植物細(xì)胞分裂素orthoTopolin Riboside對人白血病細(xì)胞株THP1的抗癌活性及機(jī)制初探

(大連理工大學(xué)生命與醫(yī)藥學(xué)院,遼寧盤錦 124221)

白血病是一類造血干細(xì)胞異常引起的克隆性惡性疾病,由于克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在骨髓、外周血和其他造血組織中大量增生積聚,并浸潤其他器官及組織,而使正常造血系統(tǒng)受到抑制[1]。急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是成年人中最常見的白血病類型之一,約占成人急性白血病的80%左右。該病具有起病急,病情發(fā)展迅速,發(fā)病率隨著年齡的增加而增加的特點(diǎn)[2]。目前傳統(tǒng)的治療仍以化療為主,但仍存在各種并發(fā)癥以及化療藥物的骨髓抑制,神經(jīng)毒性等副作用[3-4]。因此,尋找有效提高治療效率,毒副作用小的藥物來治療AML仍然十分必要。

細(xì)胞分裂素(cytokinin)是20世紀(jì)50年代被發(fā)現(xiàn)的一類植物激素。天然存在的細(xì)胞分裂素是腺嘌呤衍生物,由其嘌呤N6位置上的H被其它基團(tuán)取代而形成,存在形式包括:堿基、腺苷、腺苷-5-磷酸、3-,7-,9-,O-糖苷和氨基結(jié)合物等,活性因側(cè)鏈的長度、不飽和度不同而有很大差異。細(xì)胞分裂素在植物的生長發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用,如:促進(jìn)芽的形成與生長,延緩葉片衰老,促進(jìn)芽的形成與生長,調(diào)節(jié)植物頂端優(yōu)勢等[5-6]。以往對細(xì)胞分裂素的研究主要集中在調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育中,其藥用價(jià)值卻一直被忽略。近年來,腺苷類細(xì)胞分裂素表現(xiàn)出的抗腫瘤活性逐漸引起了腺苷類藥物研發(fā)工作者的注意。如N6-(2-Hydroxyethyl)adenosine可通過抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB報(bào)告基因的表達(dá)來抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖[7];Kinetinriboside通過周期阻滯抑制直腸癌HCT-15細(xì)胞和黑色素瘤的增殖[8-9],在靶向誘導(dǎo)急性髓性白血病干細(xì)胞的凋亡的同時(shí)對正常造血干細(xì)胞沒有損傷[10],可通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白和caspase凋亡蛋白等誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡[11];N6-benzyladenosin可通過抑制周期蛋白依賴激酶2(CDK2)抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[12];N6-isopentenyladenosine可通過上調(diào)NK細(xì)胞活化性受體NKG2D和周期阻滯抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[13],可通過影響Akt/NF-κB通路抑制人乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞和人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖和凋亡[14-15]等。以上報(bào)道表明腺苷類細(xì)胞分裂素具有潛在的抗腫瘤藥用價(jià)值,但其作用機(jī)制仍處于初步研究階段。因此進(jìn)一步探究其分子作用機(jī)制對新型腺苷類藥物的開發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和理論價(jià)值。

oTR是楊柳科健楊樹葉受光照影響合成的一種腺苷類細(xì)胞分裂素(圖1)[16-17],在目前已知天然腺苷類細(xì)胞分裂素中,oTR對人的9大瘤系60種腫瘤細(xì)胞系(NCI60)顯示出最強(qiáng)的體外增殖抑制活性,且在抗腫瘤藥物高通量體內(nèi)篩選模型-中空纖維模型中,oTR對NCI60中的12種腫瘤細(xì)胞均無急性毒性反應(yīng)[18],以上結(jié)果提示oTR具有巨大的抗腫瘤藥物研發(fā)價(jià)值。然而迄今為止,oTR對AML的研究尚未見報(bào)道。

