萬壽菊的顯微鑒別及5個(gè)主要成分的含量測定

呂邵娃 菅計(jì)蘋 譚美微

[摘要] 目的 通過顯微鑒別的方法對萬壽菊的根、莖、葉等顯微特征進(jìn)行研究，同時(shí)測定不同部位主要成分的含量，為其質(zhì)量控制及合理有效的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。 方法 采用顯微鑒定法觀察萬壽菊的顯微結(jié)構(gòu)特征;采用YMC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A）為流動(dòng)相，梯度洗脫;檢測波長為257 nm;柱溫為室溫;流速為1.0 mL/min;供試品溶液進(jìn)樣量為10 μL。 結(jié)果 5，7，3′-三羥基-3，6，4′-三甲氧基黃酮（1）、5，7，4′-三羥基-3，6-二甲氧基黃酮（2）、萬壽菊苷（3）、5，3′-二羥基-3，6，4′-三甲氧基-黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（4）和5-羥甲基糠醛基-甲基-丁二酸酯（5）5種化合物的線性回歸方程分別為：Y = 2.7957X-0.1385、Y = 2.7951X-0.1163、Y = 0.1740X-0.0231、Y = 0.9006X-0.1242、Y = 0.1815X-0.0916，相關(guān)系數(shù)為0.099 92～0.099 95，加樣回收率在96.43%～101.17%，RSD在0.13%～1.75%。萬壽菊根莖中均有此5個(gè)化學(xué)成分，且除化合物5外，其余4種化合物在莖中的含量均高于根中?；衔?在萬壽菊莖部的含量最高，達(dá)2.5%。 結(jié)論 本研究首次對萬壽菊的根、莖、葉進(jìn)行有效的顯微鑒定及5種重要成分進(jìn)行含量測定，該方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為萬壽菊的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 萬壽菊;顯微特征;高效液相色譜法;含量測定

[中圖分類號] R927.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）02（a）-0004-04

[Abstract] Objective To provide theoretical basis for quality control and rational and effective development and utilization of Tagetes erecta L. by studying the microscopical characteristics of root， stem and leaf of marigold by means of microscopic identification， and detecting the contents of main components in different parts. Methods The microstructure features of Tagetes erecta L. were observed by microscopic identification. YMC C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used as the column， acetonitrile （B） - 0.1% formic acid aqueous solution （A） was used as mobile phase of gradient elution with the detection wavelength of 257 nm and the colomn temperature was room temperature. The flow rate was 1.0 mL/min. The injection volume of the sample was 10 μL. Results 5，7，3′-trihydroxyl-3，6，4′-trimethoxylflavone （1）， syringic acid （2）， patulitrin （3）， 5，3′-dihydroxyl-3，6，4′-trimethoxylflavone-7-O-β-D-glucopyranoside （4）， 5-hydroxymethylfurfuryl methyl succinate （5） five kinds of linear regression equations were： Y = 2.7957X-0.1385， Y = 2.7951X-0.1163， Y = 0.1740X-0.0231， Y = 0.9006X-0.1242， Y = 0.1815X-0.0916. The correlation coefficient of the compounds was 0.099 92-0.099 95， the recovery rate of the sample was 96.43%-101.17%， and the RSD was 0.13%-1.75%. These five chemical components were found in the rhizome of Tagetes erecta L.， and the contents of the other four compounds in the stem were larger than those in the root except for the compound 5. The content of compound 5 was the highest in the stem of Tagetes erecta L.， up to 2.5%. Conclusion In this experiment， the effective microscopic identification of the roots， stems and leaves of marigold and the determination of five important components are carried out for the first time. The method is simple， accurate and reproducible， and provides a theoretical basis for the quality control of Tagetes erecta L..

[Key words] Tagetes erecta L.; Microscopic characteristics; High performance liquid chromatography; Content determination

