外泌體膜蛋白功能研究進展＊

郭玲慧，王 煒，蔣 露，任偉宏＊＊，賀 嬌，郭夢琦

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 鄭州 450000；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科 鄭州 450000）

外泌體中包含功能蛋白、mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）等多種具有生物活性的物質(zhì)，且外泌體的膜結(jié)構(gòu)上存在多種抗原和抗體分子，能產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)[1]。然而，細胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）物種的異質(zhì)性和非特異性、分離技術(shù)的多樣性以及外泌體與其他囊泡在密度、大小、成分上的重合性，都使其難以確定分離到的囊泡是否為外泌體，這一問題的解決取決于外泌體標(biāo)志物的篩選[2]。如經(jīng)典的外泌體標(biāo)志物有CD9、CD63、CD81 等，這些蛋白質(zhì)主要定位于外泌體膜上[3]。除此之外，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)外泌體膜蛋白在外泌體生物合成、分泌及細胞與細胞間通訊等方面發(fā)揮重要作用，而攝取過程與外泌體膜蛋白與受體細胞相互作用有關(guān)[3，4]?，F(xiàn)已有研究[2]表明，利用外泌體包裝天然藥物，提高天然藥物在體內(nèi)的生物利用度，并賦予天然藥物的靶向性，而這些作用與外泌體膜蛋白密切相關(guān)。因此，需要對外泌體膜蛋白的種類及功能進行深入研究，提高外泌體在臨床的應(yīng)用價值。

1 外泌體簡介

EVs是多種細胞主動向胞外分泌的脂質(zhì)雙層膜囊泡，根據(jù)其大小、生物學(xué)特征及形成過程，可分為外泌體、微泡和凋亡小體等[5]。外泌體是多泡小體（Multivesicular bodies, MVBs）與細胞膜融合后釋放的管腔內(nèi)囊泡（Intraluminal vesicles，ILVs），其直徑為30-150 nm，在電鏡下呈杯狀結(jié)構(gòu)[6]。外泌體起源于內(nèi)體系統(tǒng)，細胞質(zhì)膜向內(nèi)凹陷形成初級內(nèi)吞囊泡，多個初級內(nèi)吞囊泡融合形成早期內(nèi)體（Early endosomes，EEs），通過網(wǎng)格蛋白或小孔蛋白依賴或獨立的途徑包裹細胞內(nèi)容物形成多個ILVs，進一步形成晚期內(nèi)體（Late endosomes，LEs），也稱 MVBs。然后，Rab27A 和Rab27B將MVBs引向細胞膜，在可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白（SolubleN-ethylmaleimidesensitive factor attachment proteins，SNARE）的協(xié)助下促進MVBs與質(zhì)膜融合，將ILVs釋放到細胞外，即為外泌體[7]。

外泌體的內(nèi)體起源也反映在其蛋白質(zhì)組成中，包括凋亡連接相關(guān)基因2 相互作用蛋白X（Apoptosislinked gene 2-interacting protein X，Alix）、CD63 和腫瘤易感基因101 蛋白質(zhì)（Tumour susceptibility gene 101，TSG101）。所有的外泌體均含有參與轉(zhuǎn)運和融合的蛋白質(zhì)（如Rab GTP 酶、Annexins 等）。其內(nèi)容物中細胞骨架蛋白、黏附因子和四跨膜蛋白家族蛋白（如四跨膜蛋白CD63、CD81和CD82）也很豐富。

外泌體的內(nèi)容物不僅表明了供體細胞的組成，而且反映了一種調(diào)節(jié)的分選機制。外泌體的膜表面及內(nèi)部包括各種蛋白質(zhì)（如受體、轉(zhuǎn)錄因子和細胞外基質(zhì)蛋白等）、脂質(zhì)和核酸，如mRNA、miRNA 和長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）。對外泌體蛋白質(zhì)的組成分析發(fā)現(xiàn)，某些蛋白質(zhì)起源于特定的細胞和組織，而某些蛋白質(zhì)在外泌體中普遍存在。例如，B 淋巴細胞和樹突狀細胞（Dendritic cells，DCs）分泌的外泌體攜帶主要組織相容性復(fù)合物（Major histocompatibility complex，MHC）I 類和II 類蛋白，活化T 細胞的外泌體含有可誘導(dǎo)T 細胞凋亡的生物活性Fas 配體，一些腫瘤細胞分泌的外泌體攜帶與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的黏附分子、金屬蛋白酶和組織特異性蛋白[8]。而一系列融合和轉(zhuǎn)運蛋白（如Rab2、Rab7、Flotillion和Annexin）、熱休克蛋白（如HSP70和HSP90）、細胞骨架蛋白（包括肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白）以及介導(dǎo)MVBs 形成的Alix 等蛋白質(zhì)屬于外泌體的非特異性蛋白質(zhì)[7]。