圖1 oTR化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of oTR

本研究以人白血病細(xì)胞株THP-1為研究對象,初步探討oTR對THP-1細(xì)胞的抗腫瘤活性及作用機(jī)制,為天然植物來源的核苷類藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

THP-1細(xì)胞株 北京協(xié)和細(xì)胞庫;胎牛血清、青霉素/鏈霉素、CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒 上海生工生物工程有限公司;RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基 美國Gibco公司;細(xì)胞凋亡染色試劑盒、瑞氏吉姆薩染液 碧云天生物技術(shù)公司;N6-2-芐胺羥基腺苷(ortho-Topolin Riboside,oTR) 青島騰龍微波科技有限公司;阿糖胞苷Ara-C、CD11b-PE熒光抗體 美國BioLegend公司;腺苷A1受體拮抗劑DPCPX、腺苷A2A受體拮抗劑SCH58261、腺苷A2B受體拮抗劑MRS1754、腺苷A3受體拮抗劑MRS1191、核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑 Dipyridamole Sigma公司。

Thermo 371二氧化碳培養(yǎng)箱、3001酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司;L2-4K臺式低速離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司;DMI 4000B萊卡倒置熒光顯微鏡 德國Leica公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國Becton Dickinson公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 106個(gè)THP-1細(xì)胞浮于含有10%滅活胎牛血清,含青霉素100 kU/L,鏈霉素100 mg/L的無菌RPMI 1640培養(yǎng)液中,置于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在37 ℃,5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞長至70%～80%左右傳代1次。

1.2.2 藥物配制 0.3、1.5、15和30 μmol/L的陽性對照藥物Ara-C用1640培養(yǎng)基溶解,相同濃度的oTR用0.1% DMSO助溶后用培養(yǎng)基稀釋到所需濃度,過濾除菌,室溫保存?zhèn)溆?。DPCPX、SCH58261、MRS1754、MRS1191和Dipyridamole用0.1% DMSO溶解,使終濃度達(dá)到10 μmol/L,室溫保存。

1.2.3 通過CCK-8法和形態(tài)學(xué)觀察oTR對THP-1細(xì)胞的增殖抑制作用 接種104個(gè)/孔THP-1細(xì)胞于96孔板,每孔0.1 mL,實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組、0.1% DMSO組以及不同濃度的Ara-C或oTR處理組,每組各4個(gè)復(fù)孔,藥物終濃度分別為0.3、1.5、15、30 μmol/L。藥物作用48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液作用2 h,用酶標(biāo)儀在波長490 nm處讀取光密度值(OD值),計(jì)算不同濃度Ara-C或oTR對細(xì)胞的增殖抑制率[19]。并選擇接近IC50值的oTR濃度(0.3和1.5 μmol/L)作用細(xì)胞,通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.4 通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板觀察oTR對細(xì)胞增殖數(shù)目的影響 接種104個(gè)/孔THP-1細(xì)胞于96孔板,每孔0.1 mL,實(shí)驗(yàn)設(shè)置對照組、0.1% DMSO組以及不同濃度的oTR處理組,每組各4個(gè)復(fù)孔,藥物終濃度分別為0.3、1.5 μmol/L。藥物作用48 h后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.5 通過核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑觀察oTR進(jìn)入細(xì)胞的途徑 接種104個(gè)/孔THP-1細(xì)胞于96孔板,每孔0.1 mL,用核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑(10 μmol/L Dipyridamole)孵育2 h后,加入1.5 μmol/L oTR及0.1% DMSO對照組,作用48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液作用2 h,用酶標(biāo)儀在波長490 nm處讀取光密度值(OD值),通過細(xì)胞增殖活性結(jié)果觀察上述拮抗劑是否對oTR引起的細(xì)胞增殖抑制有逆轉(zhuǎn)作用,如果可逆轉(zhuǎn)說明oTR通過核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)胞。

