吸水鏈霉菌LP-93菌絲體中洋橄欖葉素衍生物的分離與結(jié)構(gòu)鑒定*

劉玉鳳 王保國 賴帝軒 張 震 崔曉秋 楊兆勇

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826；2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

目前，隨著“超級細(xì)菌”的不斷出現(xiàn)，細(xì)菌耐藥已嚴(yán)重威脅人類健康，對新型抗耐藥菌抗生素的需求日益迫切。微生物是新抗生素的重要來源。吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)是一類抗菌譜廣、遺傳性狀穩(wěn)定的放線菌[1]，可產(chǎn)生尼日利亞菌素類[2]、洋橄欖葉素類[3]、格爾德霉素類[4-6]、雷帕霉素類[7]等多種類型代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗腫瘤、免疫抑制等多種生物活性[1]。在尋找新抗生素的過程中，曾從吸水鏈霉菌LP-93(StreptomyceshygroscopicusLP-93)中分離到兩個(gè)36元多羥基大環(huán)內(nèi)脂類抗生素——波拉霉素A和B[8-9]，它們對酵母樣真菌、絲狀真菌以及引起植物病害的真菌均有很好的抑制活性，對革蘭氏陽性細(xì)菌也有一定活性，具有抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣的特點(diǎn)，為了進(jìn)一步開發(fā)利用此菌，我們對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了更深入研究，從其菌絲體中分離到一個(gè)洋橄欖葉素衍生物，本文將報(bào)道此化合物的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定與抗結(jié)核桿菌活性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甲醇(色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，其它溶劑均為分析純。柱層析用硅膠(200～300目，青島海洋化工廠)。LP-93發(fā)酵菌絲體風(fēng)干物由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所楊兆勇老師課題組提供。SB25-12DTD型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(寧波新藝超聲波設(shè)備有限公司)，RE 2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海遠(yuǎn)懷化工科技有限公司)，安捷倫1260高效液相色譜儀(Agilent Technologies Inc.America)，Bruker-600 核磁共振儀(Bruker Corp.Switzerland)，美國Agilent HP1100 HPLC/MSD 高效液相色譜質(zhì)譜儀(Agilent Technologies Inc.America)，島津UV-2450型紫外分光光度計(jì)(Shimadzu Corp.Japan)。

1.2 方法

1.2.1化合物的分離純化 LP-93發(fā)酵菌絲體風(fēng)干物(248.1g)打成粉，加入95%乙醇2000ml，超聲提取2h，提取3次，合并提取液減壓濃縮得浸膏44.4g。向總浸膏中加入適量乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢?，過濾，得乙酸乙酯可溶部分(F1,12.8g)和不溶部分(F2,30.0g)。F2部分經(jīng)硅膠柱色譜分離(450g硅膠)，以二氯甲烷-甲醇(50∶1～1∶1)梯度洗脫，得21個(gè)組分(F2-1～ F2-21)。組分F2-12中析出白色沉淀，過濾后用高效液相色譜法分離，分離條件為：流動(dòng)相95%甲醇水溶液，流速2.0ml/min，檢測波長254nm，Cosmosil C18-MS-Ⅱ色譜柱(10mm × 250mm，5μm)。

1.2.2化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 將化合物1配成1.0mg/ml的樣品溶液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后在紫外分光光度計(jì)上測定紫外吸收光譜(200～400nm)；取化合物1的甲醇溶液在高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用上測定化合物的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)；將化合物1減壓抽干，加入1.0ml氘代氯仿，裝于核磁管中，在600MHz核磁共振儀上測定一維和二維核磁共振譜。通過綜合分析各種波譜數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比較鑒定化合物1的結(jié)構(gòu)。

1.2.3活性測定 根據(jù)文獻(xiàn)[10]，采用微量二倍稀釋法測定化合物1的抗結(jié)核分支桿菌(H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株)MIC值，異煙肼和利福平為陽性對照藥物。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離結(jié)果

經(jīng)高效液相色譜分離，在保留時(shí)間22.0min處收集色譜峰，減壓蒸餾回收溶劑后，得化合物1 (20.3mg)，為無色膠狀物，可溶于甲醇、乙醇、氯仿等溶劑。

