熱處理對魚鱗蛋白酶解特性的影響

涂 丹 張益奇，2，3 林亞楠 葉 繁 戴志遠(yuǎn)，2，3*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310035 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310035 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連116000）

我國水產(chǎn)品資源豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)6 457.66 萬t[1]。水產(chǎn)品加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的魚皮、魚鱗、魚骨等下腳料。其中，魚鱗占到魚體重的1%～5%，含有豐富的膠原蛋白，然而未得到很好的開發(fā)利用，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

膠原蛋白通常具有天然的三股螺旋結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)有很強(qiáng)的剛性，對蛋白酶有很強(qiáng)的抵抗力。目前，國內(nèi)外對魚源膠原蛋白資源的研究熱度逐年增加，主要集中于魚源膠原蛋白/明膠的提取及其性質(zhì)研究[2-3]、酶解工藝優(yōu)化[4]及其酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)研究[5]等方面。前人研究發(fā)現(xiàn)適度熱處理可使得蛋白質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)柔性化，從而形成利于提取或酶解的解離狀態(tài)。如Yang 等[6-7]研究了高溫條件下制備羅非魚皮明膠水解液；Min 等[8]研究發(fā)現(xiàn)水熱處理（150～250 ℃）可用于生產(chǎn)豬皮副產(chǎn)物蛋白質(zhì)水解物；王彥蓉等[9]研究了高溫處理下羅非魚皮魚鱗混合物的酶解特性；沙小梅等[10]采用高溫水對魚骨進(jìn)行軟化處理。相比于魚皮，魚鱗結(jié)構(gòu)更為致密，其豐富的I 型膠原主要分布在魚鱗內(nèi)層，外層被羥基磷灰石覆蓋，這些抗性屏障使得魚鱗難以被降解，通常需要加大酶使用量（6%左右）[11-12]或采用分步酶解方式[13]制備膠原蛋白肽。為獲得魚鱗蛋白多肽，有必要對魚鱗進(jìn)行適當(dāng)?shù)臒崽幚?，探索其對魚鱗蛋白溶出及酶解特性的影響。

本研究采用堿性蛋白酶水解羅非魚魚鱗蛋白，以蛋白質(zhì)回收率、水解度、ACE 抑制率為指標(biāo)，研究熱處理溫度、熱處理時(shí)間以及底物濃度對魚鱗蛋白酶解特性的影響，進(jìn)一步探討熱處理?xiàng)l件對魚鱗蛋白及其酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布的影響。本研究旨在得到一種簡單、高效的魚鱗蛋白熱預(yù)處理工藝，不僅能夠減少環(huán)境污染，還可明顯提高魚類副產(chǎn)物資源酶解效率，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

羅非魚魚鱗（蛋白質(zhì)含量55.87%），湛江環(huán)球水產(chǎn)有限公司；堿性蛋白酶Alcalase 3L（酶活力為3.0 AU/g），諾維信公司；馬尿酸（Hippuric acid，HA）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸 （N-hippuryl-His-Leu tetrahydrate，HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin Converting Enzyme from rabbit lung，ACE）、鄰苯二甲醛（OPA）、抑肽酶、細(xì)胞色素C、碳酸酐酶、桿菌肽等均購于Sigma 公司。甲醇、乙腈（色譜純）。

1.2 主要設(shè)備與儀器

400Y 多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；DGG-9123A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DSHZ-300A 旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Fresco 21 冷凍高速離心機(jī)，美國Thermo Fisher 公司；QL-8bb-253 旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；MLS-3781L 高壓滅菌鍋，日本Panasonic 公司；紫外分光光度計(jì)，美國ThermoFisher 公司；e2695 高效液相色譜，美國Waters 公司；K-360 凱氏定氮儀，K-425 快速消解儀，瑞士BUCHI 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚鱗前處理 將新鮮魚鱗用清水沖洗，瀝干，用0.1 N 氫氧化鈉溶液浸泡12 h（料液比為1∶5），除去脂肪、雜蛋白等。用1% HCl 浸泡，料液比為1∶10，攪拌2 h 進(jìn)行脫鈣處理，流水沖洗3 h。

1.3.2 熱處理單因素及酶解方法 熱處理溫度影響：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%魚鱗溶液，分別在60，100，121，135℃條件下加熱處理30min，冷卻后進(jìn)行酶解。

