桑葚花色苷提取、純化和生理活性研究進展

周成偉，萬青毅，郭政銘，孫月娥，王衛(wèi)東*

徐州工程學院食品與生物工程學院（徐州 221018）

桑葚，俗稱桑果，為桑樹的果實，富含多種維生素、礦物質(zhì)、葡萄糖、果糖和有機酸，為國家認可的藥食兩用食品。桑葚中的花色苷是一類具有苯并吡喃結(jié)構(gòu)的類黃酮化合物，也廣泛存在于草莓、藍莓、紫薯等植物[1]。作為一種廣泛分布于植物界的水溶性多酚類色素，花色苷具有清除體內(nèi)自由基[2]、保護神經(jīng)系統(tǒng)和減少炎癥[3]、阻止和抑制腫瘤[4]以及減少心血管疾病[5]等作用，對人體健康有積極作用。對桑葚花色苷的提取方法、分離純化、分子結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性以及生理活性功能的最新研究成果進行綜述，以期為桑葚進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 桑葚花色苷的提取方法

1.1 有機溶劑浸提法

目前，多采用乙醇、甲醇等有機溶劑提取桑葚花色苷。蔡榮榮等[6]通過正交試驗優(yōu)化了桑葚花色苷的提取工藝，發(fā)現(xiàn)乙醇體積分數(shù)對提取率的影響最大，其次依次為浸泡次數(shù)、提取液pH、料液比，最佳提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)50%、提取液pH 4、料液比1︰1（g/mL）、浸泡次數(shù)3次。楊美蓮等[7]采用單因素試驗和正交試驗確定了桑葚花色苷的最佳提取條件為70%甲醇、料液比1︰55（g/mL）、提取時間60 min，在此條件下花色苷提取率為6.497%。溶劑提取法需消耗大量有機溶劑，且花色苷易降解，提取率不高。此外，這類方法操作過程繁瑣，耗時較長。

1.2 超聲波輔助提取法

超聲波可以產(chǎn)生高速、強烈的空化效應和攪拌作用，一方面產(chǎn)熱來促進溶質(zhì)的溶出，另一方面增加溶質(zhì)與溶液間的接觸，從而縮短提取時間、提高提取率，并且能減少對色素中活性物質(zhì)的破壞。徐穎[8]采用超聲波輔助萃取法提取桑葚中的花色苷，通過單因素試驗和正交試驗確定了酸化乙醇提取桑葚花色苷的最佳提取條件：超聲波功率160 W、料液比1︰20（g/mL）、時間40 min、乙醇體積分數(shù)75%。唐榕等[9]以40%乙醇溶液（含0.1% HCl）為提取劑，以料液比1︰10（g/mL），超聲時間90 min進行提取，花色苷得率為2.9 mg/g。喬爽等[10]采用鹽酸酸化的乙醇為溶劑，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了超聲波輔助提取桑葚花色苷工藝，其最佳工藝參數(shù)為：乙醇體積分數(shù)70%（pH 1）、提取時間20 min、提取溫度50 ℃、料液比1︰10（g/mL），提取3次后花色苷提取率為1.169 mg/g。

1.3 微波輔助提取法

微波技術(shù)應用于天然色素提取，能強化浸提過程，降低生產(chǎn)時間，減少能耗，且可提高產(chǎn)率。羅政[11]通過響應面試驗優(yōu)化了微波輔助溶劑法提取桑葚花色苷的工藝條件，結(jié)果表明當料液比為1︰16（g/mL），功率為600 W，乙醇體積分數(shù)為70%，提取時間50 s后，粗提物中花色苷含量為3.54 mg/g，提取率達到81.5%，DPPH自由基清除率為76.7%，影響花色苷提取率的因素大小順序為料液比＞功率＞時間＞乙醇體積分數(shù)。胡金奎[12]比較了超聲協(xié)同微波輔助提取與超聲輔助提取的優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)協(xié)同提取率更高，其最佳提取條件為微波功率90 W，料液比1︰3（g/mL），提取時間180 s。

