干酪乳桿菌yhaI基因敲除菌株的構(gòu)建及其耐藥表型的分析

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(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué),國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心,黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院,黑龍江哈爾濱 150030;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域內(nèi),抗生素被廣泛使用,導(dǎo)致細(xì)菌在抗生素應(yīng)激環(huán)境中進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化,逐漸適應(yīng)環(huán)境,最終使得抗生素失去效果。因此,抗生素耐藥性成為了全球關(guān)注熱點[1]?，F(xiàn)在有大量關(guān)于抗生素抗性機(jī)制和致病菌在抗生素環(huán)境下基因組穩(wěn)定性的研究[2]。制定一個防治抗生素耐藥性傳播的方法至關(guān)重要[3],其最好的方法是尋找一個可以替代或者輔助的藥物從而減少抗生素的使用[4]。目前,益生菌聯(lián)合抗生素被用于治療胃腸道疾病,并且在臨床上取得一定療效[5]。人們對益生菌在改善人類健康和臨床實踐中的應(yīng)用越來越重視[6],益生菌在長期接觸抗生素環(huán)境中產(chǎn)生的適應(yīng)性進(jìn)化成為了主要研究內(nèi)容[7]。

表1 本實驗所用引物Table 1 Primers used in this study

注：a引物中添加的限制性內(nèi)切酶序列由下劃線標(biāo)出。

目前有大部分關(guān)于致病菌在抗生素環(huán)境中進(jìn)化機(jī)制的研究,對乳酸菌適應(yīng)機(jī)制的研究較少。而且有文獻(xiàn)報道關(guān)于乳酸菌通過點突變可以獲得抗生素耐藥性[8]。所以,在適應(yīng)性進(jìn)化過程中發(fā)生的點突變也不應(yīng)該被忽視[9]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)是分析在不同培養(yǎng)條件下,細(xì)胞之間的功能差異的最好的方法之一[10]。然而基因敲除技術(shù)又是研究基因功能最有效的方法之一,它依據(jù)同源重組理論,通過構(gòu)建帶有同源序列的基因敲除載體,將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞,取代野生型的等位基因,最后通過分析突變體的表型從而確定基因功能[11]。

課題組前期研究結(jié)果顯示,干酪乳桿菌Zhang在適應(yīng)抗生素環(huán)境過程中的耐藥表型有所變化,基因組相對穩(wěn)定[12]。與干酪乳桿菌Zhang相比,1200代適應(yīng)性進(jìn)化菌株的yhaI基因顯著上調(diào),可能與菌株的耐藥表型有關(guān)[13]。為了深入研究yhaI基因是否與耐藥表型相關(guān),本研究采用Cre/lox基因重組技術(shù)將其敲除,并對突變體的表型進(jìn)行驗證。本研究成功的構(gòu)建干酪乳桿菌Zhang的基因敲除技術(shù),并且進(jìn)一步鑒定yhaI基因?qū)Ω衫胰闂U菌Zhang適應(yīng)慶大霉素環(huán)境的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

在慶大霉素中連續(xù)培養(yǎng)1200代的干酪乳桿菌Zhang[14]內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室提供;大腸桿菌DH5α[15]澤生生物有限公司;pNZ5319質(zhì)粒[16]荷蘭瓦格寧根大學(xué)惠贈;pMSPcre質(zhì)粒[17]山東大學(xué)孔健教授惠贈;高保真TransStart?FastPfuDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公式;限制性內(nèi)切酶、T4連接酶 美國New England Biolabs公司;紅霉素(Ery)、氯霉素(Cm) 購自美國Sigma公司;實驗所用引物 根據(jù)GenBank報道yhaI的基因序列(GenBank accession number CP001084.2)使用Primer premier 5.0軟件分別設(shè)計長度為1 kb左右的上、下游同源臂引物(表1) 上海桑尼生物科技有限公司。

2720 Thermal Cycler PCR儀 購自美國Applied Biosystems公司;DYY-12電泳儀 購自北京六一電子儀器廠;凝膠成像系統(tǒng) 購自美國UVP公司;MicroPulser TM電擊儀 購自美國BIO-RAD;DU800分光光度計 美國BECKMA。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌和大腸桿菌的培養(yǎng)條件 乳酸菌用MRS固體培養(yǎng)基,添加的紅霉素終濃度為5 μg/mL,氯霉素終濃度為10 μg/mL;使用前需濾菌(0.22 μm孔徑濾膜),培養(yǎng)溫度為37 ℃。