外泌體可介導(dǎo)細胞間通訊，其將內(nèi)含的多種物質(zhì)，傳遞給受體細胞，引起受體細胞的表型和功能發(fā)生變化。如腫瘤細胞分泌的外泌體裝載有多種內(nèi)容物，將其轉(zhuǎn)移至受體細胞，導(dǎo)致受體細胞的表型改變，從而促進腫瘤的進展[9]。近年來，外泌體作為納米級囊泡裝載藥物用于疾病的靶向治療也成為研究熱點。有研究[10]表明，外泌體包裹姜黃素，可用于腦部疾病的治療，并且能夠提高姜黃素的生物利用度；姜黃素封裝于外泌體遞送，能夠治療炎性疾病，且無明顯副作用。而外泌體遞送功能的完成與膜蛋白有關(guān)。

2 外泌體膜蛋白分類

圖1 外泌體蛋白質(zhì)分類

圖2 外泌體膜蛋白來源

圖3 Gene ontology(Biological process)分類

前期外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究為認識外泌體膜蛋白的種類奠定了基礎(chǔ)，本文將蛋白質(zhì)組學(xué)研究數(shù)據(jù)[11-15]進行匯總。將目前已知的外泌體蛋白質(zhì)進行整理，根據(jù)Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）的注釋，本文對1858種存在于外泌體中的蛋白質(zhì)進行分類（圖1），外泌體中的蛋白質(zhì)79.28%屬于膜蛋白和胞質(zhì)蛋白，且外泌體特有的蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)的比例僅為0.22%。對622種外泌體膜蛋白進一步分析其來源（圖2），可知外泌體膜蛋白多來源于細胞膜蛋白和細胞器膜蛋白（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等）。此外，對這些外泌體上的膜蛋白進行生物學(xué)過程（Biological process）進行分類（圖3），得出外泌體膜蛋白常見的四種功能，其中參與轉(zhuǎn)運功能的膜蛋白占42%、參與信號傳導(dǎo)的膜蛋白占18%、參與抗原處理與呈遞的膜蛋白占15%、參與胞吞與胞吐的膜蛋白占15%。由此可知外泌體膜蛋白最重要的功能是協(xié)助外泌體轉(zhuǎn)運其內(nèi)容物，其次是將信號傳導(dǎo)至受體細胞，引起受體細胞的生理或病理的變化，其還參與免疫過程以及胞吞作用釋放外泌體和受體細胞內(nèi)化外泌體。

3 外泌體膜蛋白功能

3.1 轉(zhuǎn)運功能

外泌體的轉(zhuǎn)運功能是指外泌體可將其裝載的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物活性分子轉(zhuǎn)運至受體細胞。外泌體轉(zhuǎn)運其內(nèi)容物的功能已被證實，但參與協(xié)助完成該轉(zhuǎn)運過程的外泌體膜蛋白尚不明確[16，17]。目前認為，外泌體轉(zhuǎn)運功能與受體細胞攝取過程密切相關(guān)。

外泌體經(jīng)典標(biāo)志物CD9，位于外泌體膜上，參與細胞運動、粘附和融合[18]。因此推測CD9 可能介導(dǎo)受體細胞攝取外泌體，參與轉(zhuǎn)運外泌體的內(nèi)容物至受體細胞。此外，外泌體膜上的縫隙連接蛋白（Connexins,Cxs）可在外泌體膜和細胞膜之間形成六聚體半通道，將外泌體內(nèi)的小分子物質(zhì)（＜1 kDa，例如第二信使、離子和代謝物等）遞送到受體細胞[19，20]。

受體細胞在外泌體膜轉(zhuǎn)運蛋白的作用下攝取外泌體，導(dǎo)致受體細胞中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸水平發(fā)生變化，進而使受體細胞的功能發(fā)生變化。例如，人原代角質(zhì)形成細胞攝取來源于大皰性類天皰瘡患者水皰液的外泌體后，外泌體誘導(dǎo)人原代角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生關(guān)鍵的炎性細胞因子和趨化因子，促進大皰性類天皰瘡相關(guān)的皮膚局部自體炎癥反應(yīng)[21]。外泌體還可通過轉(zhuǎn)運其內(nèi)容物對病原體感染和抗感染的雙向調(diào)節(jié)作用[22，23]。在免疫突觸形成的過程中，CD63+外泌體將miRNA 從T 細胞單向轉(zhuǎn)移至抗原呈遞細胞（Antigen-presenting cells，APC），導(dǎo)致受體細胞中的基因表達發(fā)生變化[23]。盡管許多外泌體膜蛋白都可以在轉(zhuǎn)運功能中發(fā)揮重要作用，但是具體的調(diào)節(jié)機制仍需進一步的探索。

