溶劑和微乳化的稀釋效應(yīng)對(duì)食用植物精油抗菌活性的影響

崔綺嫦 吳克剛 莫镕弛 段雪娟

（1 廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院 廣州510006 2 佛山中紡聯(lián)檢驗(yàn)技術(shù)服務(wù)有限公司 廣東佛山528211 3 廣州市香思馨情健康科技有限公司 廣州510006 4 廣州市藍(lán)海人才服務(wù)有限公司 廣州510030）

許多食用香辛料的精油具有良好的抗菌活性、高安全性、低毒副性等優(yōu)點(diǎn)，可用來(lái)開(kāi)發(fā)為天然防腐劑。然而，一些存在于食品體系中的因素，如水分活度、脂肪含量、蛋白質(zhì)、pH 和酶類(lèi)會(huì)對(duì)植物精油的抗菌活性造成影響[1-2]。當(dāng)植物精油作為防腐劑添加到食品體系中時(shí)，所需植物精油的濃度要比體外抑菌試驗(yàn)的高出1%～3%，超出感官可接受范圍[3]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因，可能是因?yàn)槭称敷w系中富含的脂肪或蛋白質(zhì)對(duì)被損壞的菌體具有修復(fù)作用，從而降低了植物精油的抑菌效果。其次，食品中水分活度較高時(shí)，會(huì)降低植物精油的溶解性能和穩(wěn)定性，使其抗菌效果減弱。另外，一些外界因素，如包裝類(lèi)型和環(huán)境溫度也會(huì)影響微生物對(duì)植物精油的敏感度[1-2]。采用包埋技術(shù)為植物精油提供運(yùn)輸載體十分必要。許多包埋技術(shù)，如微乳液、微膠囊、溶劑等載體可改善植物精油的揮發(fā)性和水溶性，降低外界環(huán)境對(duì)其抗菌活性的影響，減少對(duì)食品質(zhì)構(gòu)與感官的影響。有研究表明微乳化可有效提高植物精油的抗菌活性，有效延長(zhǎng)抗菌作用的時(shí)間[4-5]。本文通過(guò)溶劑、乳化兩種稀釋載體“加工”植物精油復(fù)合物（牛至∶百里香=1 ∶1[6]），以提高其水相溶解性能，對(duì)其質(zhì)量及穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，探究稀釋載體對(duì)植物精油抗菌活性的影響，以擴(kuò)大食用植物精油作為防腐保鮮劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis）ATCC 6633、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）ATCC 25923、釀酒酵母菌 （Saccharomyces cerevisiae）GIM 2.207、黃曲霉 （Aspergillus flavus）ATCC 9643、黑曲霉 （Aspergillus niger）ATCC 16404、桔青霉（Penicillium citrinum）ATCC 9849，購(gòu)自廣東省微生物研究所。

食用復(fù)合植物精油（主要成分為牛至精油、百里香精油）、香芹酚（95%）、百里香酚均為食用級(jí)，由廣東香飄三創(chuàng)（產(chǎn)學(xué)研）眾創(chuàng)平臺(tái)提供。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、霉菌液體培養(yǎng)基，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；無(wú)水乙醇，1，2-丙二醇、丙三醇、Tween80 均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶劑對(duì)食用植物精油抗菌活性的影響

1.2.1.1 菌種活化和菌懸液/孢子懸液的制備 參照吳克剛等[6]的方法。

1.2.1.2 植物精油溶解性能的測(cè)定 無(wú)水乙醇、1，2-丙二醇、丙三醇各2 mL，分別加入等量的植物精油復(fù)合物（牛至∶百里香=1 ∶1），振蕩混合，室溫靜置24 h，觀察是否混濁。

1.2.1.3 溶劑對(duì)植物精油抗菌活性的影響 參照吳克剛等[6]的方法測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。無(wú)水乙醇、1，2-丙二醇、丙三醇作溶劑，稀釋制得10%植物精油復(fù)合物（牛至∶百里香=1 ∶1），在5 mL 肉湯中加入100 μL 菌懸液，添加適量的10%植物精油復(fù)合物使其在肉湯中質(zhì)量濃度為31.25～500 μL/L，等量的溶劑作對(duì)照，置恒溫振蕩器中培養(yǎng)，觀察肉湯渾濁情況。

