宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 的表達變化及臨床指導意義

陳小霞，謝 環(huán)

（三峽大學宜昌市第二人民醫(yī)院婦科，湖北宜昌 443000）

宮頸癌發(fā)生與患者的宮頸上皮細胞癌變有關，宮頸癌的，死亡率和發(fā)生率分別排在女性惡性腫瘤的第9 位和第8 位，嚴重威脅女性健康[1]。宮頸癌的治療主要以手術治療和放化療為主，隨著近年來靶向治療以及免疫治療技術的發(fā)展，宮頸癌患者的預后得到較大改善，但是死亡率和發(fā)生率依然呈現(xiàn)上升趨勢[2]，因此迫切需要對宮頸癌的發(fā)病機制進行深入探究。宮頸癌發(fā)病的分子機制較為復雜，涉及到眾多蛋白質(zhì)和基因表達的變化，其中微小RNA（micro-RNA，miRNA）在基因表達調(diào)控中起到重要作用[3]。miRNA 是一類長度為18-24nt 的短片段RNA，在細胞當中廣泛存在，并且調(diào)節(jié)細胞的一系列生理和代謝活動[4]。研究報道顯示miRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、細胞周期以及腫瘤干細胞維持等過程中均顯示具有一定調(diào)節(jié)作用[5-6]。miRNA-21 在正常組織中表達量較低，研究報道顯示在乳腺癌、結(jié)腸致癌和胃癌等腫瘤當中miRNA-21表達量上調(diào)，并且與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和增殖密切相關[7]。miRNA-127 在正常組織當中表達量較高，而在肺癌和乳腺癌等腫瘤當中表達量下調(diào)，并且與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關[8]。miRNA-125a 在結(jié)腸致癌和乳腺癌等腫瘤中表達量下調(diào)，并且與腫瘤細胞的遠端轉(zhuǎn)移密切相關[9]。本研究對95 例宮頸癌患者宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-127和miRNA-125a 的表達水平進行檢測，以此探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014 年1 月至2017 年12 月在三峽大學宜昌市第二人民醫(yī)院接受治療的95 例宮頸癌患者的臨床資料進行回顧性分析?；颊吣挲g39～74 歲，平均（57.83±12.56）歲。按照TNM分期將宮頸癌患者分為Ⅰ期18 例，Ⅱ期14 例，Ⅲ期39 例，Ⅳ期24 例。39 例未發(fā)生肌層浸潤，56 例發(fā)生肌層浸潤。低分化宮頸癌39 例，中分化32 例，高分化24 例。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30 例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65 例。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑Trizol 試劑（美國英濰捷基有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國賽默飛世爾生物科技有限公司，貨號：18090050），實時熒光定量PCR 試劑盒（美國賽默飛世爾生物科技有限公司，貨號：4444556），熒光定量PCR 儀（美國安捷倫科技有限公司，型號Mx3000PS），所需引物均從蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 檢測方法手術切除宮頸癌組織以及距離宮頸癌組織3 cm 以上的癌旁組織后立即將其置于2 mL 凍存管當中，立即放入液氮中進行速凍處理，液氮速凍之后置于-80℃冰箱保存。待需要檢測時，將組織從-80℃冰箱取出并置于液氮速凍，用鑷子將組織從凍存管中取出后，使用研缽將腫瘤組織研磨成粉末，根據(jù)腫瘤組織的大小加入適量的Trizol 提取液，使用移液槍充分吹打混勻，冰上裂解30 min 后加入苯酚-氯仿-異戊醇抽提液對腫瘤組織中的RNA 進行抽提，抽提結(jié)束后用酒精將RNA 沉淀下來，3 000 g 離心10 min 后棄去上清液，待酒精蒸發(fā)完全后加入無菌水進行溶解，獲得RNA 溶液。隨后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行。獲得cDNA 文庫后使用實時熒光定量PCR 試劑盒對miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 的表達量進行檢測，配套使用熒光定量PCR 儀進行檢測，操作方法嚴格按照試劑盒說明書和儀器說明書進行操作。在檢測miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 的表達量的同時，以甘油醛-3-磷酸脫氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，并檢測其表達量。通過相對△Ct值法對miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 相對表達量進行計算，目的基因miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 的表達量相對于GAPDH 基因的比值為2-△Ct，計算miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 的相對表達量，其中△CtmiRNA-21=CtmiRNA-21-CtGAPD H、△CtmiRNA-127=Ct miRNA-127-CtGAPDH 和△CtmiRNA-125a=CtmiRNA-125a-CtGAPDH。miR NA-21 的PCR 引物序列包括正向引物：5'-CTGCAGGGAAAACACATACCAGA-3'，反向引物：5'-TGGTTCAGGATGCGCTGCTC-3'。miRNA-127的 PCR 引物序列包括正向引物：5'-GGCAGAATGGAAGCAGTCCC-3'，反向引物：5'-CTCAGCTCGCTCAGAAGGGC-3'。miRNA-125a 的PCR引物序列包括正向引物 ：5'-TGGTAGTCCTGTTGGCAGGAGA-3'，反向引物：5'-GTCGCTTGTTACCTAGCATCTGCA-3'。GAPDH的 PCR引物序列包括正向引物 ：5'-TCTCTCAGATGTAACTGAGCTG-3'，反向引物：5'-TAGCTCATCAACCGATCT-3'。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 的表達水平比較

