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    西達本胺聯(lián)合苦參堿對皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系增殖、凋亡的影響及可能的凋亡機制

    2020-04-03 10:39:12何杏蘭王藝萌王冠鈺張春雷
    中華皮膚科雜志 2020年2期
    關(guān)鍵詞:西達兔抗人增殖率

    何杏蘭 王藝萌 王冠鈺 張春雷

    北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科 100191

    皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma,CTCL)是一種原發(fā)于皮膚的T細(xì)胞克隆增生性非霍奇金淋巴瘤。絕大多數(shù)CTCL病程較長,疾病發(fā)展緩慢,但目前尚缺乏治愈的方法[1]。西達本胺是我國自主研發(fā)合成的、擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的選擇性組蛋白去乙?;敢种苿╤istone deacetylase inhibitor,HDACi),在多種腫瘤的治療上顯示出良好的療效及低毒性[2]??鄥A為中藥苦參的一種提取物,大量腫瘤細(xì)胞系及相關(guān)動物模型實驗均顯示其高抗腫瘤作用[3]。本研究旨在觀察西達本胺和苦參堿對CTCL細(xì)胞系HH和Hut78增殖、凋亡的影響,并通過進一步檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達,初步研究西達本胺聯(lián)合苦參堿治療CTCL的潛在機制。

    材料與方法

    一、細(xì)胞來源與試劑

    HH細(xì)胞系(ATCC號CRL-2105),Hut78細(xì)胞系(ATCC號TIB-161),RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、胎牛血清(美國HyClone公司),西達本胺(美國Selleck公司,目錄號S8567),苦參堿(中國科學(xué)院成都生物研究所),MTS細(xì)胞增殖檢測試劑盒(美國Promega公司),異硫氰酸熒光素-膜聯(lián)蛋白Ⅴ(FITC-AnnexinⅤ)凋亡檢測試劑盒(美國BD公司),兔抗人多克隆抗體胱天蛋白酶(caspase)3(美國Cell Signaling公司)、兔抗人多克隆抗體核因子(NF)κB p65、兔抗人單克隆抗體p-Bad、兔抗人單克隆抗體Bad、兔抗人單克隆抗體E鈣黏蛋白(cadherin)、兔抗人單克隆抗體Bcl-2、鼠抗人單克隆抗體GAPDH(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

    將1 mg西達本胺粉末溶于2.5614 ml二甲基亞砜(DMSO)中配置為1 mmol/L儲存液,置-20℃保存,使用前采用DMSO稀釋至1 μmol/L。將100 mg苦參堿粉末溶于1 ml DMSO配置成100 g/L苦參堿液,-4℃保存。

    二、細(xì)胞培養(yǎng)

    HH、Hut78細(xì)胞在含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基,37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)傳代,取對數(shù)生長期HH、Hut78細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

    三、MTS法檢測西達本胺及苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞增殖的影響

    取對數(shù)生長期HH、Hut78細(xì)胞,計數(shù)后以2×104/ml接種于6孔板,每孔2 ml。實驗藥物濃度的選擇參考本課題組前期研究[4-5]和預(yù)實驗結(jié)果。2種細(xì)胞分別分為4組:西達本胺組(加入西達本胺使其終濃度為0.4 μmol/L)、苦參堿組(加入苦參堿使其終濃度為0.6 g/L)、聯(lián)合組(加入終濃度為0.4 μmol/L西達本胺溶液后立即加入0.6 g/L苦參堿溶液)、對照組(僅加入DMSO),分別培養(yǎng)24、48、72 h。每個時間點混勻細(xì)胞,取100 μl細(xì)胞懸液至96孔板中,每組做3個復(fù)孔,每孔加入20 μl預(yù)先配置的MTS溶液,37℃孵箱中培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀測490 nm處吸光度(A值),重復(fù)測定3次。細(xì)胞增殖率 =[(A處理組-A培養(yǎng)基對照)/(A對照組-A培養(yǎng)基對照)]×100%。

