藏藥珊瑚七十味丸中重金屬含量及Hg元素化學(xué)形態(tài)研究＊

宗詠花，徐立軍，莫 歌，春 花，張燕飛，吳麗麗，劉銅華，

（1. 西藏藏醫(yī)藥大學(xué)藏醫(yī)系 拉薩 850000；2. 西藏藏醫(yī)藥大學(xué)藏藥研究所 拉薩 850000；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100029）

隨著傳統(tǒng)醫(yī)藥在全球的興起，名貴藏藥因組方豐富、傳承完整、療效獨(dú)特而日益?zhèn)涫荜P(guān)注。最早記載于藏醫(yī)藥名著《四部醫(yī)典》中的珊瑚七十味丸[1]，具有鎮(zhèn)心、安神、定驚、調(diào)血的功效，臨床主要用于腦血栓、腦溢血、冠心病、高血壓、肢體癱瘓、小兒麻痹、癲癇及各種神經(jīng)炎等病癥，尤其對(duì)大腦神經(jīng)和心臟性疾病有特殊功效。珊瑚七十味丸的主要組分為珊瑚、瑪瑙、當(dāng)歸、珍珠、牛黃、藏紅花、藏黨參、紅景天、雪蓮花、余甘子、黃精、麝香等七十味藥材[2]。其組分眾多，不乏礦物質(zhì)藥材，常見(jiàn)重金屬元素鉛、鉻、汞、砷、銅等均不同程度的出現(xiàn)在珊瑚七十味丸中。而這些重金屬元素可對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、心血管、消化系統(tǒng)及腎臟等造成不同程度的損傷[3-5]，這就使得藏藥珊瑚七十味丸中的重金屬元素的問(wèn)題較為嚴(yán)重。如果不制定相應(yīng)的重金屬元素的限量標(biāo)準(zhǔn)，藏藥珊瑚七十味丸的臨床安全就無(wú)法得到保障。但是，目前關(guān)于含重金屬制劑珊瑚七十味丸的動(dòng)物與臨床安全性評(píng)價(jià)尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

重金屬對(duì)人體危害巨大[6-8]，但國(guó)內(nèi)外對(duì)于傳統(tǒng)藥物中重金屬含量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)依然不夠完善，現(xiàn)存的安全性評(píng)價(jià)體系也并不健全。由于組分眾多，且其中不乏礦物藥，珊瑚七十味丸、七十味珍珠丸、坐珠達(dá)西、仁青常覺(jué)、仁青忙覺(jué)等眾多藏藥的重金屬問(wèn)題較為嚴(yán)重，極大影響了藏藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[9,10]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)珊瑚七十味丸的研究甚少，張勇倉(cāng)等[11]通過(guò)原子吸收分光光度法測(cè)定了珊瑚七十味丸中銅、鉛、鎘、砷、汞5種重金屬的含量，同時(shí)對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了考察。

對(duì)于植物藥中的重金屬成分，定量檢測(cè)和限量要求是維持其植物藥藥效有效性、穩(wěn)定性的前提條件。目前主流檢測(cè)方法主要有3 種：電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-OES）、原子熒光光譜（AFS）[12]。這 3 種方法都具有較高的精確度，相互之間沒(méi)有誤差，適用于不同的情況之下，在重金屬元素檢測(cè)中互為補(bǔ)充。其中ICP-MS的方法具有檢出限低[10-13]，可以進(jìn)行多元素和同位素分析，相應(yīng)范圍寬、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛的應(yīng)用到藥物重金屬元素的定量檢測(cè)中[13,14]。此外，金屬元素的存在形態(tài)和價(jià)態(tài)也與其相應(yīng)的生理毒性有關(guān)，在含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，通過(guò)X 射線光電子能譜（XPS）技術(shù)能夠完善中藥材重金屬元素的價(jià)態(tài)信息，這對(duì)于客觀、科學(xué)的評(píng)價(jià)中藥材的質(zhì)量和療效具有重要的意義。