熱處理時(shí)間影響：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%魚鱗溶液，分別在121 ℃條件下加熱處理0，15，30，60，90，120 min，冷卻后進(jìn)行酶解。

底物濃度影響：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，1%，1.5%，2%，3%，4%魚鱗溶液，在121 ℃條件下加熱處理15 min，冷卻后進(jìn)行酶解。

酶解方法：熱處理后冷卻至55 ℃，加入堿性蛋白酶進(jìn)行酶解。酶解條件如下：加酶量（E/S）0.1%、pH 8.0、溫度55 ℃、反應(yīng)時(shí)間120 min。反應(yīng)結(jié)束后沸水浴10 min 滅酶，4 000 g 離心15 min，取上清液，即為魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物。

1.3.3 蛋白質(zhì)回收率的計(jì)算 采用凱氏定氮法測定魚鱗原料以及酶解前后上清液中的蛋白含量。

1.3.4 水解度的測定 樣品的水解度測定采用OPA 法。根據(jù)D.Spellman 等[14]的方法適當(dāng)修改。配制OPA 試劑：將7.620 g 四硼酸鈉和200 mg SDS 用150 mL 去離子水溶解。完全溶解后加入4 mL 溶有160 mg OPA 的乙醇溶液，混勻后再加入176 mg DTT，定容至200 mL。該試劑對光敏感，需現(xiàn)用現(xiàn)配。

測定時(shí)，向加有3 mL OPA 試劑的試管中加入400 μL 樣品（上清液按一定比例稀釋所得），混勻，2 min 后測定其在340 nm 下的吸光度。并以純水代替樣品作為空白組。按同樣的方法，以100 μg/mL 絲氨酸溶液代替樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上清液中游離氨基含量，進(jìn)而計(jì)算水解度。

1.3.5 ACE 抑制率的測定ACE 抑制率根據(jù)Wu[15]的方法修改測定，采用高效液相色譜分析法。用0.1 moL/L 硼酸緩沖液 （pH=8.3，含有0.3 mol/L NaCI）配制反應(yīng)底物HHL （6.5 mmoL/L）及ACE（100 U/L），取適量水解上清液稀釋至40μL，與25 μL 的ACE 溶液混合于1.5 mL 聚乙烯離心管中，振蕩器混勻，37 ℃下水浴保溫10 min，加入40 μL的HHL 溶液啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃下水浴保溫30 min后，加入85 μL 1 mol/L 的HCl 溶液終止反應(yīng)。0.45 μm 濾膜過濾后，通過HPLC 分析測定反應(yīng)中產(chǎn)生的馬尿酸（HA）的量。色譜條件：采用Waters2695HPLC 系統(tǒng)和UV/Vis 檢測器，SunFireC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），上樣量10 μL，檢測波長228 nm，流動(dòng)相為乙腈-0.1% TFA 水溶液（30∶70），流速為0.8 mL/min。ACE 抑制率的計(jì)算公式如下：

其中，A——用純水代替酶解物參與反應(yīng)條件下所產(chǎn)生的HA 的量；B——酶解物參與反應(yīng)的條件下所產(chǎn)生的HA 的量。

1.3.6 相對分子質(zhì)量分布測定 采用凝膠過濾層析法來測定相對分子質(zhì)量分布情況。根據(jù)張燕萍等[16]方法修改。取反應(yīng)上清液適量，0.45 μm 濾膜過濾后上樣分析，色譜條件為：采用Waters2695HPLC 系統(tǒng)和UV/Vis 檢測器，TSKgel G2000-SWxl（7.8 mm×300 mm，Tosoh）色譜柱，檢測波長220 nm，洗脫液為45%乙腈-55%水溶液（0.1% TFA），流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。相對分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為：HHL（429 u）、桿菌肽（1 422 u）、抑肽酶（6.5 ku）、細(xì)胞色素C（12.4 ku）、碳酸酐酶（29 ku）。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），用Duncan 多重比較法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果分析

