玉米醇溶蛋白/阿拉伯膠負載槲皮素納米顆粒制備

金紹娣，許雪兒，楊靜

鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學院九洲藥學院（鹽城 224005）

槲皮素（Que）廣泛存在于植物的花、葉、果實中，是一種多羥基黃酮類化合物，具有抗氧化清除自由基、抗癌、抗凝血、保護心血管等多種藥理活性。然而，槲皮素難溶于水，在酸性堿性、光氧條件下均不穩(wěn)定，嚴重限制其在食品和藥物領域中的應用[1]。

玉米醇溶蛋白（Zein）作為一種天然的生物大分子材料，不溶于水，能溶于50%～90%乙醇水溶液，溶于高濃度堿液，分子結(jié)構(gòu)含有大量的疏水氨基團和極性氨基團。玉米醇溶蛋白其獨特溶解性和特有的兩親性，能夠有效制備納米顆粒，作為食品活性成分和藥物輸送載體，但因靜電斥力易發(fā)生聚集，因而影響了應用[2]。阿拉伯膠（AG）是一種具有低蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多支鏈多糖，能通過非共價鍵相與蛋白質(zhì)發(fā)生絡合，使zein的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)得到強化，提高zein的穩(wěn)定性，提高其耐酸堿鹽性[3-5]。

試驗通過制備所得zein-AG納米顆粒對Que進行高效負載，以達到緩釋效果，提高其利用率。通過反溶劑法結(jié)合AG制備負載Que的zein納米顆粒，研究玉米醇溶蛋白/阿拉伯膠的濃度比、玉米醇溶蛋白/阿拉伯膠與槲皮素質(zhì)量比、pH、鹽離子濃度變化對納米顆粒穩(wěn)定性的影響，并對Que的包封率和負載率進行探究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素、阿拉伯膠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；玉米醇溶蛋白（蘇州嘉葉生物科技有限公司）；氯化鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、無水乙醇、二甲基亞砜（國藥集團化學試劑有限公司）；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

冷凍干燥機（FD18-QX立式型）；臺式低速自動平衡離心機（TDZ5B-WS型）；磁力攪拌器（上海精密儀器有限公司）；納米粒度電位儀（Zetasizer Nano ZS，馬爾文儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9023A，北京利輝試驗設備有限公司）；紫外可見光分光光度計（UV1801，北京瑞利分析儀器有限公司）；傅里葉紅外光譜儀（PerkinElmer Spectrum GX，珀金埃爾默股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 zein-AG納米顆粒制備

參照Zhang[6]的方法，稱取0.5 g zein溶于10 mL 80 g/100 mL乙醇溶液中，磁力攪拌30 min，得到質(zhì)量濃度為100 g/L zein儲備液；稱取一定量AG溶于10 mL去離子水中，在500 r/min條件下磁力攪拌1 h得到AG儲備液；量取400 μ L zein儲備液呈細流狀移至39.0 mL的去離子水中，移取600 μL AG儲備液至去離子水中，磁力攪拌60 min，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，得zein-AG納米顆粒分散液，待后續(xù)試驗。

1.3.2 負載Que的納米顆粒制備

取800 μL 1.3.1制備好的Que-zein儲備液移至去離子水中，移取200 μL AG儲備液至去離子水中，攪拌1 h，以3 000 r/min離心10 min后，取上清液得Que-zein-AG納米顆粒[7]。

1.3.3 不同AG質(zhì)量濃度比zein-AG納米顆粒粒徑、電位、PDI測定

將分別稱取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8和0.9 g AG溶于10 mL 80 g/100 mL乙醇溶液中，磁力攪拌1 h得到質(zhì)量濃度為10，20，30，40，50，60，70，80和90 g/L的AG儲備液，按照步驟1.3.1制成zein-AG納米顆粒，稀釋10倍后，利用納米粒度電位儀分別測定其平均粒徑、ζ-電位及顆粒多分散性（PDI）。

1.3.4 不同Que與zein-AG質(zhì)量比納米顆粒粒徑、ζ-電位、PDI測定

制備Que與zein-AG不同質(zhì)量比（1︰1，1︰2，1︰4，1︰6，1︰8，1︰10，1︰20，1︰40，1︰60，1︰80和1︰100）的納米顆粒，分別取1 mL不同含量的Que/zein-AG納米顆粒，稀釋10倍，分散均勻，上機測定。

1.3.5 不同pH下納米顆粒粒徑、ζ-電位、PDI測定

用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)節(jié)樣品pH至2～12，分別取不同pH納米顆粒1 mL，稀釋10倍，測定其粒徑、電位及PDI。

