含揮發(fā)油飲片標準湯劑探討研究
——以紫蘇葉為例＊

張開雪 ，鄔 蘭 ，韓宗賢 ，鹿江南 ，馬 偉 ，熊超，丁丹丹，陳士林＊＊

（1. 中國中醫(yī)科學院中藥研究所 北京 100700；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院 哈爾濱 150040；3. 武漢理工大學化學化工與生命科學學院 武漢 430070；4. 江陰天江藥業(yè)有限公司 無錫 214434）

紫蘇葉來源為唇形科紫蘇Perilla frutescens(L.)Britt.的干燥葉（或帶嫩枝）[1]，出自《名醫(yī)別錄》，并被列為中品。除了葉，紫蘇的果實和莖也可入藥。紫蘇具有強生命力，對環(huán)境要求不高，全國分布廣泛，種植歷史已超2000年，在日本、韓國、印度、美國、加拿大等國家也有分布，而且很多地區(qū)已實現(xiàn)了大范圍的商業(yè)栽培。

目前，由于其富含獨特的活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分，紫蘇已經(jīng)成為一種全世界人民關(guān)注的焦點植物。紫蘇葉是臨床上使用頻率較多的中藥，同時它也常被作為蔬菜食用，含有多種維生素及礦物質(zhì)。另外，紫蘇葉中還含有揮發(fā)油，相關(guān)研究證明揮發(fā)油具有抗癌、抗氧化、抗菌等作用[1-4]。如今，紫蘇葉揮發(fā)油不僅在醫(yī)藥、食品行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，而且在化妝品、營養(yǎng)保健、工業(yè)用油、香料工業(yè)等方面也取得了一定的成績，具有很高的開發(fā)價值和利用價值[3,5]?！吨袊幍洹?015年版也把紫蘇葉揮發(fā)油含量作為藥材質(zhì)量控制的指標。截止到今天，類似于紫蘇葉揮發(fā)油的研究已經(jīng)有了大量的文獻報道[6-7]，但是與紫蘇葉水提液相關(guān)的研究報道并不常見。湯劑是我國古代最傳統(tǒng)的、最常用的且應(yīng)用最廣泛的一種用藥方式，臨床上治療疾病也多用湯劑。標準湯劑的引入有利于臨床用藥的準確性和劑量的統(tǒng)一性，改變目前的監(jiān)管困局，改善管理水平，保障臨床療效，促進用藥質(zhì)量的提高，促進制造工藝的提升，為中藥研究的標準化提供依據(jù)[8-11]。因此，開展紫蘇葉標準湯劑質(zhì)量評價方法的研究是有必要的。本文以17批紫蘇葉為原料，參考含揮發(fā)油飲片桂枝[12]、姜黃[13]、肉桂[14]的標準湯劑研究，按照統(tǒng)一的標準制備紫蘇葉飲片標準湯劑，以紫蘇葉揮發(fā)油的含量為指標，確定轉(zhuǎn)移率和出膏率的范圍，測定pH 值，并通過HPLC 法建立紫蘇葉標準湯劑的指紋圖譜分析方法，尋找最適合紫蘇葉標準湯劑的定量指標成分，為紫蘇葉標準湯劑質(zhì)量標準的制定提供參考數(shù)據(jù)。

表1 紫蘇葉樣品信息

1 材料

1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）；Sartorius-BP211D 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；YP6001型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；FE20 型pH 計（瑞士METTLER-TOLEDO 公司）；Scanspeed mini 型高速離心機（丹麥Labogene公司）。

樣品來自5 個地區(qū)，分別為江蘇、河北、江西、河南和浙江，共計17批。經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所孫偉副研究員鑒定和DNA 條形碼實驗證實，所有樣品均為唇形科植物紫蘇Perilla frutescens(L.) Britt（.表1）?？Х人釋φ掌罚ㄅ朚UST-17032010，含量 ≥99.48%），迷迭香酸對照品（批號MUST-17040532，含量 ≥99.40%），野黃芩苷對照品（批號MUST-17030406，含量≥98.74%），且以上對照品全部從成都曼思特生物科技有限公司購買。實驗中所用乙腈為色譜純（Thermo Fisher公司），水為超純水，其它試劑均為分析純。