2.1 熱處理對魚鱗蛋白水解度及蛋白質(zhì)回收率的影響

由圖1a 可知，未經(jīng)熱處理時(shí)，魚鱗蛋白蛋白質(zhì)回收率和水解度分別為4.12%和0.2%，魚鱗蛋白經(jīng)不同高溫處理30 min 后，蛋白回收率和水解度均有顯著提高（P＜0.05）。當(dāng)熱處理溫度由25 ℃升高到121 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)回收率和水解度增大到63.56%。進(jìn)一步升高溫度，蛋白質(zhì)回收率變化不明顯，但水解度進(jìn)一步增大。由圖1b 可知，蛋白回收率和水解度隨處理時(shí)間的延長顯著增大，其中0～15 min 處理二者均快速升高，后上升趨勢變緩。這可能是由于高溫破壞了魚鱗蛋白分子間高級結(jié)構(gòu)，膠原纖維間蛋白質(zhì)分子鏈展開，促進(jìn)魚鱗明膠的溶出與水解。本研究在此基礎(chǔ)上通過單因素試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了不同熱處理?xiàng)l件對魚鱗蛋白酶解特性的影響。

圖1 熱處理溫度（a）和時(shí)間（b）對蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響Fig.1 Effect of heat treatment temperature （a）and time （b）on the protein recovery and degree of hydrolysis

2.2 熱處理對魚鱗蛋白酶解特性的影響

2.2.1 不同處理溫度對水解度及蛋白質(zhì)回收率的影響 由圖2可知，魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物蛋白回收率和水解度在25～121 ℃時(shí)隨溫度升高而快速上升，進(jìn)一步提高溫度，二者變化均不顯著（P＞0.05）。這可能是因?yàn)闊崽幚泶龠M(jìn)了魚鱗明膠的溶出，同時(shí)使蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，暴露出更多的酶切位點(diǎn)，促進(jìn)了蛋白酶的水解作用，從而使魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)回收率和水解度增大。根據(jù)蛋白質(zhì)回收率和水解度隨處理溫度的變化趨勢，綜合實(shí)際生產(chǎn)操作和成本問題，選取121 ℃為最佳的熱處理溫度，此時(shí)蛋白回收率和水解度都相對較高。

2.2.2 不同處理時(shí)間對水解度及蛋白質(zhì)回收率的影響 由圖3可知，高溫處理后魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)回收率和水解度顯著升高 （P＜0.05），其中15 min 條件下其蛋白回收率為64.83%，較未熱處理樣品提高了75.31%，水解度是未熱處理樣品的兩倍。當(dāng)處理時(shí)間大于15 min 時(shí)，水解度變化不明顯（P＞0.05），蛋白質(zhì)回收率緩慢下降。由此可見，魚鱗蛋白蛋白回收率并不會(huì)因熱處理時(shí)間的延長繼續(xù)升高，甚至在高溫和蛋白酶的作用下還會(huì)降低。因此選取15 min 為最佳熱處理時(shí)間。

圖2 熱處理溫度對酶解產(chǎn)物蛋白質(zhì)回收率和水解度的影響Fig.2 Effect of heat treatment temperature on the protein recovery and hydrolysis degree of enzymolysis product

圖3 熱處理時(shí)間對酶解產(chǎn)物蛋白回收率和水解度的影響Fig.3 Effect of heat treatment time on the protein recovery and degree of hydrolysis of enzymolysis product

2.2.3 不同底物濃度對水解度及蛋白質(zhì)回收率的影響 在121 ℃、15 min 熱處理?xiàng)l件下，不同底物濃度（0.5%～4%）魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物的蛋白回收率和水解度如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)低于2%時(shí)，魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物的蛋白回收率和水解度變化不顯著（P＞0.05），隨著底物濃度的進(jìn)一步增大，蛋白回收率和水解度均呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。原因可能是底物濃度過高，整個(gè)反應(yīng)體系過于黏稠，水的有效濃度降低，不利于熱處理時(shí)蛋白的充分溶出，同時(shí)也使蛋白酶與底物蛋白酶切位點(diǎn)碰撞的幾率變小，使得蛋白回收率和水解度下降[17-19]。綜合考慮生產(chǎn)成本和實(shí)際操作問題，選擇2%為最佳的底物濃度，此時(shí)蛋白回收率為65.93%，水解度為10.54%。

圖4 底物濃度對酶解產(chǎn)物蛋白回收率和水解度的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the protein recovery and degree of hydrolysis of enzymolysis product

通過上述單因素試驗(yàn)，獲得熱處理羅非魚魚鱗的較優(yōu)條件為：熱處理溫度121 ℃，處理時(shí)間15 min，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%。

