貯藏及熱處理對桑葚酒中多酚類物質(zhì)含量的影響

李杰，王虹然，林澤斌*，黃建香，李小定

1. 廣東暨晴生物醫(yī)藥科技有限公司（惠州 516081）；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（武漢 430070）

桑葚（Mulberry）是桑科桑屬落葉喬木桑樹的成熟果穗，色澤艷麗、肉質(zhì)甘甜油潤，素有“民間圣果”之美譽(yù)[1-2]。其富含豐厚的有機(jī)酸、糖、游離氨基酸、多種維生素以及微量元素，能藥食兩用，用其壓榨果汁制作的酒也頗具風(fēng)味。桑葚酒是潮汕地區(qū)古老的果酒，含有豐富的花青素、白藜蘆醇等多酚類活性物質(zhì)，有抗氧化、延遲老化、降血壓、防齲齒、防輻射、抗過敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能[3]。

花青素等多酚類物質(zhì)是植物在正常生長以及應(yīng)激反應(yīng)過程中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[4]。桑葚富含桑葚紅色素，為水溶性花青素，其強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基的能力來源于分子中高含量的酚羥基[5]。國內(nèi)對桑葚花青素的研究主要集中在提取工藝和穩(wěn)定性方面[6-9]，而對其多酚類物質(zhì)在貯藏過程中的穩(wěn)定性研究較少。Jia等[10]、Dastmalchi等[11]研究表明桑葚花青素對光、溫度、pH等十分敏感；亦有研究證明桑葚紅色素對溫度耐受性較差，高溫易降解[12]。pH示差法能夠簡單快速地測定花青素的含量，是目前使用最多的方法[13-14]。花青素具有強(qiáng)大的抗氧化活性，其測定方法主要有鄰苯三酚法、硫代巴比妥酸法、過氧化值法、水楊酸法、普魯士藍(lán)法等[15]。試驗(yàn)采用水楊酸法測定桑葚酒的抗氧化活性大小。

在貯藏過程中，食品中的主要營養(yǎng)成分會發(fā)生一系列的變化，通過改變貯藏溫度考察桑葚酒中多酚類物質(zhì)含量的變化，以確定最佳貯藏溫度及時(shí)間，為延長其貨架期提供理論指導(dǎo)依據(jù)。分別選取貯藏溫度為4，25和45 ℃，即探究在冷藏、室溫放置及炎熱高溫氣候放置的狀態(tài)下桑葚酒中多酚類物質(zhì)含量的變化。同時(shí)，熱處理工藝是食品工業(yè)生產(chǎn)加工時(shí)最常見的處理手段之一，由于花青素對溫度十分敏感，在熱處理過程中會慢慢降解[16-17]，因此更需要探究在不同熱處理溫度的條件下，桑葚酒中熱敏性成分（如花青素）含量的波動情況，進(jìn)而加以避免及控制，試驗(yàn)通過檢測桑葚酒在60，70和80 ℃溫度的熱處理過程中5 h內(nèi)花青素含量的變化并進(jìn)行對比，為進(jìn)一步探究熱處理溫度對花青素含量的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚酒（桑葚干紅）：湖北圣果酒莊有限公司，原汁含量100%，酒精度12%vol，置于陰涼處避光備用。

無水乙醇、鹽酸、30%過氧化氫、福林-酚試劑、無水碳酸鈉、氯化鉀、三水合乙酸鈉、氫氧化鈉、水楊酸、七水合硫酸亞鐵、九水合硝酸鋁、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

723可見光分光光度計(jì)（天津普利萊斯儀器有限公司）；AL204電子天平（Mettler Toledo儀器有限公司）；KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州恒巖儀器有限公司）；pH計(jì)（美國Mettler Toledo儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 桑葚酒的貯藏及熱處理

取80 mL桑葚酒于100 mL離心管中，充氮后蓋好蓋，分別置于4，25和45 ℃溫度的恒溫箱中保存、待測，貯藏穩(wěn)定性監(jiān)測周期為10 d。

桑葚酒用具塞玻璃試管分裝后在60，70和80 ℃溫度下水浴加熱，每間隔一定時(shí)間取樣，立即冰水浴冷卻后檢測花青素含量，熱處理穩(wěn)定性監(jiān)測周期為5 h。