1.2.6 通過腺苷受體拮抗劑觀察oTR進(jìn)入細(xì)胞的途徑 接種104個(gè)/孔THP-1細(xì)胞于96孔板,每孔0.1 mL,分別用10 μmol/L腺苷受體拮抗劑(A1受體拮抗劑DPCPX、A2A受體拮抗劑SCH58261、A2B受體拮抗劑MRS1754、A3受體拮抗劑MRS1191)孵育2 h后,加入1.5 μmol/L oTR及0.1% DMSO對照組作用48 h,檢測方法同后1.2.4。如果可逆轉(zhuǎn)說明oTR通過腺苷受體進(jìn)入細(xì)胞。

1.2.7 PI染色法檢測oTR對THP-1細(xì)胞亞倍體凋亡峰的影響 將106個(gè)/孔THP-1細(xì)胞密度接種至六孔板中,選擇接近IC50值的oTR濃度(0.3、1.5 μmol/L)作用細(xì)胞,48 h后收集未加藥對照組和藥物處理組細(xì)胞,PBS緩沖液洗一遍,用70%乙醇固定過夜后再用PBS洗一次,按DNA含量檢測試劑盒配制染色緩沖液,將上述所收集的細(xì)胞加入500 μL染色緩沖液37 ℃避光孵育30 min,用PBS洗一次后用300目篩網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測[20]。

1.2.8 Wright-Giemsa(瑞氏吉姆薩)染色觀察oTR對THP-1細(xì)胞分化狀態(tài)的影響 將106個(gè)/孔THP-1細(xì)胞密度接種至6孔板中,選擇作用后細(xì)胞形態(tài)較為完整的1.5 μmol/L oTR處理THP-1細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞,PBS緩沖液洗一遍并重懸,將重懸細(xì)胞液通過臺式低速離心機(jī)甩板機(jī)以2000 r/min離心10 min,以便將細(xì)胞均勻固定在干凈的載玻片上,將載玻片從甩板離心機(jī)中取出并室溫晾干,滴加Wright-Giemsa染液于載玻片上,室溫染色1～2 min滴加等量的0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液,輕輕晃動(dòng)玻片,與瑞氏-姬姆薩染液充分混勻,室溫染色15 min,顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核形態(tài)變化[21]。

1.2.9 通過細(xì)胞表面分化抗原CD11b檢測oTR對THP-1細(xì)胞分化能力的影響 將106個(gè)/孔THP-1細(xì)胞密度接種至6孔板中,選擇作用后細(xì)胞形態(tài)較為完整的1.5 μmol/L oTR處理THP-1細(xì)胞,48 h后收集細(xì)胞,PBS緩沖液洗一遍并重懸。向?qū)φ战M和oTR處理組加入封閉抗體,用渦旋器輕輕震蕩混合均勻,室溫條件下,孵育15 min后分別向兩組細(xì)胞中加入2 μL CD11b-PE熒光抗體,用渦旋器輕輕震蕩混合均勻,室溫條件下,避光孵育30 min[21]。用1×PBS緩沖液洗滌染色細(xì)胞1次,去除多余的熒光試劑,減少上機(jī)背景雜質(zhì),加500 μL 1×PBS重懸細(xì)胞后流式細(xì)胞分選儀上機(jī)檢測細(xì)胞表面CD11b分化抗原表達(dá)量的變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±SD形式表示,顯著性差異分析用SPSS 11.5軟件進(jìn)行。*P<0.05為顯著,**P<0.01為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 oTR和Ara-C對THP-1細(xì)胞活性的抑制作用

分別用不同濃度(0.3、1.5、15和30 μmol/L)Ara-C或oTR處理THP-1細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)相同濃度下,oTR作用后,細(xì)胞活性受到顯著性抑制(P<0.01或P<0.001),抑制強(qiáng)度比Ara-C更高(圖2),以上結(jié)果表明oTR比陽性對照物Ara-C具有更強(qiáng)的細(xì)胞活性抑制作用。