2.3 熱處理對魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物ACE 抑制率的影響

由圖5a 可看出，當(dāng)熱處理溫度為25～121 ℃時(shí)，酶解產(chǎn)物ACE 抑制率隨著處理溫度升高而呈明顯上升趨勢，進(jìn)一步增大處理溫度，ACE 抑制率變化趨勢不明顯 （P>0.05）。從圖5b 能看出，當(dāng)121 ℃熱處理15 min 時(shí)ACE 抑制率較未熱處理樣品有大幅度的提高，此時(shí)酶解液ACE 抑制率達(dá)73.80%，比未熱處理組提高了66.78%，比傳統(tǒng)熱處理溫度（60 ℃）提高了36.84%。隨著熱處理時(shí)間的延長，酶解液ACE 呈緩慢下降趨勢。Bougatef等[20]研究沙丁魚蛋白水解物時(shí)，以及Wu 等[21]研究用甜高粱籽粒生成ACE 抑制肽時(shí)都發(fā)現(xiàn)ACE 抑制率隨水解度增大呈先升高后降低趨勢。這可能是因?yàn)橐欢ǔ潭鹊臒崽幚硎沟鞍踪|(zhì)部分溶出，同時(shí)使蛋白質(zhì)分子中含有豐富ACE 抑制肽段的疏水區(qū)域和三股螺旋結(jié)構(gòu)舒展開，暴露出更多的酶切位點(diǎn)，更易于被酶切，水解度增大的同時(shí)釋放出更多的ACE 抑制肽。隨著水解度的不斷增大，一些已經(jīng)形成的ACE 抑制肽會(huì)在高溫和蛋白酶的作用下被進(jìn)一步水解為無活性的分子[22]，使得ACE 抑制率降低。

圖5 熱處理溫度（a）和時(shí)間（b）對酶解產(chǎn)物ACE 抑制率的影響Fig.5 Effect of heat treatment temperature （a）and time （b）on the angiotensin converting enzyme inhibition rate of enzymolysis product

2.4 魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物相對分子質(zhì)量分布

進(jìn)一步測定了熱處理（121 ℃、15 min）魚鱗蛋白酶解前后上清液的相對分子質(zhì)量分布。以各標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間 （t）為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量的對數(shù)（lgM）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，分子質(zhì)量的對數(shù)（lgM）與保留時(shí)間（t）呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：lgM=-0.219t+7.192，決定系數(shù)R2=0.996。根據(jù)回歸方程計(jì)算出樣品相對分子質(zhì)量在各范圍的分布情況，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，魚鱗只經(jīng)過熱處理后，仍有90%以上為10 ku 以上的大分子，以及少量的1 ku 以下的小分子，說明熱處理雖能有效促進(jìn)蛋白溶出，并使蛋白結(jié)構(gòu)變得松散，但熱處理后的樣品水解程度仍然較低。酶解后樣品相對分子質(zhì)量主要分布在5 ku 以下，其中1 ku 以下的小分子膠原肽占39.46%，這說明在熱處理和蛋白酶的雙重作用下，魚鱗蛋白水解比較徹底。

表1 熱處理羅非魚魚鱗酶解前后相對分子質(zhì)量分布情況Table 1 The relative molecular mass distribution of the heat treated fish skin before and after enzymolysis

3 結(jié)語

本文對羅非魚魚鱗進(jìn)行了不同條件的熱處理，并以蛋白回收率和水解度為考察指標(biāo)，綜合生產(chǎn)成本和實(shí)際應(yīng)用方面考慮，確定最佳的熱處理?xiàng)l件為處理溫度121 ℃、處理時(shí)間15 min，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，在此條件下魚鱗蛋白酶解產(chǎn)物蛋白回收率達(dá)65.93%，水解度為10.54%，比未熱處理組分別提高了78.29%和89.23%，不同程度的熱處理對酶解產(chǎn)物的降血壓活性均有一定程度的增強(qiáng)作用，其中121 ℃、15 min 處理增強(qiáng)效果最佳，其ACE 抑制率為73.80%，比未熱處理組提高了66.78%。經(jīng)熱處理的樣品酶解前相對分子質(zhì)量主要集中在10 ku 以上，酶解后樣品主要集中在5 ku 以下，其中1 ku 以下的小分子高達(dá)39.46%。高溫?zé)崽幚碜鳛橐环N魚鱗蛋白酶解的物理性預(yù)處理方式，不僅簡單高效、綠色環(huán)保，還能使魚鱗變廢為寶，減少環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)資源的合理利用，具有廣闊的發(fā)展前景。