1.3.6 不同鹽離子強度下納米顆粒粒徑、ζ-電位、PDI測定

取5 mL現(xiàn)制的納米顆粒，分別加入50～100 mmol/L不同濃度的氯化鈉溶液，攪拌均勻，靜置30 min。分別取1 mL不同氯化鈉濃度的納米顆粒，稀釋10倍，待后續(xù)試驗。

1.3.7 Que包封率和負載率測定

參照Donsi等[8]的方法并稍作改動，移取10 mL負載Que的納米顆粒、10 mL二甲基亞砜置于燒杯中，攪拌1 h，萃取得游離的Que，用0.22 μm有機膜過濾，重復萃取3次，合并萃取液用二甲基亞砜稀釋10倍，以二甲基亞砜作為空白對照，于槲皮素特征吸收峰λ=375 nm處測定樣品的吸光度，根據(jù)Que在乙醇中標準曲線線性回歸方程：y=0.006 5+0.009x，r=0.999 5。計算游離槲皮素含量，根據(jù)（1）得出槲皮素包封率，式（2）計算槲皮素負載率。

1.3.8 傅立葉變換紅外光譜分析

采用衰減全反射法，Que、zein/Que納米顆粒、zein-AG/Que納米顆粒分別經(jīng)壓片后傅立葉變換紅外光譜分析，波數(shù)范圍4 000～550 cm-1，分辨率2 cm-1，掃描4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同AG質(zhì)量濃度下zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位值

zein-AG納米顆粒粒徑、PDI隨AG質(zhì)量濃度變化如圖1（a）所示，AG質(zhì)量濃度10～30 g/L，zein-AG納米顆粒聚集，分散液有明顯沉淀現(xiàn)象，PDI值均為1；AG質(zhì)量濃度40～90 g/L內(nèi)，聚集減輕，粒徑、PDI值隨濃度增加而降低，50 g/L以上呈穩(wěn)定態(tài)，粒徑在210～380 nm，PDI值在0.3～0.6；納米顆粒電位隨AG質(zhì)量濃度變化如圖1（b）所示，測得zein納米顆粒帶正電荷（+35 mV），AG質(zhì)量濃度10 g/L時，體系電位下降至+0.75 mV，表明阿拉伯膠與玉米醇溶蛋白表面的正電荷發(fā)生靜電作用；AG質(zhì)量濃度增加到20 g/L時，更多的阿拉伯膠分子吸附到顆粒表面，電位值為-12.2 mV，納米顆粒帶負電荷；AG質(zhì)量濃度50～90 g/L，阿拉伯膠溶液達到飽和，納米顆粒處于穩(wěn)定。由圖1的粒徑、PDI、電位可知，制備zein-AG納米顆粒時，應選取50 g/L的AG質(zhì)量濃度為最佳。

2.2 不同Que與zein/AG質(zhì)量濃度比下納米顆粒粒徑、PDI、電位值

納米顆粒粒徑、PDI隨與Que質(zhì)量濃度變化如圖2（a）所示，在1︰1～1︰10范圍內(nèi)，隨著zein-AG納米顆粒質(zhì)量濃度增高，粒徑變??；大于1︰10時，粒徑、PDI均較為穩(wěn)定，納米顆粒粒徑在161.1 nm左右，PDI也在0.25左右，zein-AG與槲皮素通過非共價相互作用，將其完全包住在納米顆粒內(nèi)；電位隨與Que質(zhì)量濃度變化如圖2（b）所示，隨著zein-AG質(zhì)量濃度比例增大，電位隨之下降；1︰10～1︰80時，電位下降但變化無顯著性差異，在-35 mV左右，與Wu等[9]研究結(jié)果一致，飽和負載物的納米顆粒之間因負電荷的靜電斥力及多糖分子覆蓋后形成的空間位阻作用保持穩(wěn)定。

圖1 不同AG質(zhì)量濃度對zein-AG納米顆粒粒徑、PDI、電位的影響

圖2 不同Que與zein-AG質(zhì)量濃度比對納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響