表2 紫蘇葉揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率計算結(jié)果（）

表2 紫蘇葉揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率計算結(jié)果（）

images/BZ_22_349_1572_437_1609.png/%87.20±11.84編號ZSY-01 ZSY-02 ZSY-03 ZSY-04 ZSY-05 ZSY-06 ZSY-07 ZSY-08 ZSY-09 ZSY-10 ZSY-11 ZSY-12 ZSY-13 ZSY-14 ZSY-15 ZSY-16 ZSY-17飲片中揮發(fā)油含量/%（mL·g-1）1.00 1.00 1.00 0.30 0.40 0.40 0.80 1.20 0.50 0.80 0.60 0.50 0.30 0.80 0.80 0.90 1.00標準湯劑中揮發(fā)油含量/%（mL·g-1）1.00 0.80 0.80 0.30 0.40 0.40 0.70 1.00 0.40 0.50 0.60 0.40 0.30 0.75 0.70 0.70 0.70轉(zhuǎn)移率/%100.00 80.00 80.00 100.00 100.00 100.00 87.50 83.30 80.00 62.50 100.00 80.00 100.00 93.75 87.50 77.78 70.00

2 方法與結(jié)果

2.1 定量測定

2.1.1 供試品溶液的制備

（1）飲片供試品溶液制備

根據(jù)《中國藥典》2015 年版揮發(fā)油測定法（通則2204）測定，取 ZSY-01 至 ZSY-17 紫蘇葉飲片適量，保持微沸2.5 h，即得。

（2）標準湯劑供試品溶液制備

參照含揮發(fā)油飲片桂枝[12]、姜黃[13]、肉桂[14]的標準湯劑制備工藝，結(jié)合陳士林老師2016 年發(fā)表的“中藥飲片標準湯劑研究策略”一文中對于花葉類飲片制備方法的敘述，最終確定具體提取工藝如下。稱100 g紫蘇葉，置圓底燒瓶中，加12 倍量水浸泡30 min，在揮發(fā)油提取器中提取2 h，得揮發(fā)油，提取液過濾；向余下的殘渣中再加入10倍量水，在揮發(fā)油提取器中繼續(xù)提取30 min，得揮發(fā)油，提取液過濾。將兩次得到的揮發(fā)油合并、提取液合并，待提取液濃縮至適量后，再將揮發(fā)油加入其中，定容至500 mL，即得標準湯劑供試品溶液。

2.1.2 測定法

分別測定飲片供試品溶液和標準湯劑供試品溶液中所得揮發(fā)油的量（表2）。

表3 紫蘇葉標準湯劑pH值及出膏率

2.2 轉(zhuǎn)移率和出膏率

2.2.1 揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率

基于飲片中揮發(fā)油的含量測定結(jié)果和標準湯劑中揮發(fā)油的含量測定結(jié)果，計算紫蘇葉的揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率（表2）：轉(zhuǎn)移率（%）= W·M-1*100%，W 表示湯劑中揮發(fā)油的量（mL），M 表示飲片中揮發(fā)油的量（mL）。揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率范圍為62.50%-100.00%，平均值為87.20，RSD值為13.58%。

2.2.2 出膏率

取干燥至恒重的蒸發(fā)皿，精密加入“2.1.1（2）”項下標準湯劑供試品溶液各25 mL，平行兩份，水浴蒸干，在105℃烘箱中干燥3 h，移置干燥器中，冷卻30 min，稱重，計算得到紫蘇葉標準湯劑的出膏率，其中出膏率范圍為14.50%-24.80%（表3）。

2.3 pH值測定

取“2.1.1（2）”項下標準湯劑供試品溶液適量，用pH 計測定 pH 值，得到 pH 范圍在 4.70-5.25 之間，平均值為4.90，RSD值為2.7%，波動不大（表3）。

2.4 紫蘇葉標準湯劑指紋圖譜

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Aligent-Eclipse Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）。流動相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫條件：0-50 min，12%-19%B；50-60 min，19-22% B。柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：325 nm。