    四、流式細(xì)胞儀檢測西達本胺及苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞凋亡率的影響

    取對數(shù)生長期HH、Hut78細(xì)胞,以2×104/ml接種至6孔板中。按上述分4組,處理HH、Hut78細(xì)胞48 h。每組計數(shù)5×105細(xì)胞,冷磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2次,1×106/ml細(xì)胞重懸于結(jié)合緩沖液中。取100 μl細(xì)胞懸液至5 ml培養(yǎng)管中,每管加入人FITC偶聯(lián)的AnnexinⅤ5 μl以及碘化丙錠5 μl?;靹颍芄夥跤?5 min。每管加入400 μl結(jié)合緩沖液,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。以上實驗重復(fù)3次。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

    五、Western印跡法檢測西達本胺及苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

    HH、Hut78細(xì)胞按上述分組處理48 h后,取106個細(xì)胞,離心后棄上清液,磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2次,加入蛋白裂解液并置于冰上,混勻。4℃震蕩孵育1 h,4℃18 000×g離心15 min。收集上清液,用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。總蛋白溶液中加入蛋白電泳上樣緩沖液,充分混勻,水浴鍋中100℃煮沸變性5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠每孔分別加入30 μg總蛋白或2 μl預(yù)染色蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志(marker),90 V恒壓40 min,蛋白進入分離膠后,130 V恒壓電泳90 min。250 mA 90 min將電泳蛋白電轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,分別加入目的蛋白一抗:兔抗人多克隆抗體caspase-3(1∶1 000)、兔抗人多克隆抗體NF-κB p65(1∶1 000)、兔抗人單克隆抗體p-Bad(1∶1 000),兔抗人單克隆抗體Bad(1∶1 000),兔抗人單克隆抗體E-cadherin(1∶10 000),兔抗人單克隆抗體Bcl-2(1∶1 000),搖床上4℃過夜。封閉洗滌緩沖液(TBST)洗滌3次,每次15 min,加入IRDye?800CW染料標(biāo)記的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗,室溫孵育1 h,TBST漂洗3次,每次15 min。雙紅外激光掃描成像系統(tǒng)進行熒光顯色、分析。以GAPDH為內(nèi)參,使用Image J軟件定量分析各條帶灰度值。

    六、統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、西達本胺和苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞體外增殖的影響

    與對照組相比,西達本胺組、苦參堿組和聯(lián)合組HH、Hut78細(xì)胞增殖率均有不同程度降低,見圖1。HH細(xì)胞系重復(fù)測量方差分析顯示,各處理組細(xì)胞增殖率有隨時間變化的趨勢(F=137.41,P<0.001),且不同處理組間細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.88,P<0.05)。各處理組間兩兩比較顯示,24 h時,聯(lián)合組細(xì)胞增殖率與苦參堿組和西達本胺組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=1.84、3.12,P=0.12、0.21);48、72 h時,聯(lián)合組細(xì)胞增殖率顯著低于苦參堿組(LSD-t=4.90、2.64,均P<0.05)和西達本胺組(LSD-t=4.89、6.32,均P <0.05)。

    Hut78細(xì)胞系各處理組細(xì)胞增殖率有隨時間變化的趨勢(F=138.69,P <0.001),且不同處理組間細(xì)胞增殖率差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(F=558.26,P < 0.001)。各處理組間兩兩比較顯示,24、48、72 h時,聯(lián)合組細(xì)胞增殖率均顯著低于苦參堿組(LSD-t=2.60、10.18、14.93,均P < 0.05)和西達本胺組(LSD-t=6.56、4.86、4.71,均P < 0.05)。見圖1。

    圖1 西達本胺和苦參堿單藥或聯(lián)合處理對HH、Hut78細(xì)胞增殖活力的影響 西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合處理均使HH、Hut78細(xì)胞增殖率有不同程度降低,且各處理組細(xì)胞增殖率有隨時間延長逐漸降低的趨勢。24 h時,各處理組間HH細(xì)胞增殖率無明顯差異,但48、72 h時聯(lián)合組低于苦參堿組和西達本胺組;24、48、72 h時,聯(lián)合組Hut78細(xì)胞增殖率均低于苦參堿組和西達本胺組

    二、西達本胺和苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞凋亡的影響

    48 h時,西達本胺組、苦參堿組、聯(lián)合組和對照組HH細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.22,P<0.05)。兩兩多重比較顯示,苦參堿組、西達本胺組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=1.97、1.69,P=0.20、0.27),苦參堿組與西達本胺組相比差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=0.29,P=0.84),但聯(lián)合組顯著高于對照組、苦參堿組和西達本胺組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=7.37、5.40、5.69,均P < 0.05)。見圖2、表1。

