離子液體雙水相萃取-HPLC測定飲料中的8種合成著色劑

胡貝*，李麗霞，李曉健，劉紅，黃偉，王林

湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（武漢 430075）

合成著色劑是在食品生產(chǎn)加工過程中，為改善食品色澤、增進(jìn)人的食欲而添加的一類食品添加劑，大多以煤焦油中分離出的苯胺染料為原料制成[1]。合成著色劑由于其色澤鮮艷、性質(zhì)穩(wěn)定、著色力強(qiáng)、成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，迅速得到廣泛的推廣與應(yīng)用[2-3]。但合成著色劑不僅無任何營養(yǎng)價(jià)值，且絕大多數(shù)對人體有害，毒害作用不僅表現(xiàn)為一般毒性和致瀉性，有些品種還具有致癌性[1-2]。目前，國家標(biāo)準(zhǔn)[4]、進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[5]及文獻(xiàn)報(bào)道[1]中測定食品中合成著色劑的前處理方法主要有聚酰胺粉吸附法、液-液萃取法、固相萃取法等，檢測方法主要有液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。此外，QuEChERS-HPLC法[6]、QuEChERS-HPLC-MS/MS法[7]、SERS法[8-9]、離子液體分散液-液微萃取-HPLC法[10]等快檢方法也逐漸被應(yīng)用于合成著色劑的檢測中，但這些方法大多會使用有機(jī)溶劑，存在污染。因此，尋求一種簡單、綠色、高效的檢測方法成為亟待解決的問題。

Gutowski等[11]2003年首次提出了離子液體雙水相（ILATPS）的概念，并研究了親水性離子液體[C4mim]Cl與K3PO4形成上相富集離子液體和下相富集磷酸鉀的雙水相體系。按照與離子液體形成雙水相體系的對象不同可以將其分為3種類型：離子液體/無機(jī)鹽體系、離子液體/表面活性劑體系與離子液體/糖體系，其中研究比較多的是離子液體/無機(jī)鹽體系，以磷酸鹽類的成相效果最好且應(yīng)用最廣[12]。離子液體雙水相體系，它綜合了離子液體和雙水相體系的優(yōu)點(diǎn)，具有分相時(shí)間短、黏度低、萃取過程不易乳化、萃取率高、分離條件溫和、離子體系易回收利用、綠色環(huán)保等優(yōu)勢[12-14]。

近年來，離子液體雙水相萃取法在生物工業(yè)分析、藥物分析、金屬分離等領(lǐng)域的應(yīng)用成為了研究的熱點(diǎn)[14]，在合成著色劑的萃取分離研究中，也逐漸被關(guān)注。鄧凡政等[15]建立了一種用離子液體雙水相體系對莧菜紅進(jìn)行萃取的方法。Sha等[16]建立了一種用離子液體雙水相體系對不同食品樣品中5種合成著色劑進(jìn)行萃取的方法。但目前國內(nèi)外運(yùn)用離子液體雙水相體系檢測食品中多種常用合成著色劑的方法報(bào)道仍然較少，因此，試驗(yàn)建立了一種離子液體雙水相萃取-高效液相色譜法快速檢測飲料中8種合成著色劑（新紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、酸性紅和赤蘚紅）的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀（安捷倫科技（中國）有限公司）；ST16型臺式離心機(jī)（德國Thermo公司）；XP 205型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；HMV-50A型多管漩渦混合器（上海珂淮儀器有限公司）；Milli-Q純水機(jī)（德國默克公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑

新紅（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所）；日落黃、胭脂紅、亮藍(lán)、赤蘚紅（中國計(jì)量科學(xué)研究院）；誘惑紅（北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司）；酸性紅（德國Dr. Ehrenstorfer GmbH）；靛藍(lán)（北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院）。