1.2.2 微乳體系的質(zhì)量評(píng)價(jià)及其對(duì)植物精油抗菌活性的影響

1.2.2.1 滴定法構(gòu)建植物精油微乳液擬三元相圖[7-8]植物精油復(fù)合物（牛至∶百里香=1∶1）為油相（O）、Tween80 為表面活性劑、無(wú)水乙醇為助表面活性劑，按照表面活性劑與助表面活性劑的配比（Km=2 ∶1，3 ∶1），準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的Tween80 和無(wú)水乙醇于存儲(chǔ)瓶中，40 ℃恒溫?cái)嚢?0 min 制備不同Km值下的混合表面活性劑（Smix）；根據(jù)混合表面活性劑（Smix）與油相（O）的質(zhì)量比9∶1～1∶9，準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的混合表面活性劑和植物精油復(fù)合物置于存儲(chǔ)瓶，40 ℃恒溫?cái)嚢韬筮叺渭油葴囟鹊娜ルx子水（W）邊攪拌，肉眼觀察，如形成流動(dòng)性好、半透明且呈淡藍(lán)色乳光的溶液時(shí)即為微乳。記錄臨界點(diǎn)時(shí)去離子水（W）的添加量，計(jì)算各組分在該臨界點(diǎn)時(shí)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)；Origin8.5 繪制微乳液的擬三元相圖，AutoCAD 軟件計(jì)算各微乳區(qū)域的面積，以確定制備微乳液的最佳Km值。

1.2.2.2 植物精油微乳液的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1）微乳液構(gòu)型的鑒定 參照王浩[8]的方法，利用電導(dǎo)率儀測(cè)定微乳液經(jīng)水稀釋過(guò)程中的電導(dǎo)率變化。

2）微乳液的外觀、溶液顏色與澄清度檢測(cè)根據(jù)《中國(guó)藥典》（2010年版）[9]II 部附錄IXA 溶液顏色檢查法與IXB 澄清度檢查法對(duì)微乳液的顏色和澄清度進(jìn)行檢查。

3）比重瓶法測(cè)定密度 根據(jù)GBT 5009.2-2003 食品的相對(duì)密度的測(cè)定[10]對(duì)微乳液的密度進(jìn)行檢查。

4）微乳液理化參數(shù)的測(cè)定 采用美國(guó)Brookhaven 公司Zeta 電位及粒度分析儀對(duì)所選微乳液配方的粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）及Zeta 電位（zeta potential，ZP）進(jìn)行分析；雷磁PHS-3C 型pH 計(jì)測(cè)定微乳液的pH 值；NDJ-1 旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)測(cè)定微乳液的黏度。

5）微乳液中香芹酚及百里香酚含量的檢測(cè)采用紫外分光光度法對(duì)微乳液中的香芹酚及百里香酚含量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2.3 植物精油微乳液的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)與抗菌活性檢測(cè)

1）鹽/甜味劑對(duì)微乳液穩(wěn)定性的影響 取適量微乳液于試管中，添加一定量的NaCl/蔗糖/果葡糖漿使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～5%，混合后經(jīng)4 000 r/min 離心20 min 觀察體系是否分層。

2）pH 對(duì)微乳液穩(wěn)定性的影響 選 擇0.1 mol/L 檸檬酸溶液與0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液調(diào)節(jié)微乳液的pH 值為3～8，室溫靜置30 min后離心觀察體系是否分層。

3）微乳液的貯藏穩(wěn)定性 將微乳液樣品置于28 ℃下儲(chǔ)存，每月取樣測(cè)定其粒徑變化，離心觀察體系是否分層；將微乳液樣品置于4 ℃下儲(chǔ)藏，每隔10 d 取樣測(cè)定其粒徑變化，離心觀察體系是否分層。

4）植物精油微乳液抗菌活性的檢測(cè) 參考1.2.1.3節(jié)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析 每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，試驗(yàn)結(jié)果表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；采用SPSS 18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（F檢驗(yàn)）。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物精油的溶解性能

分別探究植物精油復(fù)合物在不同溶劑中的溶解情況，結(jié)果見(jiàn)表1。植物精油在無(wú)水乙醇中可以完全溶解，而在1，2-丙二醇及丙三醇中只能部分溶解或不溶解，這現(xiàn)象與溶劑自身性質(zhì)有關(guān)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)中含羥基數(shù)越多，其親水性和極性越強(qiáng)，而植物精油的主要成分是萜烯類(lèi)化合物（（C5H8）n），不溶或微溶于水，具有親脂性。無(wú)水乙醇含有一個(gè)羥基，具有良好的親水性，極性弱；而1，2-丙二醇和丙三醇分別含有2 個(gè)和3 個(gè)羥基，具有較強(qiáng)的親水性，極性強(qiáng)。