3.2 信號傳導(dǎo)

外泌體膜蛋白除在外泌體內(nèi)容物轉(zhuǎn)運至受體細胞，進行細胞間信息傳遞中發(fā)揮作用外，外泌體膜蛋白還可與受體細胞表面的受體蛋白相互作用，作為細胞外信號刺激物質(zhì)，引起受體細胞一系列的變化，即信號傳導(dǎo)功能。盡管已有文獻[24-26]表明，外泌體參與細胞間信號傳導(dǎo)，但是其對細胞信號傳導(dǎo)途徑的影響尚未完全闡明。

已有研究[27，28]發(fā)現(xiàn)外泌體膜蛋白可激活細胞內(nèi)通路，影響受體細胞功能。例如，外泌體膜蛋白cAMP 1直接活化交換蛋白1（Exchange protein directly activated by cAMP 1，EPAC 1）通過磷酸二酯酶3B（phosphodies‐terase type-3B,PDE3B）與Rap 鳥嘌呤核苷酸交換因子3（Rap guanine nucleotide exchange factor 3，RAPGEF3）和磷酸肌醇-3 調(diào)節(jié)亞基6（Phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit，PIK3R6）結(jié)合，將 PDE3B 組裝在一個信號復(fù)合體中，在這個信號復(fù)合體激活PI3Kγ復(fù)合體，參與血管生成，EPAC 1 也可通過獨立于Rho 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，在調(diào)節(jié)cAMP 誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障功能的動態(tài)控制中起作用。外泌體膜蛋白黏蛋白-1（Mucin-1，MUC1）β亞基含有羧基末端結(jié)構(gòu)域，其通過磷酸化和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用參與細胞信號傳導(dǎo)，可調(diào)節(jié)ERK（Extracelluar regulated protein kinases，ERK）、SRC 和NF-κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）途徑中的信號傳導(dǎo)，且在活化的T 細胞中，其可直接或間接影響Ras/MAPK 途徑（https://www.uniprot.org/uniprot/P15941）。

MVBs 形成期間的蛋白質(zhì)組成是外泌體分選中的關(guān)鍵分子，外泌體從宿主細胞釋放，外泌體上的信號配體與受體細胞上的受體相互作用，誘導(dǎo)下游信號級聯(lián)，這一過程在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。胰腺導(dǎo)管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）衍生的外泌體在Kuppffer 細胞中誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factorβ，TGF-β）信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致肝星狀細胞（Hepatic stellate cells，hStCs）的活化和細胞外基質(zhì)重塑[29]，但激活TGF-β信號的外泌體膜蛋白仍需進一步探究。

3.3 抗原的處理和呈遞

外泌體通過抗原呈遞作用參與到免疫調(diào)節(jié)，并且在不同的生理或病理條件下，會產(chǎn)生促進或抑制免疫應(yīng)答的作用。外泌體膜中含有的共刺激分子，參與MHC Ⅰ類和Ⅱ類途徑的抗原呈遞，激活免疫系統(tǒng)[26]。例如，DCs分泌的外泌體膜表面含有MHC Ⅰ類和Ⅱ類分子，可以呈遞腫瘤抗原[30]；APC 分泌的外泌體膜上含有抗原呈遞肽-MHC Ⅰ類復(fù)合物，與CD8+T細胞結(jié)合，激活T 細胞的增殖和分化，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[23]。Burrello 等[31]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞和干細胞分泌的外泌體可攜帶免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)物（如轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA和細胞因子）抑制機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

此外，還有多種定位于外泌體膜上的蛋白質(zhì)參與對抗原的處理和呈遞。例如，組織相容性抗原Ⅰ類（HLA Ⅰ）、整合素αv和β5可通過MHC Ⅰ類參與抗原的處理呈遞[32]。HLA Ⅱ類 DMα和β鏈可結(jié)合MHC Ⅱ類蛋白，并且可通過MHC Ⅱ類參與外源性抗原的處理和呈遞。銜接子相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合物-2（adaptorrelated protein complex-2，AP-2）的多種亞基也可通過MHC Ⅱ類參與外源性抗原的處理與呈遞。這些研究表明外泌體膜蛋白在抗原的處理和呈遞中發(fā)揮重要作用。