甲醇（色譜級，德國默克公司）；乙酸銨（優(yōu)級純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；檸檬酸（分析純，上海山浦化工有限公司）；1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽（[C4MIM]Br）、1-癸基-3-甲基咪唑溴鹽（[C10MIM]Br）、1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C6MIM]BF4）、1-辛基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C8MIM]BF4）（純度均為99%，上海成捷化學(xué)有限公司）；試驗(yàn)用水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。0.3 g/mL的[C4MIM]Br水溶液及200 g/L的檸檬酸水溶液，均用蒸餾水配制。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo AcclaimTM120 C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃。檢測波長：新紅，508 nm；靛藍(lán)，288 nm；胭脂紅、日落黃、誘惑紅，240 nm；亮藍(lán)，628 nm；酸性紅，518 nm；赤蘚紅，530 nm。進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制

1.0 mg/mL酸性紅標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：稱取適量酸性紅標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻即得。

1.5 樣品處理

1.5.1 樣品溶液的制備

取空白飲料樣品（含二氧化碳樣品加熱或超聲10 min驅(qū)除二氧化碳），用200 g/L的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

1.5.2 離子液體雙水相萃取

在10 mL的離心管中加入500 μ L 0.3 g/mL的[C4MIM]Br，和一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液（1.0 mL），加水稀釋至5.0 mL，然后加入5.5 g K2HPO4，渦旋10 min使其充分溶解并形成渾濁的溶液，以8 000 r/min離心5 min，富集離子液體的上相體積約為120 μL。取10 μ L注入高效液相色譜分析測定。

1.6 定量分析

合成著色劑在雙水相中的萃取效果通過萃取率（E）描述[17]。按式（1）計(jì)算：

式中：Vt為萃取后上相體積，mL；Ct為所測溶液中合成著色劑的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為加入的標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；C為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，μ g/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體的選擇

試驗(yàn)考察了[C4MIM]Br、[C10MIM]Br、[C6MIM]BF4、[C8MIM]BF4共4種離子液體對8種合成著色劑的萃取效率（每組3個(gè)平行樣）。結(jié)果表明，通過短時(shí)間（約30 s）手動(dòng)振搖，離子液體的相分離能力順序?yàn)椋篬C6MIM]BF4≈[C8MIM]BF4＜[C4MIM]Br≈[C10MIM]Br?？紤]到[C4MIM]Br的成本和黏度均低于[C10MIM]Br，選擇[C4MIM]Br進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.2 鹽種類的選擇

作為雙水相體系的重要組成部分，無機(jī)鹽的性質(zhì)對雙水相體系的相平衡具有重要的影響。Gutowski等[11]和Sha等[16]的研究均揭示了離子液體/無機(jī)鹽雙水相體系的分相過程實(shí)質(zhì)上是無機(jī)鹽與離子液體爭奪水分子的過程，其分相能力與離子液體的水化能力和無機(jī)鹽的鹽析能力密切相關(guān)，離子液體的水化能力越大分相能力越差，而無機(jī)鹽的鹽析能力越大其分相能力越強(qiáng)。試驗(yàn)選擇了(NH4)2SO4、NaH2PO4、K3PO4、K2HPO4共4種鹽進(jìn)行試驗(yàn)（每組3個(gè)平行樣）。其中，K3PO4、K2HPO4能與[C4MIM]Br形成雙水相體系，相分離能力的順序?yàn)镵3PO4＜K2HPO4，此順序與它們常溫下的水溶性是一致的。故選擇K2HPO4進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3 pH的選擇

溶液的pH是影響萃取效率的一個(gè)重要因素，溶液的酸堿性會影響萃取物在溶液中的存在形式，因此調(diào)節(jié)溶液的pH從而改變萃取物在溶液中的溶解度，使萃取物更易在萃取溶劑中存在，以達(dá)到萃取的目的[10,18]。 根 據(jù) 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)[4]、 進(jìn) 出 口 行 業(yè) 標(biāo) 準(zhǔn)[5]及 文獻(xiàn)[10, 15-16]報(bào)道，考察了pH 4.0～6.0對萃取率的影響（每組3個(gè)平行樣），結(jié)果表明，在pH 6.0時(shí)，萃取率最高。因此，在制備樣品溶液時(shí)，選擇調(diào)節(jié)pH至6.0后備用。

