蒲公英黃酮類成分超聲輔助半仿生提取及含量測定*

李艷芝 劉樹玲 劉文杰 李愛花

(濟寧醫(yī)學院藥學院，日照 276826)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)為菊科多年生草本植物，別名黃花地丁、婆婆丁、黃花三七等，其嫩苗是人們喜愛的野菜，食用歷史悠久，始載于《唐本草》，另外《本草綱目》《本草新編》等本草著作中也有記載[1]。蒲公英含有多種人體所必需的氨基酸， Ca、P、Fe 等多種礦物質(zhì)的含量也顯著高于普通果蔬[2]。研究表明，蒲公英含多種化學成分，如黃酮類[3-4]、萜類[5-6]、香豆素類[7]等，有降血脂、降血糖[8]、抗氧化、抗炎[9]、抗腫瘤等生物活性[10]。半仿生提取法是模仿人體胃腸道環(huán)境，在特定的酸堿環(huán)境下提取化學成分，從生物藥劑學角度為口服給藥制劑提供一種新技術[11-12]。本文對蒲公英所含有的黃酮類成分超聲輔助半仿生提取工藝進行研究，并對不同采收時間蒲公英地上部分及根中所含黃酮類成分槲皮素、木犀草素和蘆丁含量進行測定，為蒲公英合理采收和有效利用提供科學依據(jù)。

1 材料及儀器

1.1 材料試劑

蒲公英采自山東日照(采集時間2017年3月3日- 6月1日，期間每10天采集1次)，洗凈，50℃烘干，粉碎過40目篩備用。蘆丁對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y05M6S1)；木犀草素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：YA0408YA14)；槲皮素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y26D5Y1)；甲醇(色譜純)；其它試劑為分析純。

1.2 儀器設備

SHIMADZU LC-20AT雙泵高效液相色譜儀(日本島津公司)；超聲波清洗機(深圳市深華泰超聲洗凈設備有限公司)；FA1004電子分析秤(常州市幸運電子設備有限公司)；101-OS電熱鼓風干燥箱(天津宏諾儀器有限公司)；Q-250B高速多功能粉碎機(上海冰都電器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒲公英總黃酮半仿生提取

2.1.1供試品溶液的制備 準確稱量蒲公英(采于2017年3月23日)地上部分粉末4.5g，加入一定量的提取溶劑，超聲提取3次(3次提取溶劑的pH分別為2.0、7.5和8.3)，超聲提取一定時間，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，定容于100ml容量瓶中，作為待測液。

2.1.2蘆丁標準品溶液的制備 用分析天平精密稱取4.5mg蘆丁標準品，95%乙醇定容至25ml容量瓶中，得濃度為0.18mg/ml的標準品溶液。

2.1.3測定波長的確定

按照文獻[13]顯色方法分別對供試品溶液和標準品溶液顯色，在200～700nm 波長范圍內(nèi)進行波譜掃描，結(jié)果表明，在502nm波長處二者均出現(xiàn)了最大吸收峰，所以確定502nm 為測定波長。見圖1。

圖1 供試品溶液和標準品溶液紫外光譜掃描圖

2.1.4標準曲線的制備 用移液管分別量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml的蘆丁標準品母液，置于6個10ml的容量瓶中，按文獻[13]所示方法顯色配制溶液，最終得0.000、0.018、0.036、0.054、0.072、0.090mg/ml不同濃度的標準品溶液，在502nm波長處分別測定其吸光度。以蘆丁標準品溶液濃度C(mg/ml)為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，得到標準曲線的回歸方程:A=0.10565C+0.00081，r2=0.9995.

2.1.5總黃酮含量測定 精密量取“2.1.1”項下的蒲公英待測溶液4ml至250ml容量瓶中，按照文獻[13]方法配制溶液，在502nm波長處測定其吸光度，代入“1.3.4”項下的回歸方程計算，得出提取液中黃酮類化合物的濃度，最終得出蒲公英總黃酮提取率。

總黃酮提取率(%)=C×V×n/1000m×100%

此公式中，C：提取液中黃酮類化合物的濃度(mg/ml)；V：被測液體積(ml)；n：稀釋倍數(shù)；m：蒲公英粉末的質(zhì)量(g)。

2.1.6單因素試驗

1)乙醇濃度對提取率的影響。分別以10倍量的45%、55%、75%、85%、95%乙醇為提取溶劑，40℃，按照“2.1.1”項下方法超聲提取2次，每次20min，測定蒲公英總黃酮提取率。結(jié)果顯示，隨著乙醇濃度增大提取率不斷提高，75%時達到最高值，之后逐漸降低。

