超高壓提取青錢柳多糖條件優(yōu)化及抗氧化活性

李彥坡，鄒盈，李群和，王羅其，鄭曉杰*

溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（溫州 325006）

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja）又名搖錢樹，是我國特有的珍稀植物，廣泛分布于浙江、江西、湖南、湖北等海拔為400～1 800 m的濕潤山地常綠林中。青錢柳葉味甘甜，具有清熱消腫、止痛等功效，多項研究表明，青錢柳葉具有降血糖、降血壓、降血脂等生物活性，被民間稱為“降糖神茶”[1-3]。青錢柳多糖被認為是青錢柳葉中主要有效成分之一，已報道的文獻中，青錢柳多糖提取主要為水提法[4-6]、微波法[7]與超聲波輔助提取法[8-9]，采用超聲波、微波、酶等方法輔助提取，可縮短提取時間，提高產(chǎn)品得率。常規(guī)提取方法易破壞有效成分的生物活性，提取時間長，而采用低溫浸泡則溶媒用量大、耗時長、回收成本高[10]。超高壓提取技術(shù)在有效成分提取方面具有許多獨特優(yōu)勢，如提取率高、耗時、耗能少，產(chǎn)物活性高，并且在密閉環(huán)境下進行，沒有溶劑揮發(fā)，不會對環(huán)境造成污染，符合綠色環(huán)保要求，對多糖結(jié)構(gòu)基本無影響。相對于傳統(tǒng)熱水提取，超高壓提取可明顯提高多糖的提取率，可較大程度保留多糖活性[11-13]。超高壓提取青錢柳多糖的報道較少[14]，對于超高壓提取工藝及其對多糖的結(jié)構(gòu)和活性的影響仍鮮見報道。試驗應(yīng)用超高壓提取青錢柳葉多糖，獲得其最優(yōu)工藝，并測定青錢柳粗多糖抗氧化活性，以期為青錢柳多糖提取研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

青錢柳干葉（文成縣圣山食品開發(fā)有限公司）。

1.1.2 試劑

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；葡萄糖、石油醚、無水乙醇、苯酚、純硫酸、抗壞血酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸（均為國產(chǎn)分析純）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

YB-600A型高速多功能粉碎機（永康速鋒工貿(mào)有限公司）；5 L型超高壓設(shè)備（溫州濱一機械廠）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；TGL-16M離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 青錢柳多糖超高壓提取工藝

干燥的青錢柳葉粉碎，過40目篩。按料液比1︰10（g/mL）的比例加入石油醚（沸程60～90 ℃），回流1 h脫脂，脫脂后過濾，濾渣烘干進行后續(xù)試驗。按料液比1︰3（g/mL）加入無水乙醇，在80 ℃水浴中加熱回流，以除去小分子醇溶物，過濾，所得濾渣干燥備用。將脫脂脫醇溶物后青錢柳粉末按一定料液比裝入聚乙烯復(fù)合袋中，排除空氣密封，置入超高壓裝置中進行超高壓處理，卸壓后過濾，加入3倍體積無水乙醇，以8 000 r/min離心10 min后取上清液，測定青錢柳多糖含量[15-16]。

1.2.2 超高壓提取青錢柳多糖單因素與正交試驗設(shè)計

以青錢柳多糖得率為考察指標，進行超高壓提取青錢柳多糖單因素試驗，研究各因素對超高壓提取效果的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對提取效果影響顯著的因素進行多因素正交試驗，獲得超高壓提取青錢柳多糖最佳工藝參數(shù)。

1) 不同料液比對超高壓提取多糖得率的影響

設(shè)置超高壓提取溫度25 ℃，提取時間30 min，壓力300 MPa，料液比分別為1︰10，1︰15，1︰20，1︰25和1︰30（g/mL）提取青錢柳多糖，提取后過濾，對濾液進行多糖含量測定，研究提取料液比對多糖提取得率的影響。

2) 不同超高壓處理提取時間對青錢柳多糖提取得率的影響

將樣品于超高壓處理溫度25 ℃，壓力300 MPa，料液比1︰20（g/mL）條件下，分別提取30，45，60，90和120 min，處理完成后過濾，測定濾液中多糖含量，研究不同提取時間對多糖提取得率的影響。

3) 不同提取溫度對多糖提取得率的影響

設(shè)定超高壓提取壓力300 MPa，料液比1︰20（g/mL），提取時間60 min，分別在20，30，40，50和60℃溫度下進行提取，提取完成后過濾樣品，測定濾液中青錢柳多糖含量，研究不同提取溫度對多糖提取得率的影響。

4) 不同超高壓處理壓力對多糖提取得率的影響

設(shè)定超高壓提取青錢柳多糖的料液比1︰20（g/mL），提取時間60 min，提取溫度40 ℃，分別在200，300，400，500和600 MPa壓力下進行提取，提取完成后過濾樣品并多糖含量，研究不同提取壓力對多糖提取得率的影響。

