響應(yīng)面法優(yōu)化桂花蜂蜜酒發(fā)酵工藝

董彩文 ，王雪純，李一晴，洪德立，楊曉磊 ，胡曉龍 *

1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（鄭州 450002）；2. 河南省食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心（鄭州 450002）；3. 長葛市頤恒健蜂業(yè)有限公司（長葛 461502）；4. 許昌市蜂蜜發(fā)酵工程技術(shù)研究中心（長葛 461502）

桂花蜂蜜酒是以干桂花、蜂蜜為原材料，經(jīng)過發(fā)酵釀制而得的低度酒，有滋補(bǔ)功效的作用[1]。蜂蜜中主要的活性成分有蛋白質(zhì)、維生素等，其保健和營養(yǎng)價(jià)值高[2-4]，中國蜂蜜種類多，資源豐富，蜂蜜酒釀造歷史悠久[5]。飲用蜂蜜酒有潤肺止咳、促進(jìn)人體腸胃消化、滋潤腸道的功效，還能抗衰老、增強(qiáng)抵抗力[6-7]。以蜂蜜單一發(fā)酵的蜂蜜酒蜂蜜單一難以滿足需求[8]，因桂花的香氣濃郁，還含有一些抗氧化活性物質(zhì)，有著重要的經(jīng)濟(jì)、藥用價(jià)值。

試驗(yàn)主要以油菜蜜、干桂花為原材料釀制桂花蜂蜜酒，加入發(fā)酵助劑對其進(jìn)行優(yōu)化，確定桂花蜂蜜酒發(fā)酵工藝最佳條件[9]，以釀造出口感佳、香味濃、營養(yǎng)價(jià)值高的蜂蜜酒，迎合人們對蜂蜜酒的需求，滿足市場和社會需求。

1 材料與方法

1.1 主要材料

油菜蜜（河南省長葛市）；干桂花（廣西桂林）；南陽麥曲（河南省南陽市鎮(zhèn)平縣）；高活性酵母（安琪酵母股份有限公司）。

HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋；SW-CJ-1D型單人凈化工作臺；TG16-WS臺式高速離心機(jī)；LX-C35L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器；電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

蜂蜜→稀釋→成分調(diào)整→蜜汁分裝→干桂花加入→巴氏殺菌（85 ℃，15 min）→接種→發(fā)酵→離心→成品

1.2.2 測定方法

酒精度，酒精計(jì)比重法[10]；糖度，糖度計(jì)測定。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 干桂花加入量對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響

調(diào)配蜂蜜溶液糖度28%，每個(gè)容量瓶中分裝300 mL蜂蜜酒，分別加入1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 g干桂花；置于85 ℃水浴鍋恒溫加熱15 min，經(jīng)巴氏滅菌后取出冷卻至室溫，依次加入0.2%酵母、4%麥曲；在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)結(jié)束后離心、蒸餾、酒精度測定，以此為依據(jù)確定最佳干桂花加入量。

1.2.3.2 溫度對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響

調(diào)配蜂蜜溶液糖度28%，每個(gè)容量瓶中分裝300 mL蜂蜜酒，依次加入2 g干桂花，置于85 ℃水浴鍋恒溫加熱15 min，經(jīng)巴氏滅菌后取出冷卻至室溫，依次加入0.2%酵母、4%麥曲；分別置于24，26，28，30和32 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)結(jié)束后離心、蒸餾、酒精度測定，確定最佳發(fā)酵溫度。

1.2.3.3 時(shí)間對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響

調(diào)配蜂蜜溶液糖度28%，每個(gè)容量瓶中分裝300 mL蜂蜜酒，依次加入2 g干桂花，置于85 ℃水浴鍋恒溫加熱15 min，經(jīng)巴氏滅菌后取出冷卻至室溫，依次加入0.2%酵母、4%麥曲；置于30 ℃培養(yǎng)箱分別發(fā)酵培養(yǎng)5，6，7，8和9 d，培養(yǎng)結(jié)束后離心、蒸餾、酒精度測定，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

1.2.3.4 麥曲加入量對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響

將蜂蜜溶液糖度調(diào)配28%，每個(gè)容量瓶中分裝300 mL蜂蜜酒，加入2 g干桂花；置于85 ℃水浴鍋恒溫加熱15 min，經(jīng)巴氏滅菌后取出冷卻至室溫，依次加入0.2%酵母，再分別加入2%，4%，6%，8%和10%麥曲；在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)結(jié)束后離心、蒸餾、酒精度測定，確定最佳麥曲加入量。

1.2.3.5 磷酸氫二銨加入量對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響

將蜂蜜溶液糖度調(diào)配28%，每個(gè)容量瓶中分裝300 mL蜂蜜酒，加入2 g干桂花；置于85 ℃水浴鍋恒溫加熱15 min，經(jīng)巴氏滅菌后取出冷卻至室溫，依次加入0.2%酵母、6%麥曲，分別加入0.3，0.6，0.9，1.2和1.5 g/L銨鹽，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)結(jié)束后離心、蒸餾、酒精度測定，確定最佳銨鹽加入量。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇干桂花加入量、麥曲加入量、溫度3個(gè)因素作為相應(yīng)因子，酒精度為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，已確定最佳水平。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 干桂花加入量對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響試驗(yàn)結(jié)果按照1.2.3.1方法對所得樣品進(jìn)行測定，得出干桂花加入量對桂花蜂蜜酒發(fā)酵酒精度影響的結(jié)果。由圖1可知，酒精度隨著桂花加入量從1.0 g增加到1.5 g而逐漸升高，加入量增加到2.0 g時(shí)酒精度達(dá)到最大值，之后酒精度隨著其加入量增加呈先下降后上升趨勢，所以最佳桂花加入量在2.0 g附近。

