超聲生物顯微鏡評估大鼠急慢性心肌肥厚模型左心室心肌形態(tài)及功能的可行性

周 麗，魏世杰，李 晴，納麗莎，王 芳，王婷婷

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心臟中心功能部，2.藥劑科，寧夏 銀川 750004)

左心室心肌質(zhì)量增加是心血管疾病的獨立危險因素，也是心血管事件的預(yù)期指標(biāo)[1]。交感神經(jīng)興奮是心室肥厚形成與發(fā)展的重要原因。腎上腺素水平與心肌肥厚程度呈正相關(guān)。腎上腺素可用于制作與人類心肌肥厚過程類似的急性代償性及慢性病理性心肌肥厚動物模型，如皮下連續(xù)注射異丙腎上腺素(isoproterenol， ISO)可制作大鼠急性及慢性心肌肥厚模型，已廣泛用于心血管疾病發(fā)生、轉(zhuǎn)歸及療效評價等研究中[2]。目前主要采用頸動脈插管和手術(shù)解剖評價ISO動物模型左心室形態(tài)及功能，易致動物死亡而無法進行后續(xù)藥效學(xué)、藥動學(xué)等實驗研究。超聲生物顯微鏡(ultrasound biomicroscopy， UBM)是近年發(fā)展的超聲新技術(shù)，目前已逐漸用于動物實驗研究[3]。本研究觀察采用UBM測量ISO所致大鼠急性及慢性心肌肥厚模型左心室形態(tài)及功能參數(shù)的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級雄性健康SD大鼠40只，體質(zhì)量(280±20)g，動物許可證號：SCXY(寧)2018-0001，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)1周后進行實驗。將大鼠隨機分為急性心肌肥厚模型組(急性模型組)、急性對照組、慢性心肌肥厚模型組(慢性模型組)及慢性對照組，每組10只。急性模型組大鼠皮下注射ISO 85 mg/kg體質(zhì)量，1次/天，連續(xù)2天；急性對照組以相同劑量、頻次皮下注射生理鹽水；慢性模型組皮下注射ISO 5 mg/kg體質(zhì)量，1次/天，連續(xù)7天；慢性對照組以相同劑量、頻次皮下注射生理鹽水。鹽酸ISO原料藥純度>99.0%(批號：90100226)。造模過程中，急性模型組死亡2只，慢性模型組死亡1只，慢性對照組死亡1只。

1.2 儀器與方法 采用Visualsonics Vevo2100高分辨率超聲成像系統(tǒng)，MS-250探頭，頻率20 MHz。腹腔注射10%水合氯醛(0.4 ml/100 g體質(zhì)量)后，仰臥位保定大鼠于鼠板上，以8%硫化鈉溶液對胸部心前區(qū)褪毛。采用UBM觀察胸骨旁左心室長軸切面，使左心室腔盡量呈水平位，以最大化分辨率和最適圖像增益清晰顯示左心室心內(nèi)膜、心外膜，取樣線盡量垂直置于左心室前壁及后壁乳頭肌后緣水平，于二尖瓣關(guān)閉前一幀圖像測量左心室前壁厚度(left ventricular anterior wall diameter， LVAWD)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall diameter， LVPWD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter， LVEDD)及左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter， LVESD)。每只大鼠均連續(xù)測量3個心動周期，取平均值作為結(jié)果(圖1)。設(shè)備自動計算獲得左心室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volume， LVEDV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end systolic volume， LVESV)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction， LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening， LVFS)及左心室質(zhì)量。

圖1 UBM測量大鼠左心室參數(shù)

1.3 左心室質(zhì)量測量與病理學(xué)檢查 超聲測量結(jié)束后處死大鼠，迅速解剖并摘取心臟，去除心耳及周圍結(jié)締組織，分離左心室，以低溫生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干后精密天平稱重。取心尖組織置于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)切片、HE染色、鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件。對計量資料進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布、方差齊者以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。采用配對t檢驗比較UBM所測左心室質(zhì)量與解剖后精確測量左心室質(zhì)量。以直線相關(guān)分析進行相關(guān)性檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 左心室形態(tài)及功能參數(shù) 急性模型組LVAWD、LVPWD較急性對照組增加(P均<0.05)；慢性模型組較LVAWD、LVPWD、LVESD及LVESV慢性對照組增大，LVEF、LVFS降低(P均<0.05)；慢性模型組LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV較急性肥厚模型組增大，LVEF、LVFS降低(P均<0.05)。見表1。