1.4 加壓液體提取法

加壓液體提?。≒ressurized liquid extraction，PLE）是近年來發(fā)展起來用于植物活性成分提取的新技術(shù)，具有效率高、提取時間短、有效避免熱敏性成分因受熱而導致的降解和失活等優(yōu)點。譚佳琪等[13]采用超高壓法提取桑葚花色苷，并應用響應曲面法優(yōu)化了超高壓提取桑葚花色苷的工藝，建立了花色苷得率的二次回歸模型，經(jīng)驗證模型可靠，根據(jù)模型確定最佳的工藝參數(shù)為：壓力270 MPa、萃取時間6 min、料液比1︰35（g/mL）、乙醇體積分數(shù)62%，在此條件下桑葚花色苷提取率為4.93±0.12 mg/g。

Espada-Bellido等[14]以甲醇為溶劑，優(yōu)化了PLE法提取桑葚花色苷和多酚的工藝，采用47.2%的甲醇，在壓力為200 atm，溫度75.5 ℃下提取10 min，在優(yōu)化的條件下，PLE和超聲波輔助法對花色苷的提取產(chǎn)率相似，但是PLE需要較少的甲醇消耗量。因此，加壓液體萃取可以被認為是從桑葚中提取生物活性化合物的有效工具。

2 桑葚花色苷的純化與結(jié)構(gòu)鑒定

2.1 花色苷的純化方法

大孔樹脂法在花色苷粗提物進一步純化中應用較廣泛，具有節(jié)約溶劑、工藝簡單、產(chǎn)品純度高、理化性質(zhì)穩(wěn)定且可循環(huán)使用等優(yōu)點。胡金奎[12]比較了12種大孔吸附樹脂和6種陽離子交換樹脂對桑葚花色苷的吸附和解吸性能，通過靜態(tài)試驗篩選出最佳大孔吸附樹脂（LX-68），最佳陽離子交換樹脂為D001，并對兩種樹脂進行靜態(tài)和動態(tài)條件優(yōu)化，表明兩種樹脂對桑葚花色苷均具有較好的吸附分離性能，LX-68樹脂的分離效果優(yōu)于D001樹脂。

鄭惠超[15]通過吸附、洗脫試驗，比較了9種大孔吸附樹脂對桑葚花色苷的純化效果，篩選出XDA-6為適合分離純化桑葚花色苷的大孔吸附樹脂，并確立純化工藝參數(shù)：上清液質(zhì)量濃度1.5 mg/mL、pH 3.5、洗脫劑乙醇溶液體積分數(shù)60%。

經(jīng)大孔樹脂純化后，桑葚花色苷純度及色價均大幅度提高。徐穎[8]利用Amberlite XAD7HP型大孔吸附樹脂對花色苷的吸附作用，使得超聲波輔助提取法制得的粗提物花色苷含量由3.14%上升至35.32%。

2.2 桑葚花色苷的分子結(jié)構(gòu)

冉國敬等[16]使用中壓制備液相色譜分離純化花色苷粗品，并利用高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)對各峰物質(zhì)進行鑒定，結(jié)果表明桑葚中主要花色苷成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G）、矢車菊素-3-蕓香糖苷（C3R）和錦葵素-3-葡萄糖苷（M3G）。陳亮等[17]研究野生桑葚發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，并測定了總花色苷含量，為154.27 mg/100 g，其中C3G、C3R和M3G相對含量分別為67.52%，31.29%和1.06%。

鄒堂斌等[18]采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（HPLC-ESI-MS）法測定了桑葚中花色苷含量及種類，以矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G）為標準，外標法定量，并通過離子碎片對花色苷組成進行定性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，每100 g桑葚鮮果含711.7±49.5 mg花色苷，分別為矢車菊素-3-（2G-葡糖蕓香糖苷）（C3G2R）、飛燕草素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷（D3R5G）、矢車菊素-3, 5-二葡萄糖苷（C3G5G）、矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G）、矢車菊素-3-蕓香糖苷（C3R）、天竺葵素-3-葡萄糖苷（P3G）、天竺葵素-3-蕓香糖苷（P3R）和飛燕草素-3-蕓香糖苷（D3R）8種花色苷。