    西達本胺組、苦參堿組、聯(lián)合組和對照組Hut78細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=32.36,P<0.05)。兩兩比較顯示,苦參堿組、西達本胺組和聯(lián)合組均顯著高于對照組(LSD-t=4.76、5.31、13.69,均P<0.05),且聯(lián)合組仍顯著高于苦參堿組和西達本胺組(LSD-t=8.93、8.37,均P < 0.01)。見圖2、表1。

    三、西達本胺和苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

    圖2 流式細(xì)胞儀檢測西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合對HH、Hut78細(xì)胞凋亡的影響 48 h時,聯(lián)合組HH細(xì)胞凋亡率高于對照組、苦參堿組和西達本胺組,而對照組、苦參堿組和西達本胺組間無明顯差異;苦參堿組、西達本胺組和聯(lián)合組Hut78細(xì)胞凋亡率均高于對照組,且聯(lián)合組高于苦參堿組和西達本胺組

    表1 西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合對HH、Hut78細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響(±s)

    表1 西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合對HH、Hut78細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響(±s)

    注:a與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。caspase-3:胱天蛋白酶3

    組別 細(xì)胞凋亡率(%) 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達E鈣黏蛋白p65Bad p-Bad Bcl-2caspase-3剪切體HH細(xì)胞系對照組苦參堿組西達本胺組聯(lián)合組F值P值Hut78細(xì)胞系對照組苦參堿組西達本胺組聯(lián)合組F值P值11.44±1.43 13.98±3.86 13.61±1.62 20.94±0.64a 10.22<0.05 2.06±0.27 1.61±0.23 1.28±0.10a 0.76±0.12a 24.83<0.05 2.90±0.47 2.74±0.53 2.72±0.56 1.46±0.24a 6.196<0.05 2.89±0.86 2.96±0.72 2.64±0.60 2.76±0.70 0.11 0.95 1.50±0.11 1.27±0.09 1.16±0.19 0.83±0.06a 12.64<0.05 3.68±0.49 3.12±0.33 2.90±0.19 2.06±0.09a 13.71<0.05 0.77±0.14 0.79±0.16 0.90±0.04 1.27±0.17a 8.58<0.05 8.42±4.23 20.98±1.53a 22.44±7.74a 44.53±1.85a 32.36<0.05 3.91±0.23 3.11±0.49a 2.63±0.23a 1.78±0.43a 22.08<0.05 3.34±0.20 2.56±0.18a 2.53±0.36a 1.46±0.34a 22.15<0.05 2.72±0.39 2.44±0.32 2.15±0.22 2.10±0.09 2.78 0.11 1.97±0.18 1.23±0.35a 1.26±0.16a 0.49±0.28a 16.64<0.05 1.25±0.07 0.94±0.12a 0.79±0.17a 0.32±0.10a 30.67<0.05 1.02±0.15 1.37±0.05 1.48±0.14a 2.09±0.17a 32.63<0.05

    圖3 Western印跡法檢測西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合對HH、Hut78細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 苦參堿、西達本胺單藥或聯(lián)合處理48 h后,Hut78細(xì)胞caspase-3剪切體蛋白表達有不同程度升高,而E鈣黏蛋白(cadherin)、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表達有不同程度降低,Bad蛋白表達基本無差異;HH細(xì)胞聯(lián)合組caspase-3剪切體蛋白表達明顯升高,而E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表達明顯降低,4組間Bad蛋白表達無明顯差異

    如圖3、表1所示,HH細(xì)胞中,聯(lián)合組caspase-3剪切體蛋白表達顯著高于對照組、苦參堿組和西達本胺組(LSD-t=6.37、5.98、4.67,均P < 0.05),而E-cadherin(LSD-t=11.82、7.80、4.78)、p65(LSD-t=5.36、4.76、4.12)、p-Bad(LSD-t=9.70、6.35、4.84)及Bcl-2蛋白(LSD-t=8.92、5.84、4.64)表達顯著低于其他3組(均P>0.05)。4組間Bad蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比,苦參堿組、西達本胺組caspase-3剪切體蛋白、p65、p-Bad和Bcl-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),且苦參堿組E-cadherin蛋白表達差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=4.02,P=0.08),而西達本胺組E-cadherin蛋白表達顯著低于對照組(LSD-t=7.036,P < 0.05)。

