Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)樹鼩AD 模型的建立

郭玉倩 ，曾躍勤，吳 超，陸姜利，楊 藝，鄭 紅，梁 張

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部；2）分子臨床研究院；3）科技處，云南昆明 650500）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是常見的原發(fā)性老年性神經(jīng)退行性疾病，是最常見的癡呆類型。臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性記憶力下降、認(rèn)知功能障礙、行為異常和人格失常等。我國(guó)每年新增大約30 萬患者[1]。AD 患病率與年齡密切相關(guān)，年齡平均每增加6.1 歲，患病率升高1 倍；在85 歲以上老年人群中，AD 患病率可高達(dá)20%～30%。到2050 年，全球AD 患者將超過1 億[2]。AD 不僅給患者帶來巨大的痛苦，還給家庭和社會(huì)帶來了沉重的精神壓力和醫(yī)療、照料負(fù)擔(dān)。由于發(fā)病原因不明確和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜性，目前AD 治療藥物均不能逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程[3]。因此，建立適宜的AD 動(dòng)物模型有利于開展發(fā)病機(jī)制、藥物研發(fā)和機(jī)理研究[4]。筆者以樹鼩為研究對(duì)象，通過海馬內(nèi)注射Aβ25-35、皮下注射D-gal 和聯(lián)合給藥3 種方式建立AD 模型，旨在為AD 的研究提供理想的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只雄性樹鼩來源于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，許可證：SCXK（滇）2015-0002）；實(shí)驗(yàn)樹鼩飼料、飼養(yǎng)籠均由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，動(dòng)物自由飲水，單籠飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%。

1.2 主要儀器

腦立體定位儀（成都儀器廠），水迷宮行為測(cè)試系統(tǒng)（成都泰盟公司），組織切片機(jī)、烤片機(jī)、包埋機(jī)（德國(guó)leica 公司），顯微鏡（日本尼康公司），恒溫培養(yǎng)箱、冰箱（美國(guó)Thermo），粘附載玻片（福州邁新公司）。

1.3 主要試劑

Beta 淀粉樣蛋白25-35、D-半乳糖（Sigma公司），兔抗鼠Aβ1-42一抗（Abcam 公司），PBS磷酸緩沖液（Solarbio 公司），檸檬酸鈉、多聚甲醛、快捷型山羊抗兔/小鼠IgG（福州邁新公司），中性樹膠（南京建成公司）。

1.4 方法

1.4.1 Aβ25-35 的孵育參照Zheng 等[5]方法，用生理鹽水將Aβ25-35（5 mg/mL）配制成溶液，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育7 d，用于樹鼩海馬注射。

1.4.2 動(dòng)物分組及處理24 只雄性樹鼩，體重135～145 g，隨機(jī)分為對(duì)照組（CT），D-半乳糖組（D），Aβ 組（A），D-半乳糖聯(lián)合Aβ25-35（D+A）組。用3%戊巴比妥（30 mg/kg）腹腔注射麻醉樹鼩。Aβ25-35在立體定儀下向A 組和D+A 組海馬中1 次性注射4 μL 的Aβ25-35（5 mg/mL）；CT 和D 組注射等量生理鹽水，術(shù)后所有樹鼩肌肉注射青霉素[22 000 U/(kg·d)]連續(xù)3 d，預(yù)防感染。向D 組和D+A 組皮下注射D-半乳糖[125 mg/(kg·d)]，對(duì)照組和Aβ25-35組給予等量生理鹽水，連續(xù)8 周。