宮頸癌組織中miRNA-21 表達量為（25.63±6.85），明顯高于癌旁組織的（1.33±0.62）t=34.435，P＜0.001。宮頸癌組織中miRNA-127 和miRNA-125a 表達量分別為（5.64±1.29）和（8.47±1.58），而癌旁組織中miRNA-127 和miRNA-125a 表達量分別為（16.47 ±4.62）和（23.49±5.57），宮頸癌組織中表達量明顯低于癌旁組織（t=22.007 和25.285，P＜0.001）。宮頸癌組織及其癌旁組織miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 的表達量見圖1。

圖1 宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 的表達水平Fig.1 Expression levels of miRNA-21，miRNA-127 and miRNA-125a in cervical cancer tissues

2.2 宮頸癌組織miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 表達水平與患者臨床病理參數(shù)的關系

宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 均與宮頸肌層浸潤、組織學分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期密切相關（P＜0.05），而與患者的年齡和腫瘤大小無關（P＞0.05），見表1。

2.3 宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 表達與患者預后的關系分析

在宮頸癌中，miRNA-21 高表達宮頸癌患者的生存率明顯低于miRNA-21 低表達患者（X2=16.214，P＜0.001），而miRNA-127 高表達和miRNA-125a 高表達宮頸癌患者的生存率分別高于miRNA-127 低表達和miRNA-125a 低表達患者（X2=10.612 和9.526，所有P＜0.001）。宮頸癌患者的生存曲線見圖2。

3 討論

HPV 感染是宮頸癌的一大致病因素，約60%的患者存在HPV 感染，并且HPV 疫苗顯示對宮頸癌具有很好的預防效果[10]。但是對于部分HPV 陰性的宮頸癌患者，HPV 疫苗對這類患者的療效欠佳，其宮頸癌的發(fā)病機制更為復雜[11]。目前對宮頸癌的發(fā)病機制仍然缺乏了解，研究報道通過高通量測序的方法對宮頸癌組織中基因的表達情況進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)一系列基因在宮頸癌發(fā)病過程中表達出現(xiàn)異常[12]。研究報道對宮頸癌中的miRNA 表達及調(diào)控方式進行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)宮頸癌中存在復雜的miRNA 調(diào)控網(wǎng)絡，一種miRNA 能夠同時對多種基因的表達進行調(diào)控，并且miRNA 自身的表達也可能受到另外的miRNA 調(diào)控[13]。研究報道顯示miRNA 可以作為腫瘤的分子標記，用于腫瘤的診斷和治療[14]，提示miRNA 在宮頸癌的診斷和治療中具有重要的臨床價值。