表1 牛至-百里香復(fù)合物在溶劑中的溶解情況Table 1 Dissolution of the thyme-oregano compound in different solvents

2.2 溶劑對(duì)植物精油水相抗菌活性的影響

為了解溶劑對(duì)植物精油復(fù)合物抗菌效果的影響，通過(guò)測(cè)定其對(duì)食品常見(jiàn)腐敗微生物的MIC 和MBC 進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 溶劑對(duì)牛至-百里香復(fù)合物抗菌活性的影響（μL/L）Table 2 Effect of solvent on the antibacterial activity of the thyme-oregano compound （μL/L）

根據(jù)表2的色塊深淺，從綜合抗菌效果來(lái)看，1，2-丙二醇作溶劑時(shí)能有效提高植物精油復(fù)合物的抗菌效果，MIC 值和MBC 值均為最低。一種物質(zhì)的液相抗菌效果取決于其自身的抗菌活性、揮發(fā)性及水溶性。無(wú)水乙醇易溶于水、易揮發(fā)，自身具有一定抗菌性，但其促揮發(fā)性會(huì)降低植物精油的溶解度，從而影響抗菌效果。1，2-丙二醇和丙三醇均易溶于水、不揮發(fā)、自身無(wú)抗菌性，但1，2-丙二醇更易溶解植物精油，且其不揮發(fā)性也抑制了精油的揮發(fā)性，促進(jìn)精油的水溶性，從而提高精油抗菌效果。

2.3 植物精油微乳液體系的優(yōu)化

2.3.1 表面活性劑與助表面活性劑配比 （Km值）對(duì)相圖的影響 在微乳液擬三元相圖中，微乳區(qū)域面積反映了油相的增溶量，最小可稀釋比（DR）反映了制備可稀釋型微乳液時(shí)表面活性劑的最小用量[7]。從圖1可知，以微乳區(qū)域面積為指標(biāo)，當(dāng)Km=3∶1 時(shí)，所形成的微乳區(qū)面積（29.55%）比Km=2∶1 時(shí)的微乳區(qū)面積（27.13%）略大一些，最小可稀釋比（DR 值）為9∶1，其對(duì)應(yīng)的表面活性劑和植物精油間質(zhì)量比（S/O）為6.76 ∶1。Trotta 等[11]認(rèn)為微乳液區(qū)域面積大小與Km值密切相關(guān)。王浩[8]的研究也發(fā)現(xiàn)Km值較低時(shí)，相對(duì)濃度較高的助表面活性劑會(huì)減弱表面活性劑與水相的結(jié)合能力，微乳區(qū)域面積相對(duì)減少；而Km值較高時(shí)，相對(duì)濃度較高的表面活性劑因缺乏助表面活性劑的助乳化作用而導(dǎo)致自乳化能力下降，微乳區(qū)域面積也相對(duì)減少。

圖1 不同Km 值下微乳液的擬三元相圖Fig.1 Pseudoternary phase diagram of microemulsions with different Km

2.3.2 電導(dǎo)率法鑒定微乳液構(gòu)型 根據(jù)Fang 等[8]的滲透理論，見(jiàn)圖2，當(dāng)水分含量低于56%時(shí)為W/O 型微乳液；當(dāng)水分含量高于66%～68%時(shí)為O/W 型微乳液；當(dāng)水分含量介于兩者間時(shí)為B.C.型微乳液。試驗(yàn)結(jié)果與王浩[8]的報(bào)道相近。

2.3.3 確定微乳液的配方 Km值為3 時(shí)，所形成的微乳液區(qū)域面積最大，該比例更適合制備可稀釋型植物精油微乳液。選擇圖1（b）微乳區(qū)內(nèi)、區(qū)外、稀釋線T91 上3 個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的配方進(jìn)行后續(xù)研究，各配方其組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見(jiàn)圖3。

圖2 不同Km 值的微乳液電導(dǎo)率圖（（Tween80+乙醇）∶精油=9∶1）Fig.2 Variation of electrical conductivity with water content for microemulsions with different Km