2.2 左心室質(zhì)量 UBM所測4組左心室質(zhì)量均高于精確稱重(P均<0.05)，2種方法所測急性模型組左心室質(zhì)量均低于慢性模型組(P均<0.05)。急性對照組、急性模型組、慢性對照組、慢性模型組UBM所測左心室質(zhì)量與精確稱重均呈正相關(guān)(r=0.91、0.79、0.90、0.73，P均<0.05)。見表2。

2.3 心肌組織病理改變 對照組大鼠心肌紋理均清晰，心肌細胞排列整齊，細胞核均勻分布。急性模型組大鼠心肌細胞排列紊亂，胞漿豐富，細胞核由正常圓形或橢圓形變?yōu)殚L桿狀。慢性模型組細胞排列紊亂，心外膜可見炎細胞浸潤，心內(nèi)膜出現(xiàn)心肌細胞壞死跡象及少量成纖維細胞增生。見圖2。

3 討論

目前制作大鼠心肌肥厚模型有以下2種較常見方法[4]，即通過部分結(jié)扎主動脈增加后負(fù)荷制作壓力負(fù)荷性心肌肥厚模型，和部分結(jié)扎腎動脈制作腎性高血壓心肌肥厚模型，具有造模時間短、重復(fù)性好等優(yōu)點，應(yīng)用較為普遍，但也存在需外科手術(shù)干預(yù)、術(shù)后實驗動物死亡率高等問題。近年來激素誘導(dǎo)制作大鼠心肌肥厚模型的方法逐漸被采用。皮下注射ISO可激活腎上腺素受體，增加心肌細胞合成代謝及Ca2+超負(fù)荷。ISO作為β受體激動劑，能夠提高細胞膜L型鈣通道(L-type calcium channel， LCC)介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流幅度和同步性，通過β腎上腺素受體(β-adrenergic receptor， β-AR)-蛋白激酶A信號通路調(diào)控肌質(zhì)網(wǎng)鈣釋放通路，最終誘導(dǎo)心肌細胞體積增大、蛋白質(zhì)合成增加和肌小節(jié)重構(gòu)而導(dǎo)致左心室肥厚[5-6]。ISO誘導(dǎo)大鼠左心室肥厚模型具有制作簡單、實驗周期短、效果確切等優(yōu)點。本研究也證實該方法能夠使大鼠心肌明顯增厚，成功復(fù)制心肌肥厚模型。本研究急性模型組大鼠心腔大小無明顯變化，心功能亦能維持在正常水平，尚處于急性代償階段，病理結(jié)果顯示心肌細胞出現(xiàn)排列紊亂、細胞核增大等表現(xiàn)；慢性模型組大鼠心臟明顯增大，心功能減低，處于失代償狀態(tài)，病理示心肌細胞已出現(xiàn)壞死和纖維增生等改變。以上結(jié)果提示，急性與慢性心肌肥厚大鼠模型左心室構(gòu)型和心功能均存在差異。

表1 4組大鼠超聲心動圖所測左心室形態(tài)及功能參數(shù)比較(±s)

表1 4組大鼠超聲心動圖所測左心室形態(tài)及功能參數(shù)比較(±s)