圖2 相同濃度下oTR和陽性對照藥物Ara-C對THP-1細(xì)胞增殖活性的抑制作用Fig.2 Inhibition of proliferation effects on THP-1 cells ofoTR and positive control drug Ara-C at the same concentration注:“*”表示與對照組相比,差異顯著,P<0.05,“**差異極顯著,P<0.01,“***”表示差異極其顯著,P<0.001;圖4～圖5同。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察oTR對THP-1細(xì)胞形態(tài)的影響

選取接近IC50值的oTR濃度(0.3和1.5 μmol/L)作用細(xì)胞后,通過光學(xué)顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),與對照組相比,oTR處理后引起細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞體積變小,大小不均一,細(xì)胞膜皺縮,折光性減弱(圖3),以上結(jié)果表明oTR可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的凋亡或壞死。

圖3 光學(xué)顯微鏡觀察不同濃度oTR處理THP-1細(xì)胞48 h后的形態(tài)變化Fig.3 Changes in cell morphology after incubation with of oTR for 48 h

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察oTR對THP-1細(xì)胞的增殖抑制作用

用不同濃度梯度的oTR作用細(xì)胞不同時(shí)間后,通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)與對照組相比,oTR處理組的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖4),以上結(jié)果表明oTR抑制THP-1細(xì)胞的增殖。

圖4 不同濃度oTR處理THP-1細(xì)胞不同天數(shù)后的細(xì)胞數(shù)目變化Fig.4 Cell number of THP-1 cells treatedby different concentrations of oTR

2.4 腺苷受體拮抗劑和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑對oTR引起的THP-1細(xì)胞活性抑制的逆轉(zhuǎn)作用

目前核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體主要有兩類,即平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(equilibrative nucleoside transporter,ENT)和濃度型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(concentrative nucleoside transporter,CNT),ENT介導(dǎo)核酸的順濃度差的易化擴(kuò)散,速度快。而CNT消耗能量ATP,介導(dǎo)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程,速度較慢。腺苷受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs))超家族,廣泛分布于人體組織中[22]。腺苷受體是重要的藥物靶標(biāo)近年來,越來越多的腺苷受體拮抗劑被相繼報(bào)道,但大部分腺苷受體拮抗劑顯示出選擇性差的特點(diǎn)[23]。因此,在開發(fā)新的抗腫瘤藥物中需要對其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制有充分的認(rèn)識,可為提高藥物的抗癌效果和研究癌細(xì)胞耐藥機(jī)制提供一定的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)用4種腺苷受體拮抗劑(DPCPX、SCH58261、MRS1754、MRS1191)和核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑(Dipyridamole)分別預(yù)孵育THP-1細(xì)胞2 h后,用1.5 μmol/L oTR繼續(xù)作用THP-1細(xì)胞,觀察拮抗劑是否逆轉(zhuǎn)oTR對細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與oTR單獨(dú)作用相比,4種腺苷受體拮抗劑作用效果無顯著差異(圖5A),但核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑Dipyridamole可明顯逆轉(zhuǎn)THP-1細(xì)胞的增殖抑制作用(圖5B)。以上結(jié)果表明,oTR通過核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體途徑進(jìn)入細(xì)胞而不是腺苷受體途徑。

圖5 腺苷受體拮抗劑(A)與核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體拮抗劑(B)對oTR作用細(xì)胞后的逆轉(zhuǎn)效果Fig.5 Reversal effect treated by the presence of adenosinereceptor antagonists(A)and nucleoside transporter antagonist(B)