圖3 不同微乳液配方的組成Fig.3 Composition of different formulations on microemulsion

2.4 植物精油微乳液的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.4.1 微乳液的外觀、溶液顏色與澄清度 所制的植物精油微乳液在自然光下為淡黃、透明均一液體，去離子水稀釋100 倍后呈淡藍(lán)色乳光，見(jiàn)圖4，符合《中國(guó)藥典》對(duì)顏色和澄清度的標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 植物精油微乳液的外觀Fig.4 Performance of the mixed essential oils microemulsion

2.4.2 微乳液的理化參數(shù) 不同配方微乳的密度與水接近（表3），黏度適中，體系為偏酸性，符合殺菌劑的質(zhì)量要求。Shakeel F 等[13-14]的研究指出微乳液的Zeta 電位絕對(duì)值為30 mV 時(shí)表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性。配方F3 的Zeta 電位最低（-22.23 mV±0.24 mV），數(shù)值接近30 mV，說(shuō)明其具有良好穩(wěn)定性；且其粒 徑（13.0 nm ± 0.6 nm）和PDI 值（0.231 ± 0.020）均為最小，表明該配方的粒徑分布更集中，粒徑大小均一。

表3 植物精油微乳液的理化參數(shù)Table 3 The physicochemical parameters of the mixed essential oils microemulsion

2.4.3 微乳液的理化參數(shù) 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品、精油進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（圖5），發(fā)現(xiàn)均在276 nm 處有一個(gè)明顯的吸收峰，而無(wú)水乙醇和微乳液其它成分在此處吸收甚少，與文獻(xiàn)報(bào)道的相近[15]。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度A（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線，經(jīng)回歸后，百里香酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0178x+0.002，R2=0.9993；香芹酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0149x+0.0104，R2=0.9991，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線方程在10.5～94.5 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系（圖6）。

植物精油微乳液稀釋1 000 倍后，在276 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（表4）。F1、F2、F3 配方含植物精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.57%，2.55%，2.57%，以百里香酚濃度反映3 個(gè)配方微乳液中所含植物精油的量，發(fā)現(xiàn)配方F1 含百里香酚量最多（19.48 mg/mL），配方F3 次之，這與制備微乳液時(shí)所添加植物精油的量對(duì)應(yīng)，說(shuō)明以Tween80 為表面活性劑制備微乳液，能較好地保留其主要化學(xué)成分，減弱氧化揮發(fā)性，提高植物精油水溶性。

2.5 植物精油微乳液的穩(wěn)定性、抗菌活性評(píng)價(jià)

2.5.1 介質(zhì)環(huán)境的影響 一般食品體系在實(shí)際應(yīng)用中都加有一定量的電解質(zhì)與一些食品添加劑，因此改變體系的介質(zhì)環(huán)境，探究其對(duì)微乳液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖5 各標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收曲線圖Fig.5 UV absorption curve of the standard products

圖6 百里香酚和香芹酚的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 UV standard curves figure of thymol and carvacrol

表4 不同植物精油微乳液配方的吸光度Table 4 Absorbance of different formula of the mixed essential oils microemulsion

圖7 介質(zhì)環(huán)境對(duì)植物精油微乳液穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of medium environment on the stability of the mixed essential oils microemulsion

微乳液體系中加入適量無(wú)機(jī)電解質(zhì)，經(jīng)靜置其仍能保持半透明/透明狀態(tài)，說(shuō)明該微乳液具有一定的抗鹽能力。這是因?yàn)闊o(wú)機(jī)電解質(zhì)對(duì)非離子型表面活性劑的疏水基具有“鹽析”作用[16]。電解質(zhì)的加入會(huì)破壞水相中的氫鍵，降低Tween80 的“濁度”和臨界膠束濃度，增加膠團(tuán)聚集數(shù)，利于締結(jié)形成大膠團(tuán)，達(dá)到一定程度便會(huì)出現(xiàn)渾濁分層現(xiàn)象。此外，界面膜的耗損也能引起“鹽析”作用[17]。

改變微乳液體系pH 值，經(jīng)靜置其仍保持透明狀態(tài)，說(shuō)明該微乳液具有良好抗酸堿性。因?yàn)榉请x子型表面活性劑所形成乳液的膜結(jié)構(gòu)主要是靠氧乙烯鏈組成，其膜性質(zhì)變化取決于氧乙烯基團(tuán)上的氧與其它化合物間的締合作用[18]，受H+濃度的影響較小。