本研究通過(guò)電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICPOES）對(duì)珊瑚七十味丸中重金屬元素的含量進(jìn)行測(cè)定，并借助X-射線電子能譜（XPS）表征技術(shù)對(duì)Hg 元素進(jìn)行價(jià)態(tài)分析，從而為名貴藏藥中重金屬含量的測(cè)定，以及存在形式的確定提供了一種準(zhǔn)確的新型研究方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：珊瑚七十味丸中重金屬元素的含量測(cè)定在ICPE-9000（等離子體發(fā)射光譜儀，SHIMADZU）上完成。XPS 表征測(cè)試采用Thermo ESCALAB 250 型能譜儀。

試劑：稀硝酸（65.0%-68.0%，分析純）及高氯酸（70.0%-72.0%，分析純）購(gòu)于南京化學(xué)試劑廠。砷、鎘、鉻、銅、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000μg·mL-1）由國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心提供。實(shí)驗(yàn)中的所有用水均為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

采用強(qiáng)酸消解法對(duì)樣品進(jìn)行前處理。稱(chēng)取研磨均勻的樣品0.025 g 于錐形瓶中，緩慢加入10 mL 稀硝酸，靜置。24 h 后，抽濾并收集濾液，用一次性濾膜反復(fù)過(guò)濾至濾液中不再有可視異物。最后，將濾液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用稀硝酸定容待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取砷、鉻、鎘、銅、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液各2.5 mL 分別置于25 mL 容量瓶中，用稀硝酸定容，配制成100%標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為0.1 mg·mL-1）。再量取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中分別定容，依次得到0、20%、40%、60%、80%濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

表1 ZYY藏藥有限公司某批次樣品中不同元素檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)量（%）

1.2.3 XPS測(cè)試樣品處理方法

將樣品研磨均勻后稱(chēng)取0.010 g進(jìn)行真空加熱，以除去表面吸附的雜質(zhì)。用雙面膠帶將樣品貼在托盤(pán)上并編號(hào)后，依次進(jìn)樣。內(nèi)標(biāo)設(shè)定為樣品C1s 譜線（285 eV），分別測(cè)定 Hg、As、Cr、Cd、Cu 等元素的 XPS圖譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 ICP-OES檢測(cè)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性

為了衡量評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)的離散程度，本研究采用標(biāo)準(zhǔn)差σ和變異系數(shù)CV 對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以ZYY 藏藥有限公司提供的樣品為例（表1）。

由表1可知，本研究方法所檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)均較小。一般儀器分析測(cè)試結(jié)果，其變異系數(shù)小于5%說(shuō)明測(cè)試的重復(fù)性好，數(shù)據(jù)可信度高。本研究測(cè)試結(jié)果中，Hg、As、Cd 和 Cu 元素的測(cè)試結(jié)果變異系數(shù)均小于5%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可信度高，實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。而Cr的變異系數(shù)偏大，則可能是實(shí)驗(yàn)測(cè)試中標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系稍有偏差，測(cè)出來(lái)的數(shù)據(jù)偏差較大。

2.2 ICP-OES 法測(cè)定不同批次來(lái)源樣品的重金屬含量

采用硝酸消解法對(duì)樣品的前處理后，分別對(duì)不同批次來(lái)源珊瑚七十味丸中的5種重金屬元素的含量進(jìn)行測(cè)定，每份樣品平行測(cè)定5次（表2）。其中S1-S7分別為不同批次購(gòu)買(mǎi)的ZYY 藏藥有限公司珊瑚七十味丸樣品（下同）。

由表2 可知，同一廠家不同批次的珊瑚七十味丸中，Hg、As、Cr、Cd、Cu 等金屬含量呈現(xiàn)不同程度的差異。甚至，同一種金屬元素在不同批次的樣品中，其含量差別較大。其中，S3 樣品與其他批次樣品相差較大，各重金屬含量均小于其他批次樣品中的同種元素。同時(shí)，在七個(gè)批次的樣品中各重金屬含量呈現(xiàn)出相似的比例大小，即Hg 含量較高，而Cd 含量極低。Hg 元素含量較高主要是由于珊瑚七十味丸中含有的瑪瑙等礦物質(zhì)所導(dǎo)致。然而，瑪瑙作為珊瑚七十味丸中的有效成分之一，致使Hg 元素的存在不可避免，這也是名貴藏藥普遍存在的用藥安全隱患。中藥材中常見(jiàn)的Cd 大多來(lái)自于殘留的農(nóng)藥和化肥[7]，而該7 份樣品的Cd含量極低，表明公司樣品在制備過(guò)程中有效避免農(nóng)藥所導(dǎo)致的重金屬外源性污染。