除了上述花色苷外，也有檢測出牽牛花色素和芍藥花色素的報道[13]。

不同報道中花色苷的種類不同，可能與桑葚品種有關(guān)。因此，在對植物中的花色苷進行鑒定時，要確定其品種和來源，也可以建立以花色苷為主要特征的指紋圖譜鑒定桑葚品種。

盡管從桑葚中鑒定到的花色苷種類差別較大，但是均以矢車菊素為主。因此，桑葚可能是制備矢車菊素的良好來源。

表1 桑葚中花色苷的種類與含量

3 桑葚花色苷穩(wěn)定性

與眾多的花色苷類似，桑葚花色苷的熱降解符合一級動力學反應，高溫、長時間加熱會加速花色苷的降解，因此，花色苷的保存與加工應盡量在較低溫度下、較短時間內(nèi)進行[19-20]。唐榕等[9]的研究表明，在25 ℃下放置4 h，桑葚花色苷含量無顯著性差異（p＞0.05）。

唐榕等[9]研究了不同光照條件對桑葚花色苷的影響，發(fā)現(xiàn)與室內(nèi)光（50～100 Lux）和避光（0 Lux）相比，室外光下花色苷保存率隨時間增加而急劇下降，總色差變化急劇上升，4 d后室外光下桑葚花色苷的保存率低于60%，而避光和室內(nèi)光條件下花色苷保存率的變化無顯著性差異。但是有學者對碧桃的研究表明，在室外自然光和黑暗條件下花色苷的穩(wěn)定性無顯著性差異[21]。這可能是由于不同來源的花色苷其單體種類和比例不同，因此對光的穩(wěn)定性存在一定的差異。因此，桑葚花色苷需避免暴露在室外強光下，應在室內(nèi)光及避光條件下進行貯存與加工。

在不同的酸堿條件下，花色苷4種構(gòu)型的比例和基本結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，從而導致色澤和顏色強度的改變，甚至造成花色苷的降解[22]。研究表明，在25 ℃下放置3 d后，隨著pH的增大，花色苷的保存率顯著降低，色差變化加劇[9]。因此，在貯存與加工時，應使花色苷溶液維持在盡可能高的酸性條件下。

不同金屬離子對桑葚花色苷穩(wěn)定性影響不同。Na+、Mg2+、Al3+對花色苷的穩(wěn)定性影響不大，而加入Cu2+、Fe2+和Fe3+的溶液花色苷保存率降低，尤其是Fe3+對桑葚花色苷的破壞程度最大，且隨著時間的增加，F(xiàn)e2+被氧化成Fe3+，加入Fe2+的花色苷溶液變化趨勢接近Fe3+[9]。李瑞琦[23]研究發(fā)現(xiàn)Mg2+對果凍中桑葚紅色素有保護作用，Na+對其基本無影響，而添加Zn2+和Ca2+后，色素保存率迅速下降。所以對桑葚花色苷而言，應盡可能避免使用銅、鐵容器進行加工與貯存，同時也要避免與Zn2+和Ca2+接觸。

4 桑葚花色苷的生理活性

4.1 抗氧化作用

Arfan等[24]采用甲醇和丙酮提取黑桑葚和白桑葚中的酚類化合物，結(jié)果表明兩種桑葚的無糖提取物具有很強的抗氧化能力，可以替代合成抗氧化劑使用。Yang等[25]對桑葚甲醇提取物的抗氧化活性和抑菌活性進行了評價，結(jié)果表明桑葚花色苷具有抗氧化和抑菌作用。胡金奎[12]研究了桑葚花色苷的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)半制備高效液相色譜純化得到的矢車菊3-O-葡萄糖苷（C3G）、矢車菊3-O-蕓香糖苷（C3RG）和MAHP（桑葚花色苷半制備液相色譜純化后產(chǎn)物，C3G和C3RG的混合物）均具有很強的抗氧化活性，并隨花色苷濃度的增加而增大，其清除羥基自由基活性甚至高于VC。

