布魯菌核酸檢測診斷凝集試驗陰性的布魯菌病的探討

李惠，蔡麗麗，徐建玲，徐艷春，付宇

（1.大慶市第二醫(yī)院檢驗科，黑龍江 大慶 163461；2.大慶市第二醫(yī)院感染科，黑龍江 大慶 163461；3.大慶油田總醫(yī)院，黑龍江 大慶 163001）

布魯菌是一類人畜共患病病原體，布魯氏感染（布?。┧斐傻奈：κ请p重的，既影響人的身體健康，又影響畜牧業(yè)發(fā)展，并可造成嚴重的經(jīng)濟損失。人患此病常因誤診誤治而轉(zhuǎn)成慢性，反復發(fā)作，長期不愈[1-4]。而在目前實驗室為臨床提供診斷布魯菌感染的檢測方法有病原體的分離培養(yǎng)和鑒定、血清學檢測等。由于布魯菌進入人體后，被中性粒細胞和巨噬細胞吞噬，成為胞內(nèi)寄生菌。在感染早期采血分離單個核細胞，應用熒光PCR檢測技術進行檢測以提高檢出率。期望給診斷困難的疑似布魯菌病患者提供可靠的診斷依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本 97份血液標本，其中布魯菌臨床陽性病人單個核細胞液標本30份，健康對照單個核細胞液32份，待測組病人單個核細胞液標本35份，上述陽性及待測標本均來自我院門診及住院就診患者，健康對照標本選自市區(qū)健康體檢者。標本采用EDTA抗凝，分離單個核細胞，-20 ℃冷凍保存，分批檢測。

1.1.2 試劑 引物與探針、UGD酶、Taq酶、dNTP試劑盒由北京旌準醫(yī)療科技有限公司提供。

1.1.3 儀器 上海宏石全自動PCR分析儀、旋渦混合器、生物安全柜、干式恒溫儀、高速冷凍離心機、96孔PCR板。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理和核酸提取 采用商品化的核酸提取試劑盒，使用天根生化科技有限公司核酸提取試劑（YDP304-03，體外診斷試劑備案號；京海械備20160019）直接從外周血單個核細胞中提取核酸。

1.2.2 PCR擴增程序 UDG酶反應37 ℃×2 min；預變性95 ℃×5 min；變性94 ℃×15 s熒光信號采集94 ℃×35 s；熒光循環(huán)次數(shù)45。

1.2.3 試驗結果的讀取 基線的起始點設定在6，終止點設定在12，閾值線設定在0.12，測得樣本的Ct值。

1.2.4 質(zhì)量控制 試劑盒自帶內(nèi)標，陰性及陽性質(zhì)控品。

2 結果

2.1 內(nèi)標 所有反應孔內(nèi)標通道出現(xiàn)S型曲線，Ct值≤35。

2.2 陰性質(zhì)控品 靶基因通道無S型曲線。

2.3 陽性質(zhì)控品 靶基因通道有S型擴增曲線，測定范圍Ct值≤35。

2.4 97份標本，其中臨床診斷布病陽性病人標本30例，熒光PCR檢測結果陽性19例，陽性率為63.3%，PCR結果與RBPT符合率為46.7%，與SAT符合率為46.7%；健康對照32人熒光PCR陰性32例，符合率100.0%，與血清學檢測結果符合率100.0%；臨床觀察待檢35例病人熒光PCR陽性7例，陽性率為20.0%，PCR結果與RBPT符合率為20.0%。見表1。

3 討論

本研究所采用的基于TaqMan探針布魯氏菌實時熒光定量PCR方法，對不同的臨床樣本進行檢測，結果顯示所采用的熒光PCR的敏感性、特異性在疾病的早期診斷上優(yōu)于實驗室血清學檢測，對于早期感染患者的確診具有十分重要的作用。該方法適用于檢測布魯氏菌病早期血培養(yǎng)或凝集試驗陰性的患者，可用于臨床上布魯氏菌病早期感染的診斷。

表1 97份單個核細胞液熒光PCR檢測結果與血清學測試結果比較