表2 不同批次珊瑚七十味丸中5種重金屬的含量（n = 5）%

2.3 XPS表征測(cè)試結(jié)果

對(duì)ZYY 藏藥有限公司某一批次樣品進(jìn)行XPS 元素價(jià)態(tài)分析（圖1a），從該XPS 總譜可以看出，珊瑚七十味丸中除了含有C、N、O 等基本元素外，還有部分Si、Hg、Cu、Ca 等元素。由于不同批次的樣品中 Hg 元素含量均較高，為進(jìn)一步研究Hg 元素的來(lái)源，本研究主要對(duì)Hg元素進(jìn)行了價(jià)態(tài)分析（圖1b-圖1h）。

如圖1b-圖1h 所示，Hg4f 的主峰可以拆分為101.0 eV（紫色）、103.7 eV（綠色）及105.0 eV（藍(lán)色）的三個(gè)峰，分別對(duì)應(yīng) Hg 4f7/2、游離Hg2+和Hg 4f5/2 電子層的電子結(jié)合能。其中，Hg 4f7/2和Hg 4f5/2分別歸屬于HgS 和HgO 的化學(xué)態(tài)[15]。HgS 主要源于珊瑚七十味丸中所含有的瑪瑙等礦物質(zhì)，而HgO 則源于藥物表面被氧化的Hg元素。毒理實(shí)驗(yàn)表明，游離Hg2+的生理活性雖然遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于HgS 及HgO 中的Hg 元素，但毒性卻較后者更大[6]。由圖1b-圖1c 和圖1f-圖1h 可以發(fā)現(xiàn)，S1、S2、S5、S6、S7 樣品中的Hg 元素含量及價(jià)態(tài)基本相同。然而，S4 中Hg 元素的峰強(qiáng)度超過(guò)其他批次樣品的兩倍，其中Hg 4f7/2、游離Hg2+和Hg 4f5/2 的峰強(qiáng)基本相同，表明S4樣品的藥效及毒性均較大。S3相較于其他批次樣品而言，其Hg2+的峰極強(qiáng)，而Hg 4f5/2 的峰極弱且并未發(fā)現(xiàn)Hg 4f7/2 的峰，表明樣品表面幾乎沒(méi)有HgS，僅有少量的HgO 存在，因而樣品中所含的Hg元素大多來(lái)源于游離Hg2+。

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，藏藥行業(yè)發(fā)展存在三大瓶頸：重金屬安全性問(wèn)題、質(zhì)量控制嚴(yán)重落后問(wèn)題和傳統(tǒng)復(fù)雜炮制工藝闡述問(wèn)題。由于歷史及地理環(huán)境原因，藏藥使用了較多的礦物藥和重金屬藥。藏藥重金屬的安全性問(wèn)題是制約藏藥發(fā)展的難點(diǎn)問(wèn)題，也是制約藏醫(yī)藥發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]。藏藥材本身成分復(fù)雜，且同種藥材炮制方法不同，藥性迥異。目前，炮制的依據(jù)和機(jī)制尚不清楚，且炮制工藝沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致藏藥的質(zhì)量和性能不穩(wěn)定。