萬壽菊為菊科萬壽菊屬植物萬壽菊Tagetes erecta L.的干燥全草[1-4]，具有平肝清熱、祛風(fēng)化痰之功效。萬壽菊其花的主要化學(xué)成分為黃酮類及苷類、噻吩類、精油類化合物[5-9]，其花中的葉黃素含量較高，作為提取葉黃素的原料[10-14]。有研究報(bào)道指出[15-18]，萬壽菊中的黃酮類化合物具有殺蟲作用，植物殺蟲劑因具有綠色、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)成為近年來研究的熱點(diǎn)。本研究對前期從該植物的根部分離鑒定的具有殺蟲活性的4個(gè)主要的黃酮類成分5，7，3′-三羥基-3，6，4′-三甲氧基黃酮（1）、5，7，4′-三羥基-3，6-二甲氧基黃酮（2）、萬壽菊苷（3）、5，3′-二羥基-3，6，4′-三甲氧基-黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（4）和1個(gè)新的糠醛類化合物5-羥甲基糠醛基-甲基-丁二酸酯（5）進(jìn)行了含量測定研究，并對萬壽菊花、莖及根進(jìn)行了顯微鑒定和粉末鑒定，為萬壽菊的質(zhì)量控制及作為植物殺蟲劑的合理有效的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

顯微鏡（OLYMPUS）;拍攝軟件（OLYMPUS）CM1900;冷凍切片機(jī)（Leica）;冷凍液（Leica）;高速粉碎機(jī)（欣鎮(zhèn)精密企業(yè)有限公司）;高效液相色譜法（HPLC）色譜儀（Sanofi）;色譜柱（YMC）;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;SB-5200D超聲波清洗機(jī)（寧波新藝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

萬壽菊原藥材于2016年6月采自黑龍江省五常市，經(jīng)李國玉博士鑒定為科植物萬壽菊;水合氯醛、甘油、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、無水乙醇、95%乙醇、甲醇、乙腈為色譜純;5，7，3′-三羥基-3，6，4′-三甲氧基黃酮對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，貨號：16090710，純度>98%）;5，7，4′-三羥基-3，6-二甲氧基黃酮對照品（成都曼斯特生物科技有限公司，貨號：16040510，純度>98%）;萬壽菊苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，貨號：16032808，純度>98%）;3′-二羥基-3，6， 4′-三甲氧基-黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷（四川省維克奇生物科技有限公司，貨號：16071408，純度>98%）。進(jìn)行含量測定的其余試劑均為分析純。

2 顯微鑒別

2.1 方法

萬壽菊根和莖樣品鮮品部分曬干后進(jìn)行性狀鑒定，拍照。鮮品根、根莖、莖及葉分別用FAA固定液固定，組織特征觀察采用石蠟切片法制作永久切片、徒手切片法制作臨時(shí)切片。根、莖、花粉末特征采用粉末制片法制片，部分用水合氯醛-稀甘油加熱透化處理后制作，置于顯微鏡下觀察。

2.2 結(jié)果

2.2.1 莖、根橫切面? 莖的橫切面中厚角組織明顯，與其莖表面內(nèi)棱狀突起相符，排列整齊，韌皮部較窄，木質(zhì)部多導(dǎo)管、纖維分布。根的橫切面皮層明顯，韌皮部較窄，細(xì)胞結(jié)合緊密，木質(zhì)部、木射線呈徑向分布明顯，導(dǎo)管、纖維多見。見圖1（封四）。

2.2.2 花粉末? 黃色粉末，表皮細(xì)胞呈類方形，花粉粒棕黃色球形，表面有纖毛狀凸起，可見3個(gè)萌發(fā)孔，向內(nèi)凹陷。分泌細(xì)胞呈黃色，色素顆粒多見，常附著在花粉粒、表皮碎片、花柱頭碎片等碎片組織上，呈橙黃或棕紅色。見圖2（封四）。

2.2.3 莖粉末? 淺綠色粉末，表皮細(xì)胞類方形或長方形，壁邊緣不規(guī)則增厚，長條形纖維，與導(dǎo)管同現(xiàn)，螺紋導(dǎo)管多見，也見孔紋導(dǎo)管。見圖2（封四）。

2.2.4 根粉末? 黃白色粉末，表皮細(xì)胞類方形或長方形，壁邊緣不規(guī)則增厚，長條形纖維，螺紋導(dǎo)管及紋孔導(dǎo)管多見常伴生。見圖2（封四）。

3 HPLC同時(shí)測定萬壽菊不同部位中5個(gè)成分的含量

3.1 色譜條件

色譜柱：YMC C18，流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，10%→20%B;10～14 min，20%→22%B;14～25 min，22%→26%B;25～29 min，26%→28%B;29～39 min，28%→32%B;39～49 min，32%→35%B;49～54 min，35%→38%B;54～64 min，38%→40%B）;檢測波長為257 nm;柱溫為室溫;流速為1.0 mL/min;供試品溶液進(jìn)樣量為10 μL。