5) 正交試驗優(yōu)化超高壓提取工藝條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以提取料液比、溫度及超高壓壓力為因素進行四因素三水平正交試驗設(shè)計（表1），以獲得超高壓提取青錢柳多糖最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.3 青錢柳多糖的測定

1) 標準曲線的繪制

準確稱取干燥恒質(zhì)量的葡萄糖標準品，配制成1 mg/L葡萄糖標準溶液，準確吸取10 mL，用蒸餾水稀釋定容至100 mL，即得100 μg/mL葡萄糖標準溶液。取9支干凈具塞試管按表2方法操作，先在冰水浴中加入0.5 mL的90%，6%苯酚溶液，搖勻后緩慢加入純硫酸，以不放熱或微量放熱為宜，搖勻后恒溫加塞，在沸水中放置20 min，取出涼水冷卻10 min，0號為空白，在最大吸收波長處（490 nm）測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度X為橫坐標（μg/mL），吸光度Y為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線（圖1）[17]。

表2 標準曲線繪制加樣表

圖1 葡萄糖標準曲線

2) 多糖含量測定

預(yù)處理后的青錢柳葉經(jīng)超高壓提取、過濾后定容到200 mL，取2 mL定容后的溶液加入6 mL無水乙醇，以8 000 r/min離心15 min。取沉淀用蒸餾水溶解定容至100 mL。準確吸取該溶液0.5 mL進行顯色，在490 nm下測定其吸光度，根據(jù)所得回歸曲線方程計算多糖得率。

1.2.4 青錢柳多糖抗氧化活性測定

1) DPPH·活性清除

將1 mg/mL樣品溶液用無水乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為2，4，6，8和10 mg/mL溶液。分別取3 mL上述溶液于試管中，加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH·溶液，混勻后避光靜置1 h，在517 nm處測定吸光度（用原溶劑作參比）。同時將3 mL溶劑（無水乙醇）與2 mL 0.2 mmol/L的DPPH·溶液混合，測定其在517 nm處的吸光度。以抗壞血酸為陽性對照，臨用前用去離子水配制成與待測物溶液同等濃度的對照液。蒸餾水做空白對照[17]。

按照式（2）計算不同濃度待測物的DPPH自由基清除率。

式中：Ai為3 mL樣品溶液+2 mL DPPH·溶液；Aj為3 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇；Ac為3 mL無水乙醇+2 mL DPPH·溶液。

2) ·OH清除活性

將待測物用無水乙醇分別稀釋成濃度0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的溶液，取1 mL上述待測物溶液于試管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL，最后加入8 mmol/L的H2O2溶液1 mL以啟動反應(yīng)，37 ℃水浴加熱30 min后終止反應(yīng)，于510 nm測定吸光度。以抗壞血酸為陽性對照，臨用前用去離子水配制成與試驗待測物溶液同等濃度的對照液，蒸餾水做空白對照[18]。

式中：Ax為1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液；Ax0為1 mL樣品溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL無水乙醇；A0為1 mL蒸餾水+1 mL FeSO4溶液+1 mL水楊酸乙醇溶液+1 mL H2O2溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同料液比對超高壓提取多糖得率的影響

固定其他因素不變，采用不同料液比進行超高壓提取青錢柳多糖試驗，研究不同料液比對超高壓提取青錢柳多糖的影響，其結(jié)果如圖2。

隨著料液比增加，青錢柳多糖得率逐漸增大，同時對不同料液比提取青錢柳多糖得率結(jié)果進行方差分析（如表3）可知，不同料液比對青錢柳多糖得率結(jié)果影響顯著，隨著料液比增加，青錢柳多糖多率提高，但考慮到料液比增加給青錢柳多糖分離和后期干燥成本增大，綜合考慮，選取料液比1︰20（g/mL）進行后續(xù)試驗。

2.2 超高壓處理時間對青錢柳多糖提取得率的影響

其他因素不變，改變超高壓條件下青錢柳提取時間，研究不同處理時間對青錢柳多糖提取得率的影響，結(jié)果見圖3。

隨著超高壓保壓提取時間延長，青錢柳多糖提取率呈現(xiàn)出輕微增加趨勢，主要是由于隨著提取時間增加，青錢柳多糖進入提取液中也隨之增加，但從圖3及表4方差分析表中可知，超高壓提取時間的變化對青錢柳多糖提取得率的影響不顯著，這可能是與超高壓提取機制有關(guān)。超高壓提取的主要原理是通過使細胞內(nèi)外滲透壓力突然增大，細胞內(nèi)有效成分穿過細胞轉(zhuǎn)移到細胞外的提取液中，達到提取目的，而時間相對來說影響不大，隨著時間延長，提取率逐漸趨于不變。

圖2 料液比對青錢柳多糖得率的影響

表3 方差分析表

圖3 超高壓提取時間對青錢柳多糖得率的影響

表4 方差分析表

2.3 不同提取溫度對多糖提取得率的影響

控制超高壓處理腔中水的溫度從而達到控制提取溫度的目的。不同提取溫度對青錢柳多糖提取得率的影響結(jié)果見圖4。

隨著提取溫度升高，青錢柳多糖得率有先提高后降低趨勢，提取溫度40 ℃時，青錢柳多糖的提取得率最高。對單因素試驗結(jié)果進行方差分析可知，提取溫度對青錢柳多糖提取率影響顯著，高溫提取反而不利于青錢柳多糖溶出。