2.5.2 貯藏穩(wěn)定性 粒徑是表征微乳液穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)。從圖8可知，配方F3 在試驗(yàn)溫度與時(shí)間范圍內(nèi)其粒徑變化均較為平緩，離心后未出現(xiàn)相分離現(xiàn)象，說(shuō)明該配方在短時(shí)低溫冷藏及長(zhǎng)時(shí)常溫貯藏下均具有良好的穩(wěn)定性，這可能與該配方具有較低的PDI 值和適宜的Zeta 電位密切相關(guān)。配方F2 對(duì)應(yīng)的點(diǎn)位于微乳區(qū)的有效稀釋線T91 上，能被水無(wú)限性稀釋?zhuān)虼似淞诫S著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)變化也甚微。

圖8 不同貯藏溫度下植物精油微乳液的粒徑變化Fig.8 The change of particle diameter of the mixed essential oils microemulsion under different storage temperature

2.5.3 植物精油微乳液的抗菌活性研究 結(jié)合食品工業(yè)安全應(yīng)用，本試驗(yàn)選擇了配方F2 進(jìn)行抗菌試驗(yàn)，以了解微乳液對(duì)植物精油復(fù)合物的抗菌效果，結(jié)果見(jiàn)表5。由Tween80 形成的植物精油微乳液其MIC 值在香辛料應(yīng)用于食品中最大允許添加量0.2%范圍內(nèi)未表現(xiàn)出抗菌活性，該試驗(yàn)現(xiàn)象與一些研究者[8，19-20]的報(bào)道相似，這可能是因?yàn)槲⑷橐喊耋w系對(duì)植物精油的抗菌效果產(chǎn)生了負(fù)面影響。

表5 微乳液對(duì)植物精油復(fù)合物MIC 值的影響（μL/L）Table 5 Effect of the microemulsion on minimum inhibitory concentration （MIC）value of the mixed essential oils compound （μL/L）

對(duì)于O/W 型微乳液體系，水為連續(xù)相，將植物精油包埋在疏水性膠束核內(nèi)，植物精油需從膠束內(nèi)釋放并穿過(guò)水相后才能作用于菌體細(xì)胞壁[21]。而SYLVIA GAYSINSKY 等[22]認(rèn)為微乳液抗菌效果的差異性主要是因?yàn)槟z束粒徑大小、膠束的結(jié)構(gòu)及膠束與植物精油成分間的相互作用。根據(jù)植物精油可溶性成分與表面活性劑的極性頭和非極性尾的相互作用，植物精油抗菌成分（游離的羥基基團(tuán)）可位于膠束內(nèi)部或膠束表面附近[22]，因此，該基團(tuán)在納米膠束表面的可利用性對(duì)其抗菌性能具有十分重要的作用。Donsi 等[23]卻認(rèn)為乳液的抗菌性能與液滴粒徑大小無(wú)關(guān)，與被乳化的抗菌成分水相平衡濃度有關(guān)。Ferreira J.P 等[20]認(rèn)為表面活性劑、助表面活性劑的種類(lèi)也與微乳液抗菌效果的差異性有關(guān)，如油酸乙酯、磷酸三丁酯等[20]作為微乳體系組成成分，均具有一定抗菌性，對(duì)微乳液整體抗菌效果具有協(xié)同增效作用。

3 結(jié)論

植物精油復(fù)合物（牛至∶百里香=1 ∶1）具有良好抗菌活性，但存在易揮發(fā)、水溶性差、異味大等缺點(diǎn)，本研究通過(guò)構(gòu)建食品級(jí)稀釋體系，解決了植物精油復(fù)合物（牛至∶百里香=1 ∶1）的易揮發(fā)、水溶性差問(wèn)題，且具備良好的耐酸、耐堿、耐鹽、耐儲(chǔ)藏性，但所制備的食品級(jí)植物精油微乳體系其抗菌活性并未如期表現(xiàn)出協(xié)同增效作用，反而特性大大減弱，超過(guò)了香辛料應(yīng)用于食品中0.2%最大允許添加范圍，因此進(jìn)一步對(duì)微乳體系的微觀結(jié)構(gòu)及其抗菌作用機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)性探索，有利于解決植物精油乳化體系作為“高效、安全、廣譜”的無(wú)防保鮮劑在食品領(lǐng)域中應(yīng)用的瓶頸。