重金屬通常是指比重≥5 的金屬元素，如金、銀、銅、鉛、鉻、鎘、汞等。食品衛(wèi)生中主要限制的是鉻、鎘、銅、鉛、汞等5種金屬元素。營(yíng)養(yǎng)化學(xué)、毒物學(xué)和環(huán)境污染研究中公認(rèn)銨、銻、銘、鎊、鉻、鎘、鉛、汞等對(duì)牲畜和人體有毒害作用，被稱(chēng)為污染元素，而錳、鈷、銅、釩、硒、鋁、鉻等在含量過(guò)高或形態(tài)不同時(shí)，對(duì)生命體系亦有毒害作用。按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，重金屬主要包括鉛、鎘、汞、銅、砷等。我國(guó)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》的限量指標(biāo)：重金屬總量應(yīng)≤20.0 mg·kg-1，鉛（Pb）≤ 5.0 mg·kg-1，鎘（Cd）≤ 0.3 mg·kg-1，汞（Hg）≤0.2 mg·kg-1，銅（Cu）≤ 20.0 mg·kg-1，砷（As）≤ 2.0 mg·kg-1。

眾多藏藥制劑含有的重金屬元素，與藏藥組方中多使用礦物藥密切相關(guān)，而傳統(tǒng)藏藥制劑的炮制工藝也是影響其重金屬存在的重要因素。對(duì)《藥品標(biāo)準(zhǔn)》藏藥(第一冊(cè))收載的200個(gè)成方制劑的分析，發(fā)現(xiàn)含有礦物藥的制劑86個(gè)，占制劑總數(shù)的43%，其中，金、銀、鐵、銅、珊瑚和瑪瑙是藏醫(yī)組方中經(jīng)常使用的礦物藥[17]。礦藥物的使用已被國(guó)內(nèi)礦物藥界公認(rèn)為獨(dú)立的藏醫(yī)藥體系，具有濃厚的民族色彩。幾千的藏醫(yī)臨床實(shí)踐認(rèn)識(shí)到礦物質(zhì)在治療疾病方面有一定的性和效，在臨床治療中發(fā)揮了重要作用。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度來(lái)看，微量元素碘、硒、鐵、銅、鋅、鉻、鈷等也是維持人體新陳代謝必不可少的。也就是說(shuō)，微量的重金屬元素也是人體需要的。當(dāng)然，過(guò)量的金屬元素也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生極大損傷，如錳過(guò)量時(shí)會(huì)引起甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)，砷可擴(kuò)張毛細(xì)血管，麻痹血管舒縮中樞，硒的氫化物毒性更強(qiáng)，長(zhǎng)期大量吸入，可引起急性和慢性中毒，錫和鉛是古代巨毒藥“鴆”中的重要成分，一定量入腹后凝固成塊，可使人至死[18,19]。這也反映出金屬元素就是一把雙刃劍，如何趨利避害，決定于其在人體的存在狀態(tài)及攝入的量。

圖1 七十味珍珠丸XPS圖譜

本研究采用ICP－OES 法測(cè)定珊瑚七十味丸中Hg、As、Cr、Cd、Cu這5種重金屬元素含量，其測(cè)定結(jié)果表明不同樣品中Hg 元素比例最高，Cr 含量比例最低。同時(shí)，不同樣品中各重金屬含量分別出現(xiàn)了較大差別。珊瑚七十味丸作為一個(gè)處方保密的名貴藏藥，其整個(gè)炮制工序在藏藥中最繁瑣，技術(shù)難度最大，但伴隨著藏藥的現(xiàn)代化和規(guī)?；a(chǎn)，珊瑚七十味丸在生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍沒(méi)有得到嚴(yán)格控制，致使不同批次的樣品中化學(xué)成分含量不同，尤其是重金屬含量出現(xiàn)了較大差異。此外，藏藥二十五味珊瑚丸也存在不同樣品各重金屬元素含量不同的現(xiàn)象[20]。那么不同藏藥樣品中重金屬元素含量的不同，對(duì)其臨床療效是否有影響，目前尚未有此類(lèi)報(bào)道。索有瑞等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明七十味珍珠丸含有的Hg、As、Pb、Cu、Zn等重金屬元素被機(jī)體吸收不多，大部分被排出體外[21,22]。曾勇通過(guò)給予成年大鼠藥物，證明傳統(tǒng)藏醫(yī)藥中廣泛使用的重要原料“佐塔”中的汞在體內(nèi)經(jīng)消化道吸收較低微或可能未有吸收[7]。由此可猜測(cè)，珊瑚七十味丸中Hg、As、Pb、Cu、Zn 等金屬元素只有少量被機(jī)體吸收，絕大部分可能被排出體外。因此，這些重金屬元素在珊瑚七十味丸的藥理藥效上可能并未發(fā)揮關(guān)鍵作用，而臨床效果應(yīng)該差別不大。但確切的臨床療效差別以及這些重金屬在藥理藥效方面的作用還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