2.2 化合物1的結(jié)構(gòu)解析

化合物1 ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰 m/z 1062 [M+Na]+，為基峰,提示其分子量為1039；1H NMR 譜(圖1)顯示其結(jié)構(gòu)中存在一組對稱的共軛反式雙鍵 [δH 5.66 (d,J=15.6Hz,H-2,H-2′)， 6.97 (dd,J=15.6,11.4Hz,H-3,H-3′),6.09 (dd,J=15.0,11.4Hz,H-4,H-4′),5.65 (dd,J=15.0,11.4Hz,H-5,H-5′)],兩個(gè)糖的端基氫 [δH 5.03 (m)],兩個(gè)甲氧基[δH 3.04 (s)],12個(gè)高場區(qū)甲基信號，以及多個(gè)連氧次甲基、連碳次甲基及亞甲基信號；13C NMR譜顯示40個(gè)碳信號， DEPT譜(圖2)顯示它們分別為1個(gè)羰基碳信號(C 169.6)和兩個(gè)季碳信號(δC 103.4,103.5)，4個(gè)烯碳次甲基，12個(gè)連氧次甲基， 6個(gè)連碳次甲基，5個(gè)亞甲基，1個(gè)甲氧基以及11個(gè)甲基信號，綜合以上信息，推測該化合物為一部分對稱的化合物。結(jié)合核磁共振信號特點(diǎn)，分子量信息及紫外光譜特征(λmax 252nm)，經(jīng)查閱文獻(xiàn)[11-12]得知，化合物1應(yīng)為洋橄欖葉素(elaiophylin)類似物。與洋橄欖葉素的結(jié)構(gòu)相比，本化合物只有5個(gè)亞甲基，說明其中一個(gè)乙基被甲基取代，而且，兩個(gè)季碳信號均向低場位移(δC 103.4,103.5)，說明化合物的C-11,C-11羥基被甲基化，因此，推測化合物1的結(jié)構(gòu)為11,11′-O-二甲基-14′-去乙基-14′-甲基-洋橄欖葉素，分子式為C55H90O18。

為了驗(yàn)證化合物的結(jié)構(gòu)及進(jìn)行核磁信號的準(zhǔn)確歸屬，我們測定了化合物1的二維核磁共振圖譜。通過HSQC圖譜(圖3)，對化合物中直接相連的C，H信號進(jìn)行了準(zhǔn)確的對應(yīng)歸屬。在1H-1H COSY 譜(圖4)中，一個(gè)雙峰甲基質(zhì)子[δH 0.90 (d,J=6.6Hz,H3-20′)]與H-14′[δH 1.26(m)]相關(guān)，同時(shí)，在HMBC 譜(圖5)中，觀察到它與C-13′、C-14′、C-15′的兩鍵或三鍵異核遠(yuǎn)程相關(guān)信號，進(jìn)一步確證了化合物1的結(jié)構(gòu)。由于C-14′的甲基取代了洋橄欖葉素中的乙基，造成了結(jié)構(gòu)的不對稱性，C-13′、C-14′、C-15′受影響較大，它們對應(yīng)的碳?xì)湫盘柧恢丿B，其它位置信號受影響較小，其核磁數(shù)據(jù)(表1)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的11,11′-O-dimethyl-14′-deethyl-14′-methyl-elaiophylin數(shù)據(jù)基本吻合，其具體的1H-1H COSY和HMBC相關(guān)關(guān)系見圖6。

圖1 化合物1的1H NMR譜(CDCl3,600MHz)

圖2 化合物1的DEPT譜(CDCl3,150MHz)

圖3 化合物1的HSQC譜(CDCl3,600MHz)

圖4 化合物1的1H-1H COSY譜(CDCl3,600MHz)

圖5 化合物1的HMBC譜(CDCl3,600MHz)

圖6 化合物1的1H-1H COSY和HMBC 相關(guān)關(guān)系

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)

2.3 化合物1的抗結(jié)核分枝桿菌活性

化合物1對結(jié)核分枝桿菌具有較強(qiáng)抑制活性，MIC值為0.48μg/ml，陽性對照異煙肼和利福平的MIC值分別為0.058、0.129μg/ml。

文獻(xiàn)報(bào)道[11]，洋橄欖葉素類化合物的C-11、C-11′甲氧基取代及C-14′的甲基取代，均使其抗耐藥菌活性降低。但這些結(jié)構(gòu)的改變并沒有顯著影響其抗結(jié)核分枝桿菌活性[10]，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明符合上述結(jié)構(gòu)特征的化合物1仍具有較強(qiáng)的抗結(jié)核分枝桿菌活性。這提示洋橄欖葉素類化合物的抗結(jié)核分枝桿菌機(jī)制可能與其對革蘭氏陽性菌的抗菌機(jī)制不同，值得進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

洋橄欖葉素類化合物是一種具有C2-對稱性的十六元環(huán)大環(huán)雙內(nèi)酯抗生素，目前已從不同鏈霉菌中分離到了近20個(gè)此類化合物，大部分結(jié)構(gòu)中含有雙內(nèi)酯、半縮醛(酮)、6-去氧糖苷等結(jié)構(gòu)片段，具有高度的結(jié)構(gòu)相似性。此類化合物表現(xiàn)出多種生物活性，如抗癌、免疫抑制、抗炎、抗病毒、抗菌等。其中，抗菌活性表現(xiàn)比較突出，對多種耐藥菌具有較強(qiáng)的抗菌活性[11-13]。吸水鏈霉菌是它們的產(chǎn)生菌之一。本文首次從吸水鏈霉菌LP-93中分離到的11,11′-O-二甲基-14′-去乙基-14′-甲基-洋橄欖葉素，對包括甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA)、耐萬古霉素糞腸球菌 (VRE)在內(nèi)的多種耐藥菌的MIC值均在64μg/ml以下[11]，并且具有較強(qiáng)的抗結(jié)核桿菌活性，為此菌在生物農(nóng)藥、抗菌藥物開發(fā)等方面的應(yīng)用，奠定了一定基礎(chǔ)。