圖4 提取溫度對青錢柳多糖得率的影響

表5 方差分析表

2.4 超高壓提取壓力對青錢柳多糖提取得率的影響

不同超高壓處理壓力對青錢柳多糖提取得率的影響結(jié)果見圖5。

壓力是超高壓提取過程中的重要影響因素，表6方差分析可證明壓力對青錢柳多糖提取得率影響顯著。由圖5可知，隨著處理壓力升高，青錢柳多糖的提取率逐漸升高，至500 MPa時提取得率最高，而隨后變化不大。

圖5 提取壓力對青錢柳多糖提取得率的影響

表6 方差分析表

2.5 正交試驗優(yōu)化超高壓提取工藝條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果及單因素試驗方差分析，剔除對青錢柳多糖得率影響不顯著的因素，確定以提取液料比、提取溫度及超高壓壓力進行四因素三水平的正交試驗，獲得超高壓提取青錢柳多糖最佳工藝參數(shù)。正交試驗結(jié)果如表7。

正交試驗可知，青錢柳提取多糖的最佳工藝為A3B1C2，即最佳提取工藝參數(shù)為：料液比1︰25（g/mL），溫度30 ℃，提取壓力500 MPa。在此最佳條件下，青錢柳多糖得率為3.70%。

表7 超高壓萃取青錢柳多糖工藝正交試驗結(jié)果

2.6 抗氧化活性測定結(jié)果

2.6.1 DPPH·清除活性測定結(jié)果

DPPH·具有單一電子，所以能接受一個電子或氫離子，其乙醇溶液呈紫色，在波長517 nm下具有最大吸收。自由基清除劑存在時，DPPH·單電子被配對從而吸收消失或減弱，顏色從紫色逐漸變成黃色，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度計進行快速定量分析，間接評價該自由基清除劑活性?？寡趸芰τ们宄时硎荆宄试酱?，抗氧化能力越強。體外測定的青錢柳多糖對DPPH·清除效果見圖6青錢柳多糖對自由基的清除能力，可看出青錢柳多糖的清除DPPH自由基活性總體上小于陽性對照VC，但其清除DPPH自由基活性隨樣品濃度增加而增大，青錢柳質(zhì)量濃度從16.125 μg/mL增加到250 μg/mL時，其清除DPPH自由基能力迅速增加，達到93%，但與VC清除率仍有差距（99.9%）。青錢柳多糖對DPPH·清除效果與吳菲菲等、應(yīng)瑞峰等和葛霞等研究結(jié)果一致[19-22]，但通過比較其提取的青錢柳多糖的清除自由基能力，相對于超聲波提取及水提醇沉及沸水浴等方法提取青錢柳多糖，超高壓提取的青錢柳粗多糖的DPPH·清除能力93%比超聲波提取的青錢柳多糖清除能力更強，青錢柳多糖濃度更低，這與超高壓提取技術(shù)的低溫、短時、對多糖活性破壞小等優(yōu)點相關(guān)。

2.6.2 ·OH清除活性測定結(jié)果

和其他自由基相比，羥自由基是體內(nèi)最活躍的活性氧自由基，產(chǎn)生于生命活動的氧化代謝過程，可使氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪類和核酸等大分子發(fā)生氧化損傷，誘導(dǎo)細胞凋亡或使轉(zhuǎn)化細胞脫離正常細胞的控制無限生長而癌變，由圖7可以看出，青錢柳多糖對羥自由基有一定清除活性，最高清除率是50.3%。維生素C質(zhì)量濃度在0.4～1.0 mg/mL時，清除活性均在90%以上，由此看出青錢柳多糖的清除羥自由基的能力遠遠小于陽性對照維生素C。這與吳菲菲等、葛霞等和胡紅忠[19,21-22]的研究結(jié)果一致，而相對于不同提取方法，超高壓提取則沒有表現(xiàn)出明顯區(qū)別。

圖6 青錢柳多糖對DPPH自由基的清除能力

圖7 青錢柳多糖對羥自由基的清除活性

3 結(jié)論

通過單因素與正交試驗獲得最優(yōu)超高壓提取青錢柳多糖工藝參數(shù)，同時對得到青錢柳多糖進行抗氧化活性測定，結(jié)果表明，青錢柳多糖最佳提取條件為料液比1︰25（g/mL），提取溫度30 ℃，提取壓力500 MPa，此時得率最高，為3.70%。超高壓提取的青錢柳葉多糖具有一定抗氧化能力，對DPPH自由基有較好清除作用，且相對于其他提取方式，其活性較高這為青錢柳多糖的高效、高活性提取提供參考，但超高壓提取對青錢柳多糖的具體成分變化尚不清楚，有待進一步研究。