    Hut78細(xì)胞中,苦參堿組、西達本胺組和聯(lián)合組E-cadherin(LSD-t=4.57、6.97、11.75)、p65(LSD-t=4.74、4.94、11.46)、p-Bad(LSD-t=5.01、4.76、9.99)、Bcl-2蛋白(LSD-t=4.55、6.65、13.47)表達均顯著低于對照組(均P<0.05)??鄥A組caspase-3剪切體蛋白表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(LSD-t=4.50,P>0.05),而西達本胺組和聯(lián)合組顯著高于對照組(LSD-t=5.90、13.72,均P < 0.05),聯(lián)合組顯著高于苦參堿組和西達本胺組(LSD-t=9.22、7.82,均P < 0.05)。聯(lián)合組E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2蛋白表達顯著低于苦參堿組(LSD-t=7.18、6.72、4.98、8.92,均 P < 0.05)和西達本胺組(LSD-t=4.78、6.52、5.19、6.82,均P < 0.05)。4組間Bad蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    討 論

    CTCL是一組表現(xiàn)多樣的結(jié)外霍奇金淋巴瘤,雖然其治療方法多樣,但并無完全治愈的方法,因此探索具有更好療效的藥物至關(guān)重要[6]。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)與許多腫瘤發(fā)生有強相關(guān)性,目前已成為腫瘤研究的熱點方向。其抑制劑HDACi可通過抑制細(xì)胞周期和DNA修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖,在腫瘤治療方面顯示出極大的潛力[7]。西達本胺是我國自主研發(fā)合成的選擇性HDACi,能選擇性抑制HDAC-1、2、3、10,毒性低,并被證實對多種腫瘤均有良好的治療效果[2]。一項西達本胺治療79例難治性、復(fù)發(fā)性皮膚外周T細(xì)胞淋巴瘤患者的Ⅱ期臨床試驗顯示,治療后患者中位生存時間提高,可達21.4個月[8]。西達本胺對CTCL也有明顯抗腫瘤療效,一項西達本胺治療難治性CTCL患者的Ⅱ期臨床試驗顯示,連續(xù)給藥組總緩解率可達36%,且不良反應(yīng)少[9]。本課題組前期研究[4]顯示,西達本胺作用于CTCL細(xì)胞系可明顯抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。苦參堿是一種豆科類植物苦參的提取物,具有良好的藥理學(xué)活性。既往研究表明[3,10],苦參堿在多種腫瘤的治療上都有著良好的療效,并顯示出巨大的潛力。我們前期研究[5]顯示,苦參堿能有效抑制CTCL細(xì)胞系HH增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

    我們采用西達本胺、苦參堿單藥或二者聯(lián)合體外干預(yù)人CTCL細(xì)胞系HH和Hut78,研究西達本胺和苦參堿對腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響。結(jié)果顯示,西達本胺與苦參堿二者聯(lián)合能顯著抑制HH和Hut78細(xì)胞增殖并促進其凋亡。Western印跡結(jié)果顯示,經(jīng)西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合處理HH和Hut78兩個細(xì)胞系后,E-cadherin蛋白表達明顯下調(diào),而caspase 3剪切體的表達上調(diào)。E-cadherin是相對分子量為120 000的糖蛋白,大多分布于上皮細(xì)胞表面,目前有研究[11]發(fā)現(xiàn),E-cadherin也可高表達于一些非霍奇金淋巴瘤的腫瘤細(xì)胞上。在多種腫瘤中,E-cadherin不僅對細(xì)胞間粘附發(fā)揮作用,也對凋亡的發(fā)生起關(guān)鍵作用。Galaz等[12]研究認(rèn)為,E-cadherin的表達減少是誘導(dǎo)凋亡的一個重要觸發(fā)點。E-cadherin表達下調(diào)能直接激活caspase-3,caspase-3激活后產(chǎn)生caspase-3剪切體從而執(zhí)行細(xì)胞凋亡[13]。在尤因肉瘤、肝癌等多種腫瘤[14-16]中,E-cadherin表達下調(diào)可促進腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)合既往文獻報道,本研究結(jié)果提示,西達本胺聯(lián)合苦參堿可能也通過抑制E-cadherin,激活caspase-3,產(chǎn)生caspase-3剪切體,從而誘導(dǎo)Hut-78、HH細(xì)胞凋亡。