1.4.3 Morris 水迷宮檢測(cè)（MWM）在第9 周進(jìn)行，每天早上9:00 點(diǎn)開始測(cè)試。泳池直徑1.6 m，水溫（21±1）℃。第1 天為搜索平臺(tái)的適應(yīng)訓(xùn)練，水迷宮設(shè)置為可見平臺(tái)，將樹鼩面朝向池壁，距水面高度10 cm 放下，30 s 后若樹鼩沒有找到平臺(tái)，將其引導(dǎo)上平臺(tái)。在平臺(tái)停留10 s 后，把樹鼩取出、充分擦干身體。第2～6 天進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)，設(shè)置為距水面下1 cm 的隱藏平臺(tái)，實(shí)驗(yàn)操作同第1 天，記錄樹鼩找到平臺(tái)的時(shí)間，如30 s 未找到平臺(tái)，逃避潛伏期記為30 s。第7 天進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，記錄樹鼩通過原平臺(tái)位置的次數(shù)、運(yùn)動(dòng)軌跡。

1.4.4 免疫組化檢測(cè)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，心臟采血處死樹鼩，生理鹽水和多聚甲醛灌注固定樹鼩腦組織，取大腦制成5 μm 石蠟切片，經(jīng)脫蠟、檸檬酸鈉修復(fù)、封閉、兔抗鼠Aβ1-42一抗孵育、二抗孵育、DAP 顯色、蘇木素染色、乙醇梯度脫水、二甲苯透明后，封片。顯微鏡下觀察大腦皮層和海馬細(xì)胞形態(tài)和Aβ1-42的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的數(shù)據(jù)均采用SPSS 進(jìn)行處理分析，樹鼩腦片免疫組化染色結(jié)果采用image J 進(jìn)行定量，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩Morris 水迷宮

定位巡航實(shí)驗(yàn)中，從第4 天至第6 天，D-半乳糖組、Aβ25-35組和D-半乳糖聯(lián)合Aβ25-35（D+A）組逃避潛伏期延長(zhǎng)，與對(duì)照組（P＜0.01；圖1a）具有差異極顯著性；在第6 天，D+A 組（P＜0.05；圖1A）逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于D-半乳糖組、Aβ25-35組。在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示相對(duì)于對(duì)照組相比（P＜0.05；圖1A），D、A 和D+A組穿越平臺(tái)次數(shù)均顯著性降低；D+A 組（P＜0.05；圖1A）穿越平臺(tái)次數(shù)顯著低于單因素誘導(dǎo)的D-半乳糖組和Aβ25-35組。

2.2 樹鼩海馬與皮層中Aβ1-42 的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，在樹鼩海馬中，對(duì)照組神經(jīng)元形態(tài)完整，胞質(zhì)和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列緊密。D 組、A 組和D+A 組細(xì)胞排列相對(duì)松散、核固縮，胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同程度棕色。對(duì)陽性面積定量分析顯示，D 組、A 組和D+A 組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05；圖1B，Hip），而D+A 組Aβ1-42的表達(dá)最多，顯著高于D 組和A 組。樹鼩的大腦皮層中也有類似的結(jié)果，3 個(gè)處理組細(xì)胞固縮明顯，胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)不同程度棕色。定量分析顯示，D 組、A 組和D+A 組顯著高于對(duì)照組（P＜0.05；圖1B，Cor），而D+A 組（P＜0.05）Aβ1-42的表達(dá)顯著高于D 組和A 組。

圖1 樹鼩不同處理水迷宮實(shí)驗(yàn)和大腦Aβ1-42表達(dá)分布情況（n=6）Fig.1 Morris water maze and Aβ1-42IHC（n=6）