雖然有實(shí)驗(yàn)表明，一些藏藥制劑中的重金屬元素絕大部分可通過(guò)胃腸道代謝排出體外，但由于病人可能存在長(zhǎng)期服藥的情況，所以潛在的用藥安全隱患仍需引起重視。特別是Hg 元素具有高毒性、高反應(yīng)性和累積效應(yīng)，在低濃度水平也可能產(chǎn)生毒害影響[6,7]。有研究表明，汞可抑制微生物的生命代謝活動(dòng)并在微生物體內(nèi)蓄積轉(zhuǎn)化[23]，汞及其化合物作為環(huán)境毒物可對(duì)機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和腎臟等組織系統(tǒng)造成損傷，其中以無(wú)機(jī)汞、甲基汞對(duì)機(jī)體的危害最大。無(wú)機(jī)汞在胃腸道內(nèi)的吸收率很低，且不易于透過(guò)血腦屏障。因此，作為動(dòng)物機(jī)體最重要的毒物排泄器官——腎臟[24]，是無(wú)機(jī)汞發(fā)揮毒性的主要靶器官之一。向麗以藏藥“佐太”為研究對(duì)象，對(duì)其長(zhǎng)期用藥后藥物中重金屬汞在血液和腎臟中的蓄積行為，以及對(duì)腎臟的潛在腎毒性作用進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期給予藏藥“佐太”，可引起大鼠血汞含量升高，并造成汞在腎臟大量蓄積，并且長(zhǎng)期停藥后仍有殘留，推測(cè)汞在腎臟中為永久性不可逆的蓄積[25]。因此，臨床上對(duì)于使用佐太、坐珠達(dá)西、七十味珍珠丸等含有汞的藏藥[10,26]，不僅要對(duì)使用時(shí)間和劑量進(jìn)行控制，還要對(duì)患者的血汞及腎功能相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)。而殘留在腎臟中的汞是否對(duì)機(jī)體會(huì)有進(jìn)一步的損傷，還需進(jìn)一步深入研究。

為了更加安全、有效、可控的使用中醫(yī)藥資源，研究其重金屬物質(zhì)的組成，含量和價(jià)態(tài)為其質(zhì)量控制尤為重要。尤其對(duì)于這樣多組分的復(fù)雜民族藥物，質(zhì)量安全和可控是關(guān)系到臨床用藥安全的前提條件，建立起相應(yīng)的指紋圖譜以及重金屬元素圖譜信息，對(duì)藏藥珊瑚七十味丸在臨床應(yīng)用中的質(zhì)量控制非常重要，也是推動(dòng)傳統(tǒng)藏藥發(fā)展的必經(jīng)之路。

4 結(jié)論

藏藥珊瑚七十味丸作為含重金屬藏藥的典型代表，由于其不同有效成分的協(xié)同作用及其作用的復(fù)雜性，使其質(zhì)量和安全性難以控制。本研究通過(guò)硝酸消解法對(duì)7 個(gè)批次生產(chǎn)的珊瑚七十味丸進(jìn)行前處理，采用ICP-OES 和XPS 對(duì)藥物中的5 種重金屬含量和Hg元素的價(jià)態(tài)進(jìn)行較為準(zhǔn)確的檢測(cè)和分析，為珊瑚七十味丸的臨床使用提供數(shù)據(jù)上的參考依據(jù)，也為傳統(tǒng)道地藏藥材中的重金屬含量檢測(cè)及價(jià)態(tài)分析提供了一種新的研究思路和方法。