1.3.2 總酚含量的測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)吳曉敏等[18]報(bào)道的方法改進(jìn)后進(jìn)行檢測。具體方法：精確稱量10.0 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，添加部分蒸餾水后超聲溶解1 min，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。精確移取標(biāo)準(zhǔn)液0，0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mL于10 mL容量瓶中，按序添加2 mL水、0.5 mL福林酚試劑，混勻，1 min后加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，混勻后用蒸餾水定容至刻度，搖勻，超聲10 s除去氣泡，室溫下避光靜置20 min后，以沒有加入標(biāo)準(zhǔn)液的試管為參比，在765 nm下測定吸光度。橫坐標(biāo)x為沒食子酸質(zhì)量濃度（mg/mL），縱坐標(biāo)y為吸光度做線性回歸曲線，獲得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程及相關(guān)系數(shù)，即y=0.122 4x+0.048 7（R2=0.998 8）。

檢測前，將桑葚酒進(jìn)行稀釋，使其吸光度在0.2～0.8之間。確定稀釋倍數(shù)后，取0.5 mL其稀釋液置于10 mL比色管中，按序添加6 mL蒸餾水、0.5 mL福林-酚試劑后混勻，靜置1 min后加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，混勻后用蒸餾水定容至刻度。以不加樣品的試管為參比，在765 nm處測定其吸光度，然后根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的總酚含量。

1.3.3 總黃酮含量的測定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：根據(jù)張琪等[19]的測定方法（福林酚法）進(jìn)行優(yōu)化。具體方法：精確稱取2.5 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，添加適量75%的乙醇溶液，超聲溶解后定容至刻度，搖勻，獲得質(zhì)量濃度為0.050 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。精確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0，1，2，3，4和5 mL于50 mL容量瓶中，分別加入15 mL無水乙醇、1 mL 100 g/L硝酸鋁溶液、1 mL 1 mol/L乙酸鉀，混勻后用蒸餾水定容至刻度，搖勻，超聲溶解10 s去除氣泡，室溫下靜置1 h后以不含蘆丁標(biāo)準(zhǔn)使用液的試管為參比，在415 nm下測定吸光度。以蘆丁溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)x，吸光度為縱坐標(biāo)y做線性回歸曲線，獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程及相關(guān)系數(shù)，即y=0.035 5x+0.024 7（R2=0.999 0）。

檢測前，將桑葚酒稀釋合適倍數(shù)使得吸光度在0.2～0.8之間，取4 mL樣品稀釋液，按序添加1 mL 100 g/L硝酸鋁溶液、1 mL 1 mol/L乙酸鉀溶液，混勻后用水定容至刻度，超聲10 s去除氣泡，室溫下靜置1 h后以只加水的桑葚酒為參比，在415 nm下測定其吸光度，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的總黃酮含量。

1.3.4 花青素含量的測定

花青素的色度隨pH的改變而發(fā)生變化，而干擾物質(zhì)特征光譜不隨pH的改變而改變。當(dāng)pH 1時(shí)，花青素以2-苯基苯并吡喃（紅色）的方式存在；當(dāng)pH 4.5時(shí)，花青素以甲醇假堿（無色）的形式存在。根據(jù)朗伯-比爾定律可得出，在兩個(gè)pH下，花青素溶液的吸光度的差值與花青素的含量成比例?；ㄇ嗨睾康臏y定采用pH示差法[20]，其含量表示為矢車菊素-3-葡萄糖苷當(dāng)量。檢測前，將樣品進(jìn)行稀釋使其吸光度在0.2～0.8之間，即分別取樣品1 mL至兩支10 mL比色管中，其中一支添加9 mL pH 1.0的緩沖液，另一支添加9 mL pH 4.5的緩沖液，室溫下避光靜置30 min后在510和700 nm下測定樣品的吸光度。

式中：A為吸光度，計(jì)算方法為A=（A510-A700）pH1.0-（A510-A700）pH4.5；MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量449.2，Da；DF為稀釋倍數(shù)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)，26 900；L為光程長，1 cm。

1.3.5 羥自由基清除率的測定

儲備液的制備：精確稱取0.208 5 g七水合硫酸亞鐵固體于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到7.5 mmol/L的硫酸亞鐵溶液；精確稱取0.103 6 g水楊酸固體于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，得到7.5 mmol/L的水楊酸乙醇溶液；精確稱取0.17 g 30% H2O2溶液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到7.5 mmol/L的過氧化氫溶液以備用。將三者1︰1︰1混合，得到300 mL儲備液，備用。

測定步驟：根據(jù)趙平等[21]的方法（水楊酸法）優(yōu)化后進(jìn)行檢測。取3支10 mL比色管并分別標(biāo)號（1～3），移取桑葚酒0.5 mL于2和3號比色管中，再取2 mL儲備液依次加入至1和2號比色管中，用蒸餾水將3支比色管定容至刻度后在526 nm處測定其吸光度，1號為A0，2為A1，3號為A2。羥自由基清除率I=[1-（A1-A2）/A0]×100%。式中：I為花青素對OH·的清除率，%；A0為儲備液的吸光度；A1為含樣品及儲備液的吸光度；A2為只含樣品的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel和Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，p＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏過程中桑葚酒中總酚含量的變化