大腸桿菌的培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基紅霉素或氯霉素在培養(yǎng)基中的終濃度分別為250和10 μg/mL;37 ℃、300 r/min搖床培養(yǎng)。

1.2.2 目的基因同源臂擴(kuò)增及敲除載體的構(gòu)建

1.2.2.1 目的基因同源臂擴(kuò)增 PCR反應(yīng)以L.caseiZhang-G-1200基因組為模板,利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)進(jìn)行基因組的提取,然后利用高保真TransStart?FastPfuDNA Polymerase擴(kuò)增出yhaI基因上下游各約1000 bp的片段,擴(kuò)增引物為yhaI upF/R、yhaI downF/R(表1)。PCR反應(yīng)體系為50 μL:模板DNA 1.5 μL,上下游引物各1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,5×TransStart?FastPfuBuffer 10 μL,高保真聚合酶0.5 μL,ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.2.2.2 敲除載體pNZ5319-yhaIUp-Down的構(gòu)建和克隆 將純化后的上、下游同源臂片段分別插入到pNZ5319質(zhì)粒的XohI、PemI和Eco53kI、BglII酶切位點中。42 ℃轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行克隆,用氯霉素(10 μg/mL)在LB平板上篩選陽性克隆。用引物yhaI upF、85R和87F、yhaI downR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,送樣于上海桑尼公司進(jìn)行測序,驗證插入序列的正確性。

1.2.3 乳酸菌感受態(tài)的制備和敲除載體的電轉(zhuǎn)化

1.2.3.1 乳酸菌感受態(tài)的制備 將活化2代后的乳桿菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)12 h;按2%接種量接種到溶液I(MRS+0.75 mol/L山梨醇+0.1%甘氨酸)中,37 ℃培養(yǎng)至OD值0.3～0.6;6000 r/min 4 ℃離心5 min,收集3 mL菌體細(xì)胞;用1 mL預(yù)冷的溶液II(1 mol/L蔗糖+3.5 mmol/L MgCl2·6H2O)洗滌細(xì)胞,6000 r/min 4 ℃離心5 min,去除上清液,反復(fù)洗滌3次;用40 μL冰浴的溶液II重懸菌體細(xì)胞,用于電轉(zhuǎn)化乳桿菌。

1.2.3.2 敲除載體的電轉(zhuǎn)化 取無菌電轉(zhuǎn)化杯冰上預(yù)冷10 min;取40 μL冰浴的感受態(tài)細(xì)胞懸浮液,加入1 μg上述1.2.2.2構(gòu)建好的載體質(zhì)粒DNA,吹吸混勻,冰浴10 min;轉(zhuǎn)移混合液至電轉(zhuǎn)化杯,冰浴10 min。設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù):干酪乳桿菌參數(shù)為電壓1.7 kV(2 mm電極杯),電阻200 Ω,電容為25 μF。將電轉(zhuǎn)化杯迅速擦干,放入電擊槽中,進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化;向轉(zhuǎn)化后的電轉(zhuǎn)化杯中加入960 μL預(yù)冷的復(fù)蘇液(MRS+0.75 mol/L山梨醇+10 mmol/L CaCl2+100 mmol/L MgCl2),冰上放置5 min;將液體移入無菌Eppendorf管中,37 ℃靜止培養(yǎng)3 h,將細(xì)胞涂布到含有5 μg/mL氯霉素的MRS固體平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子。感受態(tài)細(xì)胞要現(xiàn)用現(xiàn)制備。

1.2.4 雙交換子L.caseiZhang-G-1200-yhaI::lox66-P32-cat-lox71的篩選 挑取多個單菌落活化于含氯霉素(10 μg/mL)的MRS培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后分別接種在氯霉素(10 μg/mL)和紅霉素(5 μg/mL)MRS培養(yǎng)基中,篩選具有氯霉素抗性無紅霉素抗性的重組子,同時將原始菌株L.caseiZhang-G-1200分別接種于含氯霉素和紅霉素的MRS培養(yǎng)基中作為對照。將篩選到的有氯霉素抗性無紅霉素抗性的重組子(雙交換子)和原始菌株分別用5對引物(yhaI upF/yhaI downR、EryintF/EryintR、CatF/CatR、yhaI upF/CatR和CatF/yhaI downR)擴(kuò)增,電泳比較PCR產(chǎn)物條帶大小并將后者送到上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序驗證。