2.4.2 標準湯劑供試品溶液的制備

精密量取紫蘇葉標準湯劑供試品溶液0.8 mL和水0.8 mL，置于同一離心管中，混勻，12000 rpm離心5 min，取上清液用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 對照品溶液制備

取咖啡酸、野黃芩苷和迷迭香酸對照品適量，精密稱定，加甲醇配制成濃度均為20 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.4.4 測定法

精密吸取17批次的標準湯劑供試品溶液各10 μL、混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

2.4.5 方法學驗證

（1）精密度實驗

取批號為ZSY-01 的樣品制備的紫蘇葉標準湯劑供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，以7號峰作為參照峰，對主要共有峰的相對峰面積和相對保留時間進行測定。結(jié)果表明RSD 均＜2%，表明儀器精密度良好。

（2）重復性實驗

取批號為ZSY-01 的樣品平行制備6 份紫蘇葉標準湯劑供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件進樣，以7號峰作為參照峰，對主要共有峰的相對峰面積和相對保留時間進行測定。其結(jié)果顯示RSD 均＜2%，表明本方法重復性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗

取批號為ZSY-01 的樣品制備紫蘇葉標準湯劑供試品溶液，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h 進行測定，按2.4.1 項下色譜條件進樣，以7 號峰作為參照峰，對主要共有峰的相對峰面積和相對保留時間進行測定。結(jié)果顯示RSD 均＜2%，表明紫蘇葉標準湯劑供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 指紋圖譜的建立及共有峰的標定

精密吸取17批次的紫蘇葉標準湯劑供試品溶液，按2.4.1 項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰信息（見圖1）。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件對所得到的17 批指紋圖譜進行分析，生成對照指紋圖譜，結(jié)果表明17批紫蘇葉標準湯劑的指紋圖譜與對照指紋圖譜間相似度均超過0.8（表4），發(fā)現(xiàn)共有峰有7 個，通過對照品指認出3 個共有峰，其中 1 號峰：咖啡酸，6 號峰：野黃芩苷，7 號峰：迷迭香酸，以7 號峰作為參照峰，得到7 個共有峰的相對保留時間和相對峰面積（表5）。

圖1 17批紫蘇葉標準湯劑的HPLC指紋圖譜

2.4.7 標準湯劑中共有峰的含量測定

根據(jù)2.4.4 項下測定結(jié)果，得到17 批紫蘇葉標準湯劑中咖啡酸含量范圍為53.71-209.85 μg·mL-1，野黃芩苷的含量范圍為144.62-1985.16 μg·mL-1，迷迭香酸的含量范圍為121.08-1465.46 μg·mL-1（表6）。

2.5 紫蘇葉標準湯劑中定量指標成分探討

《中國藥典》2015 年版紫蘇葉飲片項下僅規(guī)定了揮發(fā)油的含量，并沒有規(guī)定某一種確定的指標成分，因此需要尋找適合紫蘇葉標準湯劑的指標成分來用于定量研究?；诖?，對指紋圖譜中已指認的三個共有峰通過對照品進行初步定量計算，本研究中選擇迷迭香酸作為定量控制指標成分，所研究的17批紫蘇葉標準湯劑中迷迭香酸含量為121.08-1465.46 μg·mL-1，可用于紫蘇葉標準湯劑定量控制。

3 討論

《中國藥典》2015 年版收載了紫蘇子、紫蘇梗和紫蘇葉三種藥材，它們的來源均為唇形科植物紫蘇，只是取自其原植物紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的三個不同藥用部位，分別為果實、莖、葉。當中還規(guī)定迷迭香酸是紫蘇子藥材、飲片和紫蘇梗藥材的指標成分；紫蘇葉藥材和飲片都規(guī)定了揮發(fā)油含量限定，沒有規(guī)定具體的指標成分。對于紫蘇葉標準湯劑僅以揮發(fā)油含量作為是否合格的標準較為單一，缺乏對其主要成分的定性分析，所以本文對紫蘇葉標準湯劑的指紋圖譜進行研究并指認了部分共有峰。以特征峰個數(shù)多和峰形好為依據(jù)，通過DAD 全波長掃描實驗，最終確定指紋圖譜檢測波長為325 nm，并在此波長下指認出3 個成分：咖啡酸，野黃芩苷，迷迭香酸。迷迭香酸是藥典規(guī)定的紫蘇子藥材和飲片以及紫蘇梗藥材的質(zhì)控指標，并不是紫蘇葉所特有的成分，在其他藥材，如夏枯草和薄荷中也含有迷迭香酸這一成分，因此是否選擇迷迭香酸作為紫蘇葉的質(zhì)控指標是需要討論的。由于迷迭香酸在紫蘇葉標準湯劑中含量相對較高，穩(wěn)定性佳，也是其發(fā)揮藥效的活性成分[4]，因此暫定為紫蘇葉標準湯劑的質(zhì)量控制指標成分。待未來進行更深入的研究后可建議增加新的指標成分，如指紋圖譜中的其他成分如野黃芩苷等。