外泌體除了參與抗原的處理和呈遞外，還可充當(dāng)維持人體穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑。由于外泌體可以充當(dāng)不同免疫細胞之間的信使這一事實，因此探究外泌體在免疫系統(tǒng)中的作用尤其重要。例如，來自間充質(zhì)干細胞（Mesenchymal stem cell，MSC）的外泌體可激活 Toll 樣受體的信號傳導(dǎo)，增強白細胞介素-10（IL-10）表達，減弱炎癥的程度[23]。轉(zhuǎn)移性黑色素瘤可釋放表面攜帶程序性死亡配體1（Programmed death ligand 1，PD-L1）的外泌體，含有上調(diào)表達PD-L1 的外泌體，可抑制CD8+T 細胞的功能，促進腫瘤生長[33]?？傊?，對外泌體膜蛋白的深入研究，有利于更好地了解外泌體在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮的作用，以便更好地調(diào)控免疫系統(tǒng)。

3.4 胞吐和胞吞

囊泡的胞吐作用是調(diào)節(jié)許多生物事件的基本細胞過程，例如神經(jīng)遞質(zhì)、激素和細胞因子的釋放以及蛋白質(zhì)和脂質(zhì)向質(zhì)膜的遞送，用于細胞修復(fù)、生長、遷移和細胞信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)[34]。胞吞作用即指細胞膜接觸大分子或顆粒狀物質(zhì)后，伸出偽足包圍抗原形成小泡并吞入細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運過程，又稱內(nèi)化。外泌體作為囊泡的一種，其分泌和攝取與胞吐和胞吞過程緊密聯(lián)系。

MVBs 與質(zhì)膜的融合，是外泌體釋放到胞外環(huán)境的必要環(huán)節(jié)。目前已知參與胞吐釋放外泌體的38 種膜蛋白。Rab GTP 酶在外泌體產(chǎn)生中起重要作用，它們調(diào)節(jié)內(nèi)體在細胞內(nèi)運輸（MVBs 起源）以及將囊泡運輸?shù)劫|(zhì)膜并隨后從細胞中釋放[35-37]。此外，外泌體膜蛋白CD9 與胞吐作用產(chǎn)生外泌體密切相關(guān)，其能夠促進外泌體的產(chǎn)生和釋放[38-39]。

外泌體釋放到細胞外環(huán)境后，隨著血液循環(huán)，最終與配體結(jié)合，以內(nèi)化等方式進入受體細胞。較小的外泌體可通過網(wǎng)格蛋白（Clathrin）介導(dǎo)的胞吞作用被受體細胞攝取，而較大的外泌體則采用其他的內(nèi)化過程，如大胞飲和吞噬作用。在外泌體膜蛋白中，參與內(nèi)吞作用的55種膜蛋白，其中參與網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的外泌體膜蛋白有9 種。AP-2 是一種網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)胞吞作用的貨物適配器，可幫助網(wǎng)格蛋白在質(zhì)膜上積聚，AP-2 與結(jié)合RNA 的泛素 E3 連接酶（RNA-binding ubiquitin E3 ligase，MEX3C）相互作用引起網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用[40]；網(wǎng)格蛋白輕鏈A（Clathrin light chain A，CLTA）和網(wǎng)格蛋白輕鏈B（Clathrin light chain B，CLTB）是包被內(nèi)陷小窩和囊泡復(fù)合物的主要蛋白質(zhì)組分，其可引起網(wǎng)格蛋白的積聚和包被小泡的形成，使外泌體被受體細胞攝?。╤ttps://www.uniprot.org/uniprot/P09496,https://www.uniprot.org/uniprot/P09497）。此外，作為吞噬標(biāo)志物的CD47 蛋白和溶酶體相關(guān)膜蛋白-1（Lysosome-associated membrane glycoprotein 1，LAMP1）都定位于外泌體的膜蛋白，表明外泌體可通過吞噬作用被受體細胞攝取。

3.5 其他

外泌體膜蛋白除上述功能外，還參與細胞間黏附以及細胞間連接，例如橋粒芯蛋白1（Desmoglein-1，DSG 1）可參與細胞間連接的組裝及通過質(zhì)膜細胞黏附分子參與調(diào)節(jié)鈣依賴的細胞間黏附作用[32,41]。CD9、CD47、CD166 和鈣粘蛋白等可參與細胞間黏附，而這些蛋白質(zhì)也定位于外泌體膜蛋白，推測其可能參與外泌體與受體細胞的黏附，使外泌體被受體細胞攝取。