1.2.5 突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI的構(gòu)建 通過電轉(zhuǎn)化的方法將pMSPcre轉(zhuǎn)入以上篩選到的氯霉素抗性雙交換子中。涂布于含紅霉素的MRS平板上,37 ℃培養(yǎng)48～72 h。篩選出具紅霉素抗性無氯霉素抗性的菌株。將以上篩選的菌株在無抗生素培養(yǎng)基中37 ℃連續(xù)傳10代使pMSPcre丟失,進(jìn)行PCR驗證。PCR所用引物為EryintF/EryintR、CreF/CreR和CatF/CatR,以傳代之前菌為對照。同時將篩選到的突變株再次用同源臂引物yhaI upF/yhaI downR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,送到上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序驗證。

1.2.6 突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI耐藥表型分析 采用稀釋法[18]測定突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI對慶大霉素的最小抑制濃度,以及在不同濃度的慶大霉素環(huán)境下,突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI的活菌數(shù)、濁度和pH,以原始菌株為對照。從而分析突變株與野生型生長特性的差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體pNZ5319-yhaI Up-Down的構(gòu)建

將在含有氯霉素(10 μg/mL)的LB平板上篩選的陽性克隆體進(jìn)行PCR驗證。泳道1、2分別用引物yhaI upF、yhaI upR和yhaI upF、85R擴(kuò)增,泳道3、4分別用引物yhaI downF、yhaI downR和 87F、yhaI downR擴(kuò)增,每對擴(kuò)增產(chǎn)物大概差異200 bp左右。結(jié)果如圖1所示,電泳結(jié)果與預(yù)期一致,說明前后臂已經(jīng)成功插入pNZ5319質(zhì)粒。并且測序結(jié)果說明各序列均正確。載體pNZ5319-yhaI Up-Down成功構(gòu)建。

圖1 敲除載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of knockout vectors注:M:marker;泳道1代表用引物yhaI upF、85R對載體pNZ5319-yhaI Up-Down進(jìn)行擴(kuò)增;泳道2代表用引物yhaI upF、yhaI upR對載體pNZ5319-yhaI Up-Down進(jìn)行擴(kuò)增;泳道3代表用引物87F、yhaI downR對載體pNZ5319-yhaI Up-Down進(jìn)行擴(kuò)增;泳道4代表用引物yhaI downF、yhaI downR對載體pNZ5319-yhaI Up-Down進(jìn)行擴(kuò)增的電泳圖。

2.2 基因敲除載體的電轉(zhuǎn)化

將敲除載體pNZ5319-yhaI Up-Down經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化L.caseiZhang-G-1200,涂布于含氯霉素(10 μg/mL)和紅霉素(5 μg/mL)MRS培養(yǎng)基中,篩選出5個含有氯霉素抗性無紅霉素抗性的雙交換子。用引物yhaI upF/yhaI downR、EryintF/EryintR、CatF/CatR、yhaI upF/CatR和CatF/yhaI downR進(jìn)行驗證,原始菌株和pNZ5319質(zhì)粒為對照。由圖2可以看出,只有質(zhì)粒有紅霉素基因,所以只有泳道2有條帶;氯霉素基因只有原始菌株沒有,所以泳道9沒有條帶,泳道10～15本應(yīng)該都有條帶,但可能因為特異性差所以未出現(xiàn)條帶;在質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化子中用前臂F,Cat R及Cat F和后臂R引物擴(kuò)增均出現(xiàn)條帶,如泳道17～22和25～30所示,說明Cat基因片段確實已經(jīng)連入目的基因的前后臂中;由于在質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化子中較原始菌株多了氯霉素抗性基因片段(所加入的包含氯霉素抗性基因在內(nèi)的片段>所敲除的目的基因片段),因此質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化子中的全長片段要大于原始菌株,如泳道31～37所示。結(jié)果與預(yù)期的一致,并且測序結(jié)果顯示各序列均正確。成功的篩選到雙交換子。