4.2 保護心肌作用

曾潔等[26]采用大鼠建立異丙腎上腺素性心肌缺血模型，測定各組大鼠血漿中超氧化物歧化酶總活性（T-SOD）、丙二醛（MDA）及心肌ATP酶活性，結(jié)果表明心肌缺血（模型組對照組）大鼠血漿T-SOD和ATP酶活性降低，MDA含量升高，桑葚高中劑量組能改善上述變化，因此桑葚花色苷可提高SOD、ATP酶的活性以及降低MDA活性，從而發(fā)揮心肌保護作用。

4.3 抗腫瘤作用

金紅艷等[27]采用在裸鼠右肩皮下注射乳腺癌細胞懸液的方法建立移植乳腺癌模型，研究桑葚花色苷對乳腺癌裸鼠腫瘤組織中VEGF、p53及Ki67表達的影響，結(jié)果表明，與對照組相比，桑葚花色苷低劑量組、中劑量組及高劑量組的癌瘤濕重水平及癌重系數(shù)均明顯下降，VEGF與p53、Ki67陽性表達率均明顯下降；與陽性藥組相比，花色苷中劑量組和高劑量組的癌瘤濕重以及癌重系數(shù)、VEGF與p53、Ki67陽性率下降程度更為明顯。因此，桑葚花色苷能夠明顯抑制乳腺癌的發(fā)展，這可能與其抑制P53、Ki67在和VEGF的表達有關(guān)。

常徽等[28]利用超聲輔助乙醇萃取法提取桑葚花色苷，以50，100和150 mg/mL桑葚花色苷提取物作用于三種乳腺癌細胞MDA-MB-231、MDA-MB-453和MCF-724h，分析了人乳腺癌細胞凋亡及線粒體膜電位變化，發(fā)現(xiàn)桑葚花色苷提取物可顯著降低乳腺癌細胞線粒體膜電位，并促發(fā)細胞凋亡。

張蕾等[29]采用MTT法檢測了桑葚花色苷對SGC-7901細胞的增殖作用，結(jié)果表明桑葚花色苷能抑制SGC-7901細胞增殖，而流式細胞術(shù)及Hoechst 33342/PI雙染結(jié)果顯示桑葚花色苷可誘導SGC-7901細胞凋亡，其機制與上調(diào)SGC-7901細胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，BAX/BCL-2比值及Beclin1、Caspase-8的表達有關(guān)。但是桑葚花色苷誘導的SGC-7901細胞自噬與凋亡之間的關(guān)系和相關(guān)信號分子途徑還需進一步研究。

5 結(jié)語

隨著人們對食品安全的日益重視，天然色素取代人工色素成為食品添加劑的發(fā)展方向。我國種桑養(yǎng)蠶歷史悠久，桑葚資源豐富，但由于桑葚果實不易運輸和保存，目前開發(fā)利用一般為就地售賣果實，或者加工為果酒、果汁、果醬等低附加值產(chǎn)品。桑葚花色苷具有抗氧化、延緩衰老、保護心肌、抗癌抗腫瘤等保健功能，易提取且穩(wěn)定性好，在食品、化妝品著色方面具有廣闊前景。對桑葚中花色苷的結(jié)構(gòu)還需要進一步深入研究，明確品種與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，建立指紋圖譜庫，更好地指導生產(chǎn)實踐中對原料的選擇。針對其藥理學作用和特殊人群的不同需求，可研發(fā)藥品或開發(fā)相應的保健食品，將桑葚資源優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟優(yōu)勢。