此外，Kinsley 等[9]研究表明，源自骨髓或不同類型的癌細胞分泌的EVs 在動物模型中的特定器官中積聚。例如，骨髓細胞產(chǎn)生的EVs 在腎臟中積聚，促進損傷修復(fù)。然而，源自癌癥的EVs 促進多種器官的轉(zhuǎn)移，如來自黑色素瘤細胞分泌的EVs 優(yōu)先在骨、肝、脾和肺中積聚，來自乳腺癌細胞分泌的EVs 優(yōu)先在肝和肺中積聚，而來自胰腺癌細胞分泌的EVs 優(yōu)先積聚在肝臟。外泌體作為EVs 中的一種，可推測其也可根據(jù)來源不同而靶向不同的組織。這種特異性識別大部分是由于外泌體膜上具有不同的蛋白質(zhì)。同時，Lyden等研究表明[9,42]，表達整合素α6β4的外泌體優(yōu)先分布到肺部，表達整合素αvβ5的外泌體則優(yōu)先分布到肝臟，敲除整合素α6β4和αvβ5的腫瘤細胞分泌的外泌體無法靶向到特定組織。因此，外泌體膜蛋白整合素具有靶向外泌體到特定受體細胞和組織的功能。有研究[43]報道，經(jīng)過基因工程的改造，將吞噬過程中的關(guān)鍵蛋白CD47 表達至正常成纖維細胞樣的間充質(zhì)細胞，使其分泌的外泌體表達和攜帶的CD47 蛋白增多，能有效增強外泌體的靶向性。

總之，外泌體膜蛋白可介導(dǎo)外泌體與細胞的黏附及靶向功能，從而調(diào)節(jié)外泌體被受體細胞攝取的過程，引起受體細胞發(fā)生生理或病理的變化。

4 小結(jié)與展望

受體細胞識別、結(jié)合并攝取外泌體，從而將外泌體的內(nèi)容物轉(zhuǎn)運至受體細胞內(nèi)發(fā)揮功能，這一過程與外泌體膜蛋白和受體細胞膜蛋白相互作用密切相關(guān)，但如何調(diào)控外泌體發(fā)揮生物學(xué)作用尚不十分清楚。外泌體膜上存在的四跨膜蛋白（如CD9、CD63 等）、整合素、黏蛋白等，使外泌體可以被受體細胞攝??；同時，外泌體膜上也存在多種MHC Ⅰ類和Ⅱ類組織相容性抗原，參與對抗原的處理和呈遞。此外，外泌體膜上還存在許多功能尚不完全確定的膜蛋白，仍需深入研究。

雖然根據(jù)數(shù)據(jù)庫的篩查結(jié)果，外泌體膜蛋白可以來源于高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細胞器，但是也有文獻報道外泌體膜蛋白通常不來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等細胞器，這可能是由于現(xiàn)有的外泌體分離技術(shù)難以得到純度較高的外泌體。因此，嚴(yán)格意義上，現(xiàn)有技術(shù)分離到的囊泡只能稱為小細胞外囊泡。為獲得純度較高的外泌體，需盡可能多地發(fā)現(xiàn)外泌體特異性標(biāo)志物，并不斷改進現(xiàn)有的分離技術(shù)。

外泌體裝載藥物用于靶向治療是當(dāng)前的研究熱點。天然藥物分子量較大，滲透性較差，在人體內(nèi)的生物利用度較低。例如，姜黃素在治療癌癥、阿爾茨海默病以及炎癥方面都有良好的效果，但是由于其快速的新陳代謝和消除作用，無論給藥途徑如何，其在血清和組織中的含量均較低，且在水中的低溶解度會降低其在靶細胞內(nèi)的有效作用[44]。目前的研究[45]證實，將藥物封裝于外泌體，外泌體可保護其內(nèi)容物不被其他物質(zhì)降解而提高其利用度。研究人員發(fā)現(xiàn)姜黃素封裝于外泌體內(nèi)，可提高其在血液中的濃度，使其具有更高的溶解度和穩(wěn)定性。此外姜黃素刺激細胞產(chǎn)生的外泌體具有恢復(fù)連接蛋白和內(nèi)皮細胞通透性的潛力[44]。

盡管人們對于外泌體膜蛋白的成分、種類及其在外泌體功能中的作用有了一定的了解，但是其在生理和病理條件下的復(fù)雜作用尚不完全清楚，需繼續(xù)探索，因此，進一步了解外泌體膜蛋白的精確生理功能對于確定其在機體生理和病理條件下的調(diào)節(jié)作用具有重大意義。