表1 宮頸癌組織miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 表達與患者臨床病理參數(shù)的關系（）Tab.1 Relationship between expressions of miRNA-21,miRNA-127 and miRNA-125a in cervical cancer tissue and clinical pathological parameters of the patients（）

表1 宮頸癌組織miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 表達與患者臨床病理參數(shù)的關系（）Tab.1 Relationship between expressions of miRNA-21,miRNA-127 and miRNA-125a in cervical cancer tissue and clinical pathological parameters of the patients（）

圖2 宮頸癌組織中miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 表達與患者預后的關系分析Fig.2 An analysis of the relationship between the expressions of miRNA-21，miRNA-127 and miRNA-125a in cervical cancer tissues and the patients'prognosis

miRNA-21 主要分布于細胞質(zhì)中，研究報道顯示隨著腫瘤細胞發(fā)生凋亡，miRNA-21 會從腫瘤細胞中釋放進入到患者的血液當中，因此miRNA-21可以作為多種腫瘤的血清標記物分子[15]。miRNA-127 在細胞質(zhì)和細胞核中均有分布，研究報道顯示在細胞核中miRNA-127 能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，而細胞質(zhì)中miRNA-127能夠與基因mRNA 相互結(jié)合，促進基因mRNA 降解，從而抑制基因表達[16]。miRNA-125a 主要分布于細胞質(zhì)中，研究報道顯示miRNA-125a 通過調(diào)節(jié)一系列信號通路的活性來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[17]。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中miRNA-21 表達上調(diào)，而miRNA-127 和miRNA-125a表達下調(diào)。研究報道顯示在乳腺癌等多種腫瘤當中miRNA-21 主要作為癌基因起作用，而miRNA-127 和miRNA-125a 主要作為抑癌基因起作用[18]。本研究在宮頸癌中進一步對此進行證實，表明在宮頸癌中miRNA-21 也作為癌基因起作用，而miRNA-127 和miRNA-125a 也作為抑癌基因起作用。研究進一步發(fā)現(xiàn)miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 表達均與宮頸肌層浸潤、組織學分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期密切相關，表S 明miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 表達與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移存在密切聯(lián)系。研究報道顯示miRNA-21 能夠激活有絲分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，進而促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[19]。miRNA-127 則能夠激活核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路，進而促進乳腺癌和胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移[20]。miRNA-125a 則能夠直接抑制黏蛋白1（mucprotein 1，MUC1）和上皮鈣黏著蛋白（E-cadherin）等細胞黏附相關蛋白的表達，從而抑制細胞轉(zhuǎn)移[21]。因此在宮頸癌中miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 可能通過調(diào)節(jié)細胞黏附相關信號通路或者是相關蛋白的表達來調(diào)節(jié)細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-21 高表達、miRNA-127 低表達和miRNA-125a 低表達的宮頸癌患者生存率明顯下降。宮頸癌患者的生存率與腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移之間聯(lián)系密切，研究報道顯示非轉(zhuǎn)移宮頸癌患者生存率是發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的2～3 倍，并且發(fā)生轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者放化療和手術治療難度加大，對患者的生存也會造成影響[22]。因此miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 可能通過影響腫瘤轉(zhuǎn)移進而影響宮頸癌患者的生存。

綜上所述，宮頸癌組織中miRNA-21 表達上調(diào)，而miRNA-127 和miRNA-125a 表達下調(diào)。miRNA-21、miRNA-127 和miRNA-125a 表達均與宮頸肌層浸潤、組織學分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關，并且miRNA-21 高表達、miRNA-127 低表達和miRNA-125a 低表達的宮頸癌患者生存率明顯下降。