如圖1所示，在4 ℃的貯藏條件下桑葚酒中總酚含量呈現(xiàn)出先下降再平穩(wěn)的趨勢，在貯藏4 d后總酚含量最低（779.18 μg/mL）；在25 ℃的貯藏條件下桑葚酒中總酚含量呈現(xiàn)出先下降再上升的趨勢，在貯藏2 d后降到最低含量（836.56 μ g/mL），5 d后上升趨勢趨于平穩(wěn)；在45 ℃的貯藏條件下桑葚酒中總酚含量呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，在貯藏10 d后降到最低含量（737.42 μg/mL）。經(jīng)過顯著性分析，在三種儲藏溫度下，桑葚酒中多酚含量均存在著顯著性差異。結(jié)果表明，冰箱冷藏或夏日炎熱氣候均會導(dǎo)致桑葚酒中總酚含量的下降，為保持桑葚酒中的多酚類物質(zhì)，在25℃貯藏較為適宜。

圖1 桑葚酒總酚含量變化曲線

2.2 貯藏過程中桑葚酒中總黃酮含量的變化

如圖2所示，在4 ℃的貯藏條件下桑葚酒中總黃酮含量呈現(xiàn)出不斷波動的趨勢，但整體上呈現(xiàn)出減小的趨勢，貯藏10 d后降低到最低含量（130.03 μg/mL）；在25 ℃的貯藏條件下桑葚酒中總黃酮含量也呈現(xiàn)出波動的趨勢，但整體保持持平的趨勢，貯藏10 d后含量為155.02 μg/mL，較初始狀態(tài)略高；在45 ℃的貯藏條件下桑葚酒中總黃酮含量呈現(xiàn)出與4 ℃條件下類似的上下浮動趨勢，貯藏10 d后總黃酮含量僅為134.01 μg/mL。通過顯著性差異分析，在4與45 ℃貯藏溫度下，二者的總黃酮含量無顯著性差異，而在25℃時(shí)，其總黃酮含量與前二者有顯著性差異。結(jié)果表明，在25 ℃貯藏條件下，桑葚酒總黃酮含量顯著高于其余兩個(gè)貯藏溫度，因此從總黃酮含量的角度考慮，桑葚酒更適宜在常溫25 ℃的條件下貯藏。

圖2 桑葚酒總黃酮含量變化曲線

2.3 貯藏過程中桑葚酒中花青素含量的變化

如圖3所示，在4和25 ℃的貯藏條件下桑葚酒中花青素保留率呈現(xiàn)出逐步緩慢下降的趨勢，在貯藏10 d后均達(dá)到保留率66%左右；但在45 ℃的貯藏條件下桑葚酒中花青素保留率呈現(xiàn)出急速下降的趨勢，在貯藏10 d后花青素保留率最低，僅為26.03%。通過顯著性分析，在4和25 ℃貯藏條件下，二者的花青素保存率無顯著性差異；而在45 ℃時(shí)桑葚酒中花青素保留率與前二者有顯著差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，桑葚酒在4和25 ℃溫度下花青素保留率明顯高于45 ℃，從花青素含量的角度考慮，桑葚酒更適宜于在冷藏及常溫條件下貯藏。

圖3 桑葚酒花青素保留率變化曲線

2.4 貯藏過程中桑葚酒羥自由基清除率的變化

如圖4所示，在4，25和45 ℃的貯藏條件下桑葚酒羥自由基清除率呈現(xiàn)出不斷波動的趨勢，波動范圍在89.37%～100%之間。通過顯著性分析，在4和25 ℃貯藏條件下，二者的羥自由基清除率無顯著性差異；而45 ℃時(shí)其羥自由基清除率與前二者均有顯著性差異。結(jié)果表明，桑葚酒在4和25 ℃貯藏溫度下羥自由基清除率高于45 ℃，但在45 ℃的溫度下，桑葚酒中抗氧化活性成分的羥自由基清除率雖下滑趨勢明顯，但仍處于90%左右的較高水平。在低溫貯藏條件下，桑葚酒的抗氧化穩(wěn)定性更強(qiáng)。