表4 17批紫蘇葉標準湯劑指紋圖譜相似度匹配

表5 紫蘇葉標準湯劑共有峰的相對保留時間與相對峰面積

標準湯劑質(zhì)量控制主要從定性和定量兩方面著手，定量包括了指標成分轉(zhuǎn)移率、湯劑出膏率、pH等參數(shù)；定性則為控制整體成分的指紋圖譜。指標成分是基于藥典指標，具有法定效力，通過計算指標成分轉(zhuǎn)移率，可明確有效成分傳遞規(guī)律；出膏率是標準湯劑整體成分的反映。通過出膏率既可以反映已知成分，又可以反映未知成分[15]。此外，出膏率還可為后續(xù)的配方顆粒成品量提供參考數(shù)據(jù)。pH 可以作為輔助參考。指紋圖譜不僅能反應(yīng)標準湯劑的主要化學成分，還能有效反應(yīng)配方顆粒等失去中藥外表特征的中藥制劑的主要化學成分，這一方法的出現(xiàn)為紫蘇葉標準湯劑質(zhì)量標準提供參考。

紫蘇葉含有揮發(fā)油，為了更好的保留這類成分，測定這類藥材時，需要將其單獨提取出來，參考含揮發(fā)油飲片-桂枝，姜黃，肉桂標準湯劑制備中揮發(fā)油的提取工藝，即采用揮發(fā)油提取器提取揮發(fā)油，頭煎2 h，二煎0.5 h，而后將提取到的紫蘇葉揮發(fā)油兌入濃縮的湯劑中。藥典中明確規(guī)定紫蘇葉飲片揮發(fā)油含量最少為0.20%（mL·g-1），本研究以5個產(chǎn)地不同規(guī)格等級的17批紫蘇葉飲片為研究對象，測得紫蘇葉飲片的揮發(fā)油含量為0.30-1.20%（mL·g-1），紫蘇葉標準湯劑的揮發(fā)油含量為0.30-1.00%（mL·g-1），揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率為87.20±11.84%，該數(shù)值說明紫蘇葉標準湯劑揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率較高。

表6 紫蘇葉標準湯劑中3個共有峰的含量結(jié)果

本文以17 批不同產(chǎn)地的紫蘇葉標準湯劑為研究對象，建立紫蘇葉標準湯劑的質(zhì)量評價方法，經(jīng)測定，17 批紫蘇葉飲片揮發(fā)油含量均符合藥典規(guī)定的要求，但是不同批次間揮發(fā)油含量還是存在很大差異。所得紫蘇葉標準湯劑的出膏率范圍為14.50%-24.80%，揮發(fā)油的轉(zhuǎn)移率范圍為62.50%-100.00%，pH 值范圍為4.70-5.25。經(jīng)“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件進行色譜峰匹配，結(jié)果表明17 批紫蘇葉標準湯劑指紋圖譜相似度相對較高，均大于0.8，確定共有峰7 個，指認3 個?？Х人岬暮糠秶鸀?3.71-209.85 μg·mL-1，野 黃 芩 苷 的 含 量 范 圍 為144.62-1985.16 μg·mL-1，迷 迭 香 酸 的 含 量 范 圍 為121.08-1465.46 μg·mL-1，建立的紫蘇葉標準湯劑的質(zhì)量評價方法可為紫蘇葉標準湯劑質(zhì)量標準的制定提供參考數(shù)據(jù)。