2.4 離子液體加入量的影響

離子液體的加入量是決定萃取率的關(guān)鍵因素，得到一種離子液體加入量少、萃取率高的雙水相體系十分重要。當(dāng)[C4MIM]Br的加入量低于300 μL時(shí)，上相體積太小，移取困難，無法進(jìn)行檢測，故考察了[C4MIM]Br的加入量在300～700 μL范圍內(nèi)對萃取率的影響（每組3個(gè)平行樣），結(jié)果見圖1。[C4MIM]Br的加入量在300～500 μL范圍內(nèi)隨其加入量的增加，8種合成著色劑的萃取率呈遞增趨勢，當(dāng)[C4MIM]Br的加入量為500 μL時(shí)，8種合成著色劑的萃取率最高。綜合考慮萃取率、富集倍數(shù)和降低[C4MIM]Br的使用成本，選擇加入500 μ L 0.3 g/mL的[C4MIM]Br水溶液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 離子液體加入量對8種合成著色劑萃取率的影響

2.5 鹽加入量的影響

試驗(yàn)考察了K2HPO4的加入量在5.0～6.5 g范圍內(nèi)對萃取率的影響（每組3個(gè)平行樣），結(jié)果見圖2。在5.0～6.5 g范圍內(nèi)，8種合成著色劑的萃取率均在K2HPO4的加入量為5.5 g時(shí)達(dá)到最大值。因此，為了達(dá)到更高的萃取效率，選擇K2HPO4的加入量5.5 g。

圖2 鹽加入量對8種合成著色劑萃取率的影響

2.6 萃取時(shí)間和離心時(shí)間的影響

通過添加一定量的鹽，很容易形成離子液體雙水相體系。試驗(yàn)比較了手動(dòng)振搖30 s（從添加鹽到離心之前的時(shí)間）、渦旋5 min、渦旋10 min、渦旋15 min共4種不同萃取時(shí)間對萃取率的影響（每組3個(gè)平行樣）。結(jié)果表明，渦旋10 min相較于其他萃取時(shí)間的萃取率更高。為使上下相達(dá)到快速的分離，研究了以8 000 r/min離心5～20 min對萃取率的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，離心時(shí)間5 min以上，8種合成著色劑的萃取率基本不變，為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，選擇離心時(shí)間5 min。

2.7 線性范圍及檢出限

分別量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，加水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。再將1.0 mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為母液，用pH 6的水（用200 g/L的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH至6.0）分別稀釋成質(zhì)量濃度為30，60，300，600和1 200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在所優(yōu)化的試驗(yàn)條件下富集、高效液相色譜檢測，以各個(gè)組分的峰面積和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比計(jì)算檢出限，結(jié)果見表2。

表2 各組分的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.8 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

表3 精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

圖3 混標(biāo)及空白樣品加標(biāo)色譜圖

取空白飲料樣品，分別添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使3組樣品（每組6個(gè)平行樣）中各組分的加標(biāo)量分別為50 μg/L（低），250 μg/L（中）和500 μg/L（高）三個(gè)水平，按“1.5”處理樣品進(jìn)行回收試驗(yàn)，計(jì)算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3。混標(biāo)色譜圖和空白樣品加標(biāo)色譜圖見圖3。結(jié)果表明，各組分的平均回收率為86.5%～99.0%，RSD為0.3%～3.8%。該方法回收率和重現(xiàn)性良好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以采用外標(biāo)法進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一種離子液體雙水相萃取-高效液相色譜法快速檢測飲料中8種合成著色劑（新紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、酸性紅和赤蘚紅）的方法，對萃取劑的種類及體積、鹽的種類及添加量、樣品pH、萃取時(shí)間、離心時(shí)間等因素進(jìn)行了優(yōu)化。同時(shí)考察了方法的線性范圍、方法檢出限、加標(biāo)回收率及精密度等。試驗(yàn)證明，該方法綠色環(huán)保、操作簡單、靈敏度高、回收率和重現(xiàn)性良好，可以為飲料中8種合成著色劑的大批量快速檢測提供依據(jù)。