2)料液比對提取率的影響。以75%乙醇為提取溶劑，40℃，分別考察8、10、20、25、30倍量提取溶劑對提取率的影響。結(jié)果顯示，隨著料液比的增加提取率不斷提高，20倍量時達到最高值，之后提高不明顯。

3)提取溫度對提取率的影響。以20倍量的75%乙醇為提取溶劑，分別考察30℃、40℃、50℃、60℃、70℃不同溫度對提取率的影響。結(jié)果顯示，溫度不斷升高提取率隨之提高，50℃達到最高，之后明顯下降。

4)提取時間對提取率的影響。以20倍量的75%乙醇為提取溶劑，50℃，分別考察10、15、20、30、40min不同提取時間對提取率的影響。結(jié)果顯示，隨著提取時間的延長提取率隨之提高，30min時達到最高，之后有所下降。

2.1.7正交試驗 為系統(tǒng)考察提取條件參數(shù)，在單因素研究結(jié)果基礎上，確定其因素水平(見表1)，選用L9(34)正交表進行正交設計，進一步優(yōu)化半仿生超聲提取蒲公英總黃酮的工藝條件。正交試驗結(jié)果和直觀分析見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果和直觀分析

表3 方差分析

按照“2.1.1”項下的供試品溶液制備方法分別制備表2所列各提取條件樣品，分別計算其提取率。結(jié)果顯示，各因素對蒲公英總黃酮提取率影響大小順序為：A>D> B>C，即乙醇濃度>料液比>超聲時間>超聲溫度，其中乙醇濃度和料液比為顯著性影響因素；最佳提取工藝條件為A3B2C1D2，即乙醇濃度為95%，料液比為1∶20，超聲時間30 min，超聲溫度為40℃。

2.1.8驗證試驗 準確稱取5份蒲公英粉末各50 g，按照最佳工藝條件A3B2C1D2進行提取，計算總黃酮提取率，結(jié)果平均提取率為5.75%，RSD為0.31%，表明此工藝條件穩(wěn)定可行。

2.2 不同采收時間蒲公英中槲皮素、木犀草素、蘆丁含量測定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Agilent HC-C18 (250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸水溶液(52∶48)；流速：0.8ml/min；檢測波長：360nm；柱溫：室溫；進樣量：10μl。在該色譜條件下，槲皮素的保留時間為7.5min，木犀草素保留時間19.0min，蘆丁保留時間23.7min。見圖2。

注：1.槲皮素；2.木犀草素；3.蘆丁

圖2 混合對照品(A)和蒲公英樣品(B)的HPLC色譜圖

2.2.2對照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的槲皮素對照品22.00mg，木犀草素對照品14.00mg和蘆丁對照品21.20mg，分別用甲醇定容至100ml容量瓶中，配制成0.2200mg/ml的槲皮素溶液,0.1400mg/ml的木犀草素溶液和0.2120mg/ml的蘆丁溶液。分別吸取槲皮素對照品溶液5ml，木犀草素對照品溶液10ml,蘆丁對照品溶液10ml，用甲醇定容于100ml容量瓶中，得三者混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的配制 分別稱取不同采收時間的蒲公英地上部分和根部粉末3g，按照所得的半仿生最佳提取工藝條件(乙醇濃度為95%，超聲時間30min，超聲溫度為40℃，料液比為1∶20)進行提取，提取液濃縮成浸膏，用甲醇定容于25ml 容量瓶中，得供試品溶液。

