

圖5 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

圖6 鹽酸黃柏堿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

表5 各對(duì)照品溶液濃度及對(duì)應(yīng)峰面積數(shù)據(jù)

3.5.5 方法學(xué)考察

（1）線性關(guān)系考察

取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相定容至刻度，得每1 mL 含0.016 mg的溶液。分別進(jìn)樣5μL、10μL、20μL、40μL、50μL，記錄對(duì)照品峰面積。

取鹽酸黃柏堿對(duì)照品適量，精密稱定，加流動(dòng)相定容至刻度，得每1 mL 含0.08 mg 的溶液。分別進(jìn)樣5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，記錄對(duì)照品峰面積。

將進(jìn)樣量換算為對(duì)應(yīng)的濃度，整理數(shù)據(jù)得表5。

以色譜峰面積為橫坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為縱坐標(biāo)，回歸得到鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線（圖5、圖6）。結(jié)果顯示，含量測(cè)定項(xiàng)下選擇的指標(biāo)成分鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿分別在0.016-0.16 mg·mL-1，0.08-0.4 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，回歸方程和回歸系數(shù)分別為Y= 4.844 × 10-5X+3.604 × 10-4、r= 0.9999，Y= 1.543 × 10-4X+ 5.620 ×10-4、r=0.9999。

表6 鹽酸小檗堿（A）和鹽酸黃柏堿（B）對(duì)應(yīng)的峰面積

表7 鹽酸小檗堿（A）和鹽酸黃柏堿（B）穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表8 同一批次6份供試品溶液的鹽酸小檗堿（A）和鹽酸黃柏堿（B）含量

表9 鹽酸小檗堿（A）和鹽酸黃柏堿（B）的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

（2）精密度試驗(yàn)

照鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿供試品溶液制備方法制得供試品溶液各1 份，分別于各自確定的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果顯示，供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次后，各色譜圖中鹽酸小檗堿對(duì)應(yīng)峰面積的RSD 為0.8%，鹽酸黃柏堿對(duì)應(yīng)峰面積的RSD 為1.1%，表明對(duì)上述兩個(gè)成分儀器進(jìn)樣精密度良好（表6）。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)

照鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿供試品溶液制備方法制得供試品溶液各1 份，分別在制備后的0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h 各進(jìn)樣一次，記錄對(duì)應(yīng)峰面積（表7）。結(jié)果顯示，8 h內(nèi)鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿對(duì)應(yīng)峰面積的RSD 分別為0.6%和1.4%。表明，供試品溶液內(nèi)的上述兩個(gè)成分在8 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)

照鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿供試品溶液制備方法制得供試品溶液各6份（100%濃度水平），進(jìn)樣測(cè)得對(duì)應(yīng)成分峰面積后，利用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算得鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量（表8）。結(jié)果顯示，6份相同濃度水平供試品溶液中的鹽酸小檗堿含量的RSD 為2.0%，鹽酸黃柏堿含量的RSD 為1.3%，表明該方法的精密度良好。

（5）加樣回收率試驗(yàn)

取同一濃度的供試品溶液（100%濃度水平）各6份，按加入對(duì)照品量與供試品中待測(cè)成分量之比控制在1∶0.5、1∶1、1∶1.5左右，進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)（表9）。結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的加樣回收率分別在94.92%-101.4%和96.75%-105.4%范圍之內(nèi)，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

（6）含量測(cè)定

照上述含量測(cè)定方法，測(cè)得7 批次黃柏膏中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量（表10）。根據(jù)測(cè)得結(jié)果，并結(jié)合制備工藝及原材料的差異等影響因素，規(guī)定黃柏膏中鹽酸小檗堿含量不得低于5.50%，鹽酸黃柏堿含量不得低于0.84%。

4 討論

本研究共制得7個(gè)批次黃柏膏制劑，其外觀、性狀間無(wú)顯著差異，根據(jù)其特點(diǎn)總結(jié)規(guī)定了該制劑的性狀特征。在制劑質(zhì)量控制過(guò)程中，對(duì)制劑進(jìn)行鑒別分析是保證制劑質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床用藥安全必不可少的環(huán)節(jié)。黃柏膏為水提浸膏劑，無(wú)顯微特征，因此無(wú)法規(guī)定顯微鑒別方法?；诖吮菊n題研究開發(fā)了以黃柏膏中含有的鹽酸黃柏堿成分和制劑用原藥材的對(duì)照藥材為基準(zhǔn)的薄層鑒別方法，作為黃柏膏制劑質(zhì)量控制的鑒別方法。

表10 7批次黃柏膏中鹽酸小檗堿（A）和鹽酸黃柏堿（B）含量

蒙醫(yī)用黃柏膏是黃柏藥材的水提浸膏，屬單方制劑，與常見的復(fù)方中藥制劑黃柏膏不同，其用法、用量和對(duì)應(yīng)病癥亦存在差異。黃柏膏是典型的浸膏固體制劑，具有一定程度的吸濕性，在儲(chǔ)存、運(yùn)輸或制劑過(guò)程中不可避免的會(huì)發(fā)生吸潮現(xiàn)象，影響黃柏膏的質(zhì)量穩(wěn)定性[9-11]，對(duì)黃柏膏的水分含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化研究對(duì)保證藥效及臨床用藥安全具有重要意義。本研究通過(guò)測(cè)量7個(gè)批次黃柏膏制劑的水分含量，并結(jié)合不同地區(qū)干濕度的差異，制定黃柏膏制劑的水分含量不得＞5.00%。

小檗堿和黃柏堿是黃柏膏中具有代表性的藥理活性成分，相關(guān)研究證明，小檗堿具有降血糖[12]、降血壓[13，14]及神經(jīng)保護(hù)作用[15]，黃柏堿具有免疫抑制作用[16，17]，因此本研究采用上述兩個(gè)成分含量作為黃柏膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定項(xiàng)，并對(duì)含量測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，建立了符合現(xiàn)行中國(guó)藥典規(guī)定的含量測(cè)定方法。通過(guò)測(cè)量7個(gè)批次黃柏膏中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量，規(guī)定黃柏膏中鹽酸小檗堿含量不得＜5.50%，鹽酸黃柏堿含量不得＜0.84%。

本研究建立的質(zhì)量控制方法快速簡(jiǎn)便，且準(zhǔn)確度高，對(duì)建立完善的黃柏膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要的理論指導(dǎo)意義。