組別LVAWD(mm)LVPWD(mm)LVEDD(mm)LVESD(mm)LVEDV(ml)LVESV(ml)LVEF(%)LVFS(%)急性對照組(n=10)0.16±0.010.15±0.010.61±0.040.40±0.031.88±0.260.73±0.1361.43±6.9833.80±4.93急性模型組(n=8)0.20±0.01?0.19±0.02?0.63±0.030.42±0.052.14±0.200.81±0.2463.90±9.7135.98±6.94慢性對照組(n=9)0.17±0.010.17±0.010.70±0.030.40±0.022.53±0.280.72±0.0971.38±3.6341.88±3.12慢性模型組(n=9)0.21±0.02#0.21±0.02#0.71±0.04Δ0.52±0.04#Δ2.65±0.33Δ1.33±0.26#Δ50.64±6.23#Δ26.73±4.02#ΔF值14.95915.27817.88619.76518.50721.48530.91022.392P值0.0470.0400.0310.0010.0380.0110.0140.026

注：*：與急性對照組比較，P<0.05；#：與慢性對照組比較，P<0.05；Δ：與慢性模型組比較，P<0.05

圖2 各組大鼠左心室心肌組織病理圖(HE，×100) A.正常對照組心肌紋理清晰，心肌細胞排列整齊，細胞核均勻分布； B.慢性模型組心肌細胞排列紊亂； C.急性模型組心肌細胞排列紊亂，胞漿豐富，細胞核為長桿狀

表2 4組大鼠UBM所測左心室質(zhì)量與精確稱重測值比較(±s)

表2 4組大鼠UBM所測左心室質(zhì)量與精確稱重測值比較(±s)

組別左心室質(zhì)量(g)UBM精確稱重t值P值急性對照組(n=10)0.86±0.040.75±0.092.3510.043急性模型組(n=8)1.04±0.03?0.86±0.09?2.6220.021慢性對照組(n=9)0.89±0.050.80±0.072.2240.041慢性模型組(n=9)1.22±0.10#Δ0.92±0.08#Δ2.9270.011F值16.78314.491——P值0.0370.042——

注：*：與急性對照組比較，P<0.05；#：與慢性對照組比較，P<0.05；Δ：與慢性模型組比較，P<0.05

利用M型、二維和三維超聲心動圖均可計算左心室質(zhì)量。理論上二維和三維方法較M型更準(zhǔn)確，但M型超聲簡單快捷，測量變異性小，準(zhǔn)確性較高，多數(shù)有關(guān)左心室質(zhì)量與預(yù)后關(guān)系的研究[7]采用該法。UBM探頭頻率高達20 MHz，分辨率較普通M型超聲顯著提高，因而能更加清晰地顯示大鼠心臟結(jié)構(gòu)，是無創(chuàng)評價活體大鼠心臟形態(tài)學(xué)變化的重要手段[8]。本研究中，對于左心室構(gòu)型正常的對照組，UBM測量左心室質(zhì)量與金標(biāo)準(zhǔn)左心室解剖稱重的相關(guān)性良好(r均>0.90)，與文獻[9]報道結(jié)果相符；但左心室壁增厚、心室重構(gòu)時，UBM測量左心室質(zhì)量與真實值的相關(guān)性下降，急性及慢性模型組r值分別為0.79和0.73。上述結(jié)果提示，雖然M型UBM具有更高的分辨率，但利用M型超聲測量左心室質(zhì)量仍需基于左心室長徑為短徑2倍的形態(tài)學(xué)假設(shè)，因此，左心室構(gòu)型發(fā)生改變必然對計算結(jié)果產(chǎn)生影響。此外，采用M型超聲測量左心室徑線后，通過公式計算左心室質(zhì)量時，徑線測值需計算3次冪，即使徑線誤差極小，亦會對左心室質(zhì)量最終結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究中UBM對于左心室質(zhì)量的測值略高于金標(biāo)準(zhǔn)值，與文獻[7]報道相符。本組中UBM及體外精確測量均顯示急性模型組左心室質(zhì)量低于慢性模型組，盡管UBM測量與真實值間存在誤差，但對于不足1 g的大鼠心臟，UBM技術(shù)仍能敏感反映其變化。

總之，ISO所致大鼠急性及慢性心肌肥厚模型左心室形態(tài)及功能均發(fā)生明顯改變；UBM能檢出大鼠左心室心肌形態(tài)、功能及質(zhì)量變化，為在模型大鼠體內(nèi)進行后期生理學(xué)、藥理學(xué)等重要研究提供了可能[10-11]。