3.2 溶液的制備

對照品溶液的制備：分別取化合物1～5適量，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，色譜甲醇定容至刻度，配制成濃度分別為0.0416、0.0590、0.0483、0.0302、0.0510 mg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：稱取萬壽菊干燥根粉末12.0 g，置于500 mL圓底燒瓶中，95%醇回流提取2次，2 h/次，合并過濾液，回收至干，水懸浮用石油醚和乙酸乙酯萃取，回收萃取液至干，適量用DMSO溶解，甲醇定溶于25 mL容量瓶中作為供試品溶液備用。

3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取“3.1.2”下的混合照品溶液、供試品溶液和空白溶液各適量，按“3.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測定。在該色譜條件下，各待測成分與雜質(zhì)峰間分離度>1.5，理論塔板數(shù)以5，7，3′-三羥基-3，6，4′-三甲氧基黃酮計(jì)不低于4000。見圖3。

3.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“3.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果各成分在各自相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見表1。

3.5 檢測限和定量限試驗(yàn)

分別精密量取“3.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，以信噪比為3∶1時(shí)的進(jìn)樣量最低檢測限為0.5 ng，以信噪比為10∶1時(shí)的進(jìn)樣量最低定量限為2.0 ng。

3.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“3.1.2”項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL，按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得化合物1～5的峰面積的RSD分別為0.41%、0.95%、0.41%、0.99%、0.78%（n = 6），結(jié)果儀器的精密度良好，符合測試要求。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取萬壽菊藥材粉末0.5 g，按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣 10 μL。結(jié)果顯示，化合物1～5峰面積的 RSD值分別為0.56%、0.99%、0.78%、0.74%、1.40%（n = 6），方法的重復(fù)性良好。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于室溫條件下放置 0、2、 4、6、8、12 h后，按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果，化合物1～5峰面積的RSD值分別為0.50%、1.18%、0.82%、1.36%、1.13%（n = 6），樣品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取根部粉末0.48 g，分別加入化合物1～5各46.05、14.50、1356.2、36.65、58.60 μg，按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品，定容至5 mL，按“3.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率?；衔?～5的平均回收率分別為98.85%、97.80%、99.40%、101.17%、96.43%，RSD值分別為1.04%、0.98%、0.31%、1.75%、1.60%（n = 6）。方法的準(zhǔn)確度良好。

3.10 5種成分在萬壽菊不同部位的含量

經(jīng)過考查，本實(shí)驗(yàn)選用95%甲醇為提取溶劑、乙腈-0.1%甲酸水作為本研究的流動(dòng)相系統(tǒng)、檢測波長257 nm。5個(gè)化合物在萬壽菊不同部位的含量結(jié)果見表2。

4 討論

本研究首次對萬壽菊進(jìn)行顯微特征鑒別，為萬壽菊的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。Uhlenbroek等[19]從萬壽菊根中分離出的噻吩類化合物具有殺線蟲活性。根據(jù)李曉飛等[20]的研究發(fā)現(xiàn)萬壽菊各部位組織粗提物的殺線活性與萬壽菊不同部位中α-三連噻吩的含量基本呈相反的趨勢，認(rèn)為α-三連噻吩可能不是萬壽菊的主要?dú)⑾x物質(zhì)。相關(guān)研究[21-24]提示黃酮類具有較好的殺蟲效果。本研究測得的黃酮類化合物1～4的含量都是莖>根部，而根據(jù)郭章碧[25]的研究，殺蟲效果根>花>葉>莖，可能產(chǎn)生差異的原因是由于萬壽菊各部位中的含量成分復(fù)雜，在根中有與黃酮類化合物起到協(xié)同促進(jìn)作用的化合物，致使表現(xiàn)出來根的殺蟲效果更好，而化合物3和4在花中含量很少，但可能是成苷后毒性較強(qiáng)，含量較少就可以起到毒殺作用。故推測萬壽菊中存在黃酮以外的殺蟲成分，化合物5糠醛類物質(zhì)可能是潛在的殺蟲成分，因此萬壽菊作為綠色殺蟲劑具有廣闊的前景空間，應(yīng)當(dāng)對萬壽菊進(jìn)行合理應(yīng)用對萬壽菊非花部位進(jìn)行合理利用，避免資源浪費(fèi)。

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（收稿日期：2019-07-03? 本文編輯：劉永巧）