2.3 突變株L. casei Zhang-G-1200-yhaI的構(gòu)建

將pMSPcre質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入上述的雙交換子中,涂布含紅霉素的MRS平板上,篩選出具有紅霉素抗性沒有氯霉素抗性的菌株。并在無抗生素的培養(yǎng)基中連續(xù)傳10代使pMSPcre質(zhì)粒丟失。用引物EryintF/EryintR、CreF/CreR、CatF/CatR和yhaI upF、yhaI downR驗證,原始菌株和質(zhì)粒為對照，驗證結(jié)果如圖3所示。在突變體中都沒有紅霉素、氯霉素和Cre基因,并且測序結(jié)果顯示各序列都正確。說明成功構(gòu)建突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI。

圖3 突變體的PCR驗證Fig.3 Mutant verified by PCR analysis注:泳道1、2為原始菌株和突變株分別用引物yhaI upF、yhaI downR的PCR產(chǎn)物,泳道3～5對應(yīng)的引物為EryintF/EryintR,泳道6～8所用引物為CatF/CatR,泳道9～11引物為CreF/CreR,它們所對應(yīng)的模板分別為質(zhì)粒(泳道3、6、9),原始菌株(泳道4、7、10)和突變體(泳道5、8、11)。

2.4 突變株L. casei Zhang-G-1200-yhaI的耐藥表型的分析

對突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI進(jìn)行慶大霉素耐藥性分析,并且對其在不同慶大霉素濃度中的生長特性進(jìn)行檢測,以原始菌株為對照。結(jié)果如圖4所示,突變株L.caseiZhang-G-1200-yhaI在正常培養(yǎng)基中生長時,和野生型菌株活菌數(shù)、濁度和pH都沒有差異,在慶大霉素濃度為8和16 μg/mL時,原始菌株的OD值是突變株的2倍左右,在慶大霉素濃度為16 μg/mL時,突變株的活菌數(shù)是原始菌株的7/10。pH也在慶大霉素濃度為16 μg/mL時不同,因為突變株在該濃度下,抑制細(xì)菌的生長繁殖,所以pH大于原始菌株。所以我們認(rèn)為yhaI基因與干酪乳桿菌Zhang的耐藥性相關(guān)。

圖4 突變體在不同慶大霉素濃度下的生長特性Fig.4 Growth characteristics of mutantsat different gentamycin concentrations 注:a:pH;b:OD值;c:活菌數(shù)。

3 討論與結(jié)論

基因功能鑒定對于乳酸菌適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)理的解析至關(guān)重要[19]。基因敲除是研究基因功能最有效的研究方法。目前有研究者采用Cre/lox系統(tǒng)構(gòu)建基因敲除方法,該方法由三步組成,第一步是使用標(biāo)準(zhǔn)克隆程序構(gòu)建基因特異性誘變載體;第二步是通過雙交換重組將靶基因替換為lox66-P32-cat-lox71;第三步是通過Cre瞬時表達(dá),使靶基因位點的lox66-P32-cat-lox71形成lox72位點[16]。Cre/lox系統(tǒng)之所以在基因敲除中獲得了非常廣泛的應(yīng)用,是由該系統(tǒng)的諸多優(yōu)點決定的[20-22]:Cre重組酶與具有l(wèi)oxP位點的DNA片斷形成復(fù)合物后,可以提供足夠的能量引發(fā)之后的DNA重組過程,因此該系統(tǒng)不需要細(xì)胞或者生物體提供其他的輔助因子;loxP位點是一段較短的DNA序列,因此非常容易合成;Cre重組酶是一種比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì),因此可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發(fā)揮作用;Cre重組酶的編碼基因可以置于任何一種啟動子的調(diào)控之下,從而使這種重組酶在生物體不同的細(xì)胞、組織、器官,以及不同的發(fā)育階段或不同的生理條件下產(chǎn)生,進(jìn)而發(fā)揮作用,這一點也是該系統(tǒng)在應(yīng)用過程中最為重要的一點。

本文研究表明，yhaI基因?qū)Ω衫胰闂U菌Zhang的耐藥性具有調(diào)控作用,在慶大霉素濃度為8和16 μg/mL時,突變株的濁度是原始菌株的1/2;在慶大霉素濃度為16 μg/mL時,突變株的活菌數(shù)是原始菌株的7/10。目前,雖然對干酪乳桿菌Zhang的適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制并未明確,但是,該研究為干酪乳桿菌的適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制提供了一個新思路。