圖1 干桂花加入量對酒精度的影響

2.1.2 溫度對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.3.2方法對所得樣品進(jìn)行測定，得出溫度對干桂花蜂蜜酒酒精度發(fā)酵影響的結(jié)果。由圖2可知，酒精度隨著發(fā)酵溫度升高而逐漸升高，在30 ℃時(shí)酒精度達(dá)到最大值，在30 ℃之后酒精度趨于穩(wěn)定，所以合適溫度為30 ℃。

圖2 溫度對酒精度的影響

2.1.3 時(shí)間對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.3.3方法對所得樣品進(jìn)行測定，得出時(shí)間對桂花蜂蜜酒發(fā)酵影響酒精度的結(jié)果。由圖3可知，酒精度隨著發(fā)酵時(shí)間增加而逐漸升高，6 d之后酒精度趨于穩(wěn)定，所以最佳發(fā)酵時(shí)間為6 d。

圖3 時(shí)間對酒精度的影響

2.1.4 麥曲加入量對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.3.4對所得樣品進(jìn)行測定，得出麥曲加入量對桂花蜂蜜酒酒精度發(fā)酵影響的結(jié)果。由圖4可知，麥曲加入量在2%～4%時(shí)，酒精度明顯上升；在4%～6%時(shí)，酒精度略微上升；在6%～8%時(shí)，酒精度緩慢上升；當(dāng)麥曲加入量增加到10%時(shí)，酒精度略微下降。整體來看酒精度隨著其加入量增加呈先上升后平穩(wěn)趨勢。由方差分析可知其加入量在6%，8%和10%在95%水平下無顯著性差異，綜合考慮，最佳麥曲加入量為6%。

圖4 麥曲加入量對酒精度的影響

2.1.5 磷酸氫二銨加入量對桂花蜂蜜酒發(fā)酵的影響試驗(yàn)結(jié)果

按照1.2.3.5方法對所得樣品進(jìn)行測定，得出銨鹽加入量對桂花蜂蜜酒發(fā)酵影響的結(jié)果。由圖5可知，酒精度隨著銨鹽加入量增加而逐漸升高，由方差分析可知銨鹽質(zhì)量濃度0.9，1.2和1.5 g/L這3個(gè)試驗(yàn)組在95%水平下差異無顯著。綜合考慮，銨鹽質(zhì)量濃度選為0.9 g/L。

圖5 銨鹽加入量對酒精度的影響

2.2 干桂花蜂蜜酒工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)酵工藝

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立和顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到回歸模型，對各因素回歸擬合后得到回歸方程：酒精度=14.14+0.29A+0.61B+1.94C+0.30AB-0.78AC-1.33BC-0.20A2+1.41B2-1.34C2?；貧w方差的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可知，回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.864 9，表明約86.49%可為該模型解釋。響應(yīng)面分析顯示可知該模型的p=0.023 0＜0.05，說明該模型對其酒精度的影響結(jié)果是差異顯著的。由失擬項(xiàng)p＞0.05可知該模型失擬項(xiàng)不顯著，模擬程度較好。對A、B、C進(jìn)行分析顯示，發(fā)現(xiàn)C（溫度）p=0.002 0＜0.01，說明溫度對酒精度的影響差異高度顯著。而麥曲p=0.178 3＞0.05、干桂花p=0.490 3＞0.05，說明麥曲、干桂花添加量對酒精度影響不顯著。在二次項(xiàng)中B=0.039 7＜0.05、C=0.047 4＜0.05，麥曲、溫度對酒精度差異顯著。綜上分析可知，該回歸方程給酒精度提供一個(gè)合適模型。從F值看出3個(gè)因素對酒精度影響的主次順序?yàn)镃＞B＞A。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果

表3 回歸方程方差分析結(jié)果

2.2.3 響應(yīng)面分析結(jié)果

響應(yīng)面的曲面形狀可作為其影響因素顯著水平的依據(jù)，曲面的陡峭程度用以表明其顯著性，曲面越陡說明越顯著。由圖6可看出，相對于麥曲加入量、干桂花加入量，溫度對酒精度影響較為顯著。

圖6 溫度、麥曲加入量、桂花加入量及交互作用對桂花蜂蜜酒發(fā)酵酒精度影響的響應(yīng)面

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

軟件分析得出的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：糖度28%、酵母加入量0.2%、銨鹽質(zhì)量濃度0.9 g/L、麥曲添加量9%，在28 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵6 d。在此發(fā)酵條件下酒精度達(dá)到17.28%vol。對此發(fā)酵工藝條件重復(fù)2次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到其酒精度為16.98%vol，實(shí)際測定值與預(yù)測值相對誤差為1.7%，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面對桂花蜂蜜酒進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：糖度28%、酵母加入量0.2%、銨鹽質(zhì)量濃度0.9 g/L、麥曲添加量9%，在28 ℃發(fā)酵6 d。此發(fā)酵條件下干桂花蜂蜜酒酒精度為16.98%vol。