2.3 不同pH納米顆粒粒徑、PDI、電位值

納米顆粒的粒徑與PDI隨pH的變化如圖3（a）所示，pH 3～4內(nèi)，粒徑隨之增加而減小（210.3和163.1 nm）時，阿拉伯膠有足夠的負電荷與zein顆粒結(jié)合，靜電吸引增強；pH 5～10內(nèi)，在122.5～163.2 nm，呈穩(wěn)態(tài)，PDI值均在0.3～0.4，無明顯變化。納米顆粒的電位隨pH的變化關(guān)系見圖3（b），電位隨pH升高而降低，體系pH 3～4時，電位較低（-18.5和-19.1 mV），pH 5～10時，復合納米顆粒表面凈負電荷增加，電位保持在-30 mV左右。納米顆粒在廣泛的pH變化下能較好維持體系穩(wěn)定，粒狀均一，相比zein顆粒在等電點（pH 6.2）附近因疏水作用發(fā)生嚴重聚集的現(xiàn)象有明顯改善。黃旭琳[10]研究的果膠復合玉米醇溶蛋白納米顆粒在pH 3.0以下因果膠分子的空間位阻作用而穩(wěn)定，高于pH 3.0因納米顆粒之間靜電斥力增強，穩(wěn)定性增加的結(jié)果與試驗結(jié)果一致。

圖3 不同pH對納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響

2.4 不同鹽離子強度納米顆粒粒徑、PDI、電位值

納米顆粒粒徑、PDI、電位隨鹽離子強度變化如表1所示，氯化鈉濃度0～30 mmol/L內(nèi)，粒徑、PDI隨之增加逐漸增加，顆粒粒徑平均在210 nm左右，低強度鹽離子時納米顆粒體系較為穩(wěn)定；氯化鈉濃度50 mmol/L時，分散液的外觀變得混濁，粒徑明顯增加，濃度達到90 mmol/L時，納米顆粒聚集嚴重，發(fā)生沉淀。同Huang等[11]研究結(jié)果相似，高濃度的鹽離子會中和多糖及蛋白分子表面的大量電荷，降低zein與AG之間的靜電作用。

表1 不同鹽濃度對納米顆粒粒徑、PDI、電位值的影響

2.5 不同Que與zein-AG質(zhì)量濃度比下槲皮素包封率和負載率

包封率、負載率隨Que與zein-AG質(zhì)量濃度比變化由表2可知，隨著zein-AG納米顆粒濃度增大，體系包封率、負載率逐漸增加，在Que與zein-AG質(zhì)量濃度比大于1︰20時，包封率逐漸增大至89.1%，負載率至18.62%，此時納米顆粒體系中zein-AG達到飽和，能夠把槲皮素包埋在納米體系內(nèi)，其結(jié)果與2.2一致，也與殷婷等[12]研究大麥醇溶蛋白負載白藜蘆醇自組裝納米顆粒包封率為90.4%，載藥率達到18.8%報道一致。

表2 不同Que與zein-AG質(zhì)量濃度比槲皮素包封率和負載率影響

2.6 傅立葉變換紅外光譜測試

Que的紅外光譜圖如圖4A，3 481 cm-1處是酚羥基（—OH）吸收峰；1 737 cm-1處是碳氧鍵（—C＝O）伸縮振動峰；1 567和1 484 cm-1這2個峰為苯環(huán)（—C＝C—）骨架振動吸收峰；1 305 cm-1為—C—O—C面內(nèi)變形振動峰，結(jié)果與瑪麗哈巴·拜克來[13]表征一致。zein/Que納米顆粒的紅外光譜圖如圖4B所示，3 529 cm-1處為蛋白質(zhì)氮氫鍵振動峰；1 833和1 737 cm-1這2個峰分別為蛋白質(zhì)酰胺I帶（C—O）和酰胺Ⅱ帶（C—N和N—H）[14]。zein-AG/Que納米顆粒的紅外光譜圖如圖4C所示對比zein/Que納米顆粒（圖2B）可知，在復合納米顆粒中氫鍵發(fā)生紅移至3 501 cm-1，槲皮素與蛋白之間存在的靜電相互作用，槲皮素—OH吸收帶被完全掩蓋，—C＝O伸縮振動吸收帶也偏移至1 808 cm-1，表明阿拉伯膠與蛋白質(zhì)形成新的氫鍵絡合，其特征峰幾乎都發(fā)生偏移、強度降低。

圖4 Que、zein/Que納米顆粒、zein-AG/Que納米顆粒傅里葉紅外光譜圖

3 結(jié)論

通過優(yōu)化AG濃度制備zein-AG載體，考察槲皮素/玉米醇溶蛋白-阿拉伯膠質(zhì)量比、pH、鹽離子強度對運載體系穩(wěn)定性的影響，制備得到zein-AG/Que納米顆粒。研究發(fā)現(xiàn)復合AG的zein納米顆粒的穩(wěn)定性增強，耐鹽耐酸堿性，可作為槲皮素的有效輸送載體，改善其生物活性利用度。