圖4 桑葚酒羥自由基清除率變化曲線

2.5 熱處理過程中花青素保留率的變化

2.5.1 熱處理過程中桑葚酒中花青素保留率變化曲線

根據(jù)圖5所示，桑葚酒在熱處理溫度為60，70和80 ℃條件下，花青素保留率均呈現(xiàn)出逐步下降的趨勢，經(jīng)過5 h熱處理后其花青素保留率分別為78.33%，72.00%和57.68%。熱處理溫度越高，處理時(shí)間越長，桑葚酒中花青素保留率越低。通過顯著性差異分析可知，熱處理溫度為60，70和80 ℃時(shí)花青素保留率均有顯著性差異。

圖5 桑葚酒熱處理花青素保留率變化曲線

2.5.2 熱降解動力學(xué)解析

在恒溫加熱的條件下，花青素的降解遵循一級降解動力學(xué)模型[14,22-24]。一級降解動力學(xué)模型的參數(shù)速率常數(shù)（k）、半衰期（t1/2）、活化能（Ea）和溫度系數(shù)（Q10）按式（1）～（4）計(jì)算。

式中：Ct為在時(shí)間t（h）時(shí)的花青素保留率，%；C0為花青素最初時(shí)的保留率，即100%；R為摩爾氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；T為絕對溫度，K。

由圖6可知，桑葚酒花青素保留率-lnCt/C0與熱處理時(shí)間t之間呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.98，說明桑葚酒中花青素的熱降解反應(yīng)符合一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律，動力學(xué)方程為t=（lnC0-lnCt）/[（1.71×105）×EXP（-5 014.43/T）。

圖6 桑葚酒花青素在熱處理過程中-ln(Ct/C0)與加熱時(shí)間的關(guān)系

不同熱處理溫度下桑葚酒花青素?zé)峤到馑俾食?shù)k、半衰期t1/2、活化能Ea及溫度系數(shù)Q10的數(shù)值見表1。結(jié)果表明，熱處理溫度對桑葚酒花青素的穩(wěn)定性有較大的影響，隨著熱處理溫度的升高，花青素降解的速率常數(shù)k隨之上升，而半衰期t1/2隨之下降。據(jù)報(bào)道，原榨血橙果汁中花青素的t1/2在70，80和90 ℃溫度下分別是8.21，5.33和2.79 h[25]；在80 ℃時(shí)紫甘薯花青素的t1/2為96.3 h[14]。通過比較發(fā)現(xiàn)，桑葚酒花青素在熱加工處理時(shí)其t1/2比血橙花青素略高，但遠(yuǎn)低于紫甘薯花青素。溫度系數(shù)Q10在60～70 ℃為1.36，在70～80 ℃為1.73，仍呈現(xiàn)出上漲的趨勢，表明隨著熱處理溫度的繼續(xù)上升，桑葚酒中花青素降解速率會變得更快。

表1 桑葚酒花色苷熱降解動力學(xué)常數(shù)

3 結(jié)論與討論

關(guān)于確定桑葚酒的最佳貯藏溫度，試驗(yàn)從四個(gè)維度（總酚含量、總黃酮含量、花青素保留率和羥基自由基清除率）來考慮：（1）從總酚含量的角度，桑葚酒在常溫25 ℃的溫度下總酚含量較高且比較穩(wěn)定；（2）從總黃酮含量的角度，桑葚酒在三個(gè)貯藏溫度下波動幅度均較高，但在25 ℃貯藏溫度下總黃酮的含量要明顯高于其他兩個(gè)溫度；（3）從花青素保留率的角度，桑葚酒在4和25 ℃條件下花青素保留率相近且無顯著差異，均遠(yuǎn)高于45 ℃時(shí)的保留率；（4）從對羥基自由基清除率的角度，桑葚酒波動幅度均較小，其中在4與25 ℃的貯藏溫度下無顯著性差異。綜合以上四個(gè)指標(biāo)可以得出初步判定，桑葚酒的最佳貯藏溫度為25 ℃，可使桑葚酒中的多酚類物質(zhì)含量損失得最少。在對桑葚酒進(jìn)行熱處理的過程中，可以看出桑葚酒中花青素的保留率都是隨著熱處理溫度的升高以及加熱時(shí)間的延長而減少。通過對桑葚酒熱降解動力學(xué)模型的分析可得出桑葚酒熱降解符合一級反應(yīng)規(guī)律，動力學(xué)方程為t=（lnC0-lnCt）/[（1.71×105）×EXP（-5 014.43/T）。

此次試驗(yàn)對桑葚酒最佳貯藏溫度的確定及熱處理時(shí)花青素保留率的變化情況進(jìn)行了研究，雖取得一些突破但也有很多需要繼續(xù)完善的地方，比如貯藏及熱處理溫度可以更加豐富、桑葚制品可以不局限于桑葚酒等。希望此研究能對桑葚酒的貯藏提供理論依據(jù)，為延長其貨架期做出貢獻(xiàn)。