2.5 oTR對THP-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

細(xì)胞死亡有毒性和凋亡兩種情況。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),由于胞漿和染色質(zhì)濃縮,核裂解,產(chǎn)生凋亡小體,使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。因此可通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞光散射的變化來觀察凋亡細(xì)胞[24]。用PI對細(xì)胞進(jìn)行染色后,凋亡細(xì)胞由于總DNA量降低,于正常G0/G1細(xì)胞群前出現(xiàn)DNA低染細(xì)胞群,即G1峰前出現(xiàn)亞二倍體峰(sub-G1),即細(xì)胞凋亡群。分別用0.3和1.5 μmol/L oTR處理THP-1細(xì)胞48 h后,用PI染色流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),與對照組(1.21%)相比,oTR處理組(3.7%和19.23%)THP-1細(xì)胞出現(xiàn)明顯的亞二倍體峰(圖6)。以上結(jié)果表明oTR可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖6 oTR對THP-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用Fig.6 Effects of apoptosis ofTHP-1 treated by oTR

2.6 oTR對導(dǎo)THP-1細(xì)胞的分化誘導(dǎo)作用

選擇作用后細(xì)胞形態(tài)較為完整的1.5 μmol/L oTR處理THP-1細(xì)胞48 h后進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色,發(fā)現(xiàn)與對照組相比較,oTR處理組細(xì)胞核質(zhì)比減小,細(xì)胞核呈腎形或馬蹄狀(圖7)。CD11b是細(xì)胞粘附分子整合素家族成員之一[25],成熟的單核細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和所有的粒細(xì)胞的細(xì)胞表面都有表達(dá)CD11b,不同成熟階段的髓細(xì)胞表達(dá)CD11b的量有所差別[26]。如:骨髓中的早幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞、晚幼粒細(xì)胞和外周血中的成熟粒細(xì)胞通?？赏ㄟ^CD11b陽性程度來區(qū)別,越成熟的細(xì)胞,表達(dá)CD11b的量越多,CD11b陽性率也越高。一般情況下,髓系白血病細(xì)胞均表達(dá)CD11b,但表達(dá)CD11b的量有所差異,分化程度越低的白血病細(xì)胞表達(dá)CD11b的量越低,因此,可以用CD11b來表示白血病細(xì)胞的分化程度[27]。通過用流式細(xì)胞分析儀分析發(fā)現(xiàn),相對于對照組,oTR處理組細(xì)胞表面CD11b相對表達(dá)量顯著增高(圖8),以上結(jié)果提示oTR能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞分化更為成熟的粒細(xì)胞。

圖7 瑞氏-吉姆薩染色觀察oTR對THP-1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用Fig.7 Morphological changes when cellstreatedwith oTR after staining with Wright-Giemsa

圖8 oTR對THP-1細(xì)胞表面CD11b表達(dá)的影響Fig.8 Effects of oTR on the expression ofCD11b in THP-1 cells

3 結(jié)論

本研究以尋找天然抗癌藥物為出發(fā)點(diǎn),研究oTR對人急性髓性白血病細(xì)胞株THP-1的抗腫瘤活性及其跨膜進(jìn)入細(xì)胞的方式。研究結(jié)果表明,用oTR處理THP-1細(xì)胞后細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制,且相同濃度的oTR比陽性對照藥物Ara-C抑制效果更明顯。用oTR誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞亞二倍體峰比例明顯升高,說明oTR可誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的凋亡,且oTR處理后細(xì)胞表面CD11b相對表達(dá)量明顯增高,以上結(jié)果提示oTR能夠促進(jìn)THP-1細(xì)胞的髓系分化。在研究oTR進(jìn)入細(xì)胞的途徑方面,本研究初步以核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體(濃度依賴型)和腺苷受體家族為研究對象,發(fā)現(xiàn)封閉腺苷受體家族后并沒有逆轉(zhuǎn)oTR對THP-1細(xì)胞的增值抑制作用;然而封閉核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體后,可以部分恢復(fù)THP-1的細(xì)胞活性。以上結(jié)果表明,oTR通過核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體途徑進(jìn)入細(xì)胞而不是腺苷受體途徑。本研究結(jié)果有望為新型腺苷類抗腫瘤藥物提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。