3 討論

為了探究AD 的機(jī)制和潛在治療藥物，建立合適的動(dòng)物模型是關(guān)鍵的一步。理想的AD 動(dòng)物模型將為解決藥物靶點(diǎn)不明、臨床前后藥效學(xué)不一致等問題提供有力工具[6]。大小鼠等嚙齒類動(dòng)物是最常用的AD 模型，因其繁殖力強(qiáng)、利于大規(guī)模飼養(yǎng)、成本低和易于操作等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于AD 動(dòng)物模型研究。但由于與人類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，僅能模擬部分病理學(xué)特征[7]。其他的動(dòng)物模型，如犬和果蠅等也有局限性[8]。目前靈長(zhǎng)類動(dòng)物被廣泛認(rèn)為是最合適的AD 動(dòng)物模型，但由于價(jià)格昂貴，飼養(yǎng)的經(jīng)濟(jì)和空間成本高、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，尚難以廣泛應(yīng)用。因此具有類似靈長(zhǎng)類動(dòng)物特征同時(shí)體型較小的動(dòng)物是理想的AD 候選動(dòng)物模型。通過全基因組測(cè)序和分子基礎(chǔ)研究證實(shí)，攀鼩目動(dòng)物樹鼩為靈長(zhǎng)目的近親[9]，具有較大的腦重比和復(fù)雜的行為特征，適合應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病研究[10-11]。與非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物相比，樹鼩體型小，成年體重平均150 g 左右，飼養(yǎng)的空間和經(jīng)濟(jì)成本低，繁殖周期短[12]。有研究已經(jīng)證實(shí)，通過將孵育的Aβ1-40注射到大腦，引起樹鼩認(rèn)知功能障礙[13]并且臨床治療藥物多奈哌齊可緩解樹鼩癥狀[5]。D-半乳糖是一種動(dòng)物體內(nèi)的還原糖，皮下注射可以模擬自然衰老過程并誘導(dǎo)行為改變[14]，同時(shí)還可促進(jìn)認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)元損傷、線粒體功能喪失和膽堿能系統(tǒng)異常[15-16]。但尚未見復(fù)合因素誘導(dǎo)樹鼩AD 模型的報(bào)道。

AD 動(dòng)物模型包括單因素誘導(dǎo)和復(fù)合因素誘導(dǎo)。復(fù)合因素AD 動(dòng)物模型是使用2 種或者2 種以上的因子聯(lián)合作用，以更全面地模擬AD 的病理改變。AD 復(fù)合模型的構(gòu)建通常使用2 種誘導(dǎo)方法，一種為短暫性、局部性的誘導(dǎo)因子，常采用腦內(nèi)注射Aβ[17]、鏈脲霉素等；另一種誘導(dǎo)方式通常為相對(duì)長(zhǎng)期性、機(jī)體整體性的作用，與AD 時(shí)程長(zhǎng)、病情嚴(yán)重的特點(diǎn)相符合，例如D-半乳糖注射衰老模型、高膽固醇飲食模型、丙烯醛誘導(dǎo)模型、金屬離子紊亂模型[18]。AD 復(fù)合模型的優(yōu)點(diǎn)是能研究多種因素在AD 發(fā)展中的作用以及因素間的相互作用關(guān)系。Morimoto 等[19]在大鼠腦內(nèi)注射β 淀粉樣蛋白25-35 或1-40 片段聯(lián)合鵝膏蕈氨酸，觀察到海馬區(qū)神經(jīng)元大量丟失和Aβ 沉積，膠質(zhì)細(xì)胞活化。Laurent 等[20]用β 淀粉樣蛋白聯(lián)合2 價(jià)鐵離子導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加、記憶能力降低。

在AD 病理學(xué)中，認(rèn)知功能障礙是典型的行為學(xué)變化[21-22]。腦內(nèi)Aβ1-42是構(gòu)成老年斑的核心病理學(xué)分子[23-24]。本實(shí)驗(yàn)以雄性樹鼩為研究對(duì)象，通過海馬內(nèi)注射Aβ25-35、皮下注射D-gal 和聯(lián)合給藥三種方式，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖、Aβ25-35和D+A 組樹鼩均出現(xiàn)認(rèn)知功能損傷，觀察到大腦皮層和海馬中Aβ1-42蛋白的表達(dá)增加。表明D-半乳糖、Aβ25-35單獨(dú)和聯(lián)合作用均能誘導(dǎo)樹鼩AD 樣病理改變。相對(duì)于單因子誘導(dǎo)，D-半乳糖和Aβ25-35復(fù)合因素誘導(dǎo)，樹鼩認(rèn)知障礙和分子病理學(xué)特征更顯著，是更為合適的樹鼩AD 造模方式，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化和豐富了樹鼩AD 模型。