    Bad屬于Bcl-2家族一員,是一種僅含BH3區(qū)域蛋白的促凋亡分子,Bad促凋亡作用由其絲氨酸磷酸化調(diào)控。細(xì)胞質(zhì)中,磷酸化Bad與一種支架蛋白14-3-3結(jié)合,而無法與抗凋亡蛋白Bcl-2形成二聚體,進而無法發(fā)揮促凋亡作用;一旦細(xì)胞受到刺激,Bad立即去磷酸化,遷移至線粒體中與抗凋亡分子Bcl-2相結(jié)合形成復(fù)合體,從而抑制Bcl-2抗凋亡作用而誘導(dǎo)凋亡[17-18]。NF-κB是一種極為重要的介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子,其與細(xì)胞凋亡發(fā)生也有密切關(guān)聯(lián)。既往研究[19]顯示,CTCL中NF-κB的激活與腫瘤細(xì)胞存活有明顯正相關(guān)性。多種腫瘤研究[20-22]表明,抑制NF-κB的表達能下調(diào)Bcl-2蛋白的表達水平,通過激活下游caspase-3等分子而引發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng),從而起到抑制腫瘤生長的作用。Bcl-2與Bad一樣,同屬于Bcl-2蛋白家族,在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮不容忽視的作用。目前最主流的Bcl-2調(diào)節(jié)凋亡模型認(rèn)為,Bcl-2能與Bcl-2家族中其他促凋亡蛋白緊密結(jié)合,從而抑制細(xì)胞色素c的釋放而使后續(xù)的凋亡級聯(lián)反應(yīng)無法進行[23-24]。本研究顯示,西達本胺、苦參堿單藥或聯(lián)合處理HH、Hut78細(xì)胞后均可抑制p-Bad、p65、Bcl-2的表達。結(jié)合上述文獻我們認(rèn)為,西達本胺和苦參堿可能通過抑制p-Bad與NF-κB的表達,進一步干擾Bcl-2的表達,促進凋亡發(fā)生。

    西達本胺或苦參堿單藥對多種腫瘤作用機制的研究[25-28]顯示,兩藥皆可通過下調(diào)Bcl-2、p65蛋白表達水平,進一步激活下游的caspase-3蛋白,從而抑制多種腫瘤生長。本研究結(jié)果顯示,與單藥組相比,西達本胺聯(lián)合苦參堿對HH、Hut78細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用更明顯,對凋亡相關(guān)蛋白caspase-3剪切體表達的升高及E-cadherin、p65、p-Bad、Bcl-2表達的降低作用均明顯強于單藥組,顯示西達本胺聯(lián)合苦參堿能協(xié)同抑制HH、Hut78細(xì)胞的生長??赡芪鬟_本胺與苦參堿在誘導(dǎo)CTCL細(xì)胞系凋亡的作用機制上有所重疊,聯(lián)合用藥比單藥處理效果更加顯著。與Hut78細(xì)胞上有白細(xì)胞介素(IL)-2受體全鏈相比,HH細(xì)胞僅有IL-2受體β + γ鏈[29-30],對IL-2的親和力要低于Hut78細(xì)胞。IL-2可通過激活JAK1和JAK3激酶參與CTCL的發(fā)生,而抑制IL-2能抑制信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白5(STAT5),從而抑制抗凋亡蛋白的產(chǎn)生,進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]??鄥A和HDACi均能抑制IL-2的產(chǎn)生[32-33]。因此,我們推測苦參堿和西達本胺誘導(dǎo)HH細(xì)胞凋亡的作用不如Hut78細(xì)胞。

    西達本胺聯(lián)合苦參堿處理CTCL細(xì)胞系,可能通過抑制E-cadherin蛋白表達而激活caspase-3、產(chǎn)生caspase-3剪切體,從而促進凋亡,或通過抑制p65、p-Bad蛋白表達而干擾Bcl-2蛋白的表達,進而激活caspase-3,產(chǎn)生caspase-3剪切體,從而促進凋亡。本研究中我們僅對HH、Hut78兩個細(xì)胞系進行了初步研究,后續(xù)將探索更多細(xì)胞系或進行動物實驗,深入研究西達本胺與苦參堿聯(lián)合作用于CTCL的機制。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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