2.2.4線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，用甲醇分別定容于10ml容量瓶中，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下，測定不同濃度溶液中槲皮素、木犀草素、蘆丁的峰面積，以濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標分別繪制槲皮素、木犀草素、蘆丁的標準曲線，得到槲皮素的回歸方程為y=4000000x-840.73(r=0.9999)，木犀草素的回歸方程為y=4000000x-3408.7(r=0.9999)，蘆丁的回歸方程為y=4000000x-5090.4(r=0.9999)。結(jié)果表明，槲皮素、木犀草素、蘆丁分別在1.10～11.00μg/ml、1.14～14.00μg/ml和2.12～21.20μg/ml范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.5精密度試驗 取“2.2.2”項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，分別記錄各成分峰面積，計算槲皮素的峰面積RSD為0.36%，木犀草素的峰面積RSD為0.46%，蘆丁的峰面積RSD為0.79%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗 取3月23日采集的蒲公英地上部分，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，在“2.2.1”項的色譜條件下分別于0、2、4、6、8、10、12h進樣分析，計算槲皮素、木犀草素、蘆丁峰面積的RSD分別為0.42%、2.73%和1.12%，可見在12h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復性試驗 取3月23日采集的蒲公英地上部分，按“2.2.3”項下平行制備6份供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積，計算槲皮素、木犀草素、蘆丁峰面積的RSD分別為1.31%、2.31%和1.52%，說明所建立的方法重復性良好。

2.2.8加樣回收率試驗 精密秤取已知含量的蒲公英地上部分(3月23日)6份，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，按照文獻[14]的方法進行加樣回收率試驗，結(jié)果為槲皮素的平均加樣回收率是91.1%，木犀草素為93.0%，蘆丁為98.0%；槲皮素、木犀草素、蘆丁的RSD分別為1.21%、1.81%和1.42%。考察結(jié)果說明建立的方法準確性良好。

2.2.9樣品測定 制備各個時期采集的蒲公英地上部分和根部樣品溶液，在“2.2.1”項的色譜條件下進行色譜分析，測定各個樣品的槲皮素、木犀草素、蘆丁的含量，色譜圖見圖2，測定結(jié)果見表4。

表4 各個時期蒲公英地上部分和根部槲皮素、木犀草素、蘆丁的含量(mg·g-1)

結(jié)果可見蒲公英中槲皮素、木犀草素、蘆丁的含量高低順序為蘆丁>槲皮素>木犀草素；4月份采收的蒲公英中三者的含量高于其他月份，同一時期采收的蒲公英地上部分三者的含量都明顯較根部含量高。

3 討論

隨著生活水平的不斷提高，人們對綠色保健品需求逐漸增加。綠色保健品特別是以中草藥為原料提取加工生產(chǎn)的受到了人們的青睞。蒲公英在我國分布廣泛，資源豐富，用經(jīng)歷史悠久。蒲公英營養(yǎng)豐富具有多方面的保健功能，激發(fā)了廣大研究者的興趣，世界各國均在積極研制蒲公英保健產(chǎn)品，目前已有蒲公英酒、蒲公英咖啡、蒲公英飲料、蒲公英粥、蒲公英花粉等商品上市[15]。黃酮類成分具有降血脂、降膽固醇、抗氧化等活性，可用于治療心血管疾病[16]。本研究通過正交試驗優(yōu)化了半仿生提取蒲公英總黃酮的工藝條件，最佳工藝條件為乙醇濃度為95%，超聲時間30min，超聲溫度為40℃，料液比為1∶20，提取率為5.75 %，高于董默等[17]的提取結(jié)果4.33 %。該提取工藝可保障蒲公英中黃酮類成分的高效提取，確保蒲公英資源的充分利用。

中藥材的質(zhì)量好壞取決于所含有效成分高低，與眾多因素有關，其中采收時間是重要影響因素之一。在不同時期，中藥中的有效成分含量不同，通過探索其變化規(guī)律尋求最佳采收時間對保證中藥材的質(zhì)量起著至關重要的作用。我們按照所得最佳提取條件，對不同采收時間蒲公英地上部分和根部所含黃酮類成分槲皮素、木犀草素和蘆丁進行了含量測定。通過研究，不但建立了同時測定蒲公英中三種黃酮類成分的HPLC 方法，而且探究了蒲公英中所含三種成分在不同時期的含量變化規(guī)律，結(jié)果表明地上部分含量明顯高于根部，4月份采收的樣品含量高于其它采收時間，三種成分含量高低順序為蘆丁>槲皮素>木犀草素。該研究結(jié)果為蒲公英的合理采收和質(zhì)量控制提供了科學依據(jù)。

蒲公英作為藥食兩用的常用中藥材，不但具有多方面的生物活性，如清熱解毒、抗炎、健胃、利尿等功效，可治療咽炎、急性扁桃腺炎及婦女乳痛等；而且具有多種保健功能，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)[18]等。隨著人們對其廣泛和深入研究，必將在醫(yī)藥、食品、保健等領域具有廣闊的市場前景。