雌激素受體β基因rs1256064和rs1256049位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)系研究

郝娜，田蕓婕，賈亞靜，路曉琳

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)多發(fā)于育齡期婦女，由多因素、多遺傳基因作用導(dǎo)致具有活性的子宮內(nèi)膜組織異位，生長(zhǎng)在子宮腔以外并反復(fù)周期性出血，從而引起患者慢性盆腔痛、痛經(jīng)、不孕等[1-2]。近年來(lái)，隨著社會(huì)快速發(fā)展，生活節(jié)奏加快，臨床上EMs發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，成為臨床上常見(jiàn)且危害較大的一類婦科疾病，嚴(yán)重影響婦女的生活質(zhì)量、生育功能和身心健康[3]。目前EMs的發(fā)病機(jī)制尚未得到明確闡明，臨床上也缺乏治療EMs的特效藥，因此探究與EMs發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因，以期找尋預(yù)防、診斷和治療EMs的新靶點(diǎn)對(duì)EMs患者意義重大。雌激素受體β(estrogen receptorβ，ERβ)作為可溶性糖蛋白分子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，雌激素在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮生理功能必須通過(guò)ERβ介導(dǎo)[4-5]。EMs受雌激素調(diào)控，因此ERβ基因的變化可能影響雌激素的生理作用，從而導(dǎo)致EMs發(fā)病[6]。ERβ基因在EMs患者血清中表達(dá)水平未見(jiàn)相關(guān)研究，因此本研究使用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法檢測(cè)EMs患者血清中ERβ基因rs1256064和rs1256049位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，分析rs1256064和rs1256049位點(diǎn)等位基因頻率與EMs患者臨床病理特征的關(guān)系，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取于2017年6月—2019年6月邯鄲市中心醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦科收治的60例EMs患者作為研究對(duì)象(EMs組)，依據(jù)2015年“子宮內(nèi)膜異位癥的診治指南”[7]，超聲影像為無(wú)回聲區(qū)內(nèi)有密集光，腹腔鏡檢觀察病變形態(tài)，經(jīng)病理檢查確診。EMs組年齡21 ～51(35.23±3.48)歲，體質(zhì)量指數(shù)(22.94±3.19)kg/m2；根據(jù)美國(guó)生育協(xié)會(huì)在1997年修訂的EMs分期(R-AFS)[8]，Ⅰ期8例，Ⅱ期12例，Ⅲ期19例，Ⅳ期21例；病理類型，卵巢型21例，腹膜型20例，混合型19例；痛經(jīng)情況，無(wú)或輕度痛經(jīng)29例，中或重度痛經(jīng)31例；產(chǎn)次，0次11例，1次34例，≥2次15例；有流產(chǎn)史33例；有不孕史19例。另選取同期來(lái)邯鄲市中心醫(yī)院體檢的健康女性67例作為對(duì)照組，年齡22～52(36.17±2.91)歲，體質(zhì)量指數(shù)(22.74±4.50)kg/m2；產(chǎn)次，0次13例，1次36例，≥2次18例；有流產(chǎn)史36例；有不孕史20例。2組受試者年齡、體質(zhì)量指數(shù)、孕產(chǎn)情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》，入選者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)月經(jīng)周期正常；(2)6個(gè)月內(nèi)未曾使用激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有其他婦科腫瘤或婦科病的者；(2)伴有心、腎、肝功能不全者；(3)免疫功能缺陷者；(4)處于妊娠期的受試者。

1.3 主要試劑和儀器 rs1256064和rs1256049引物序列由上海生物工程公司合成；DNA提取試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；SimpliAmp PCR儀購(gòu)自美國(guó)賽飛世爾科技有限公司。

1.4 檢測(cè)方法 清晨取所有受試者空腹靜脈血6 ml，用肝素抗凝，隨后置于-20℃冰箱中待用。

1.4.1 用DNA提取試劑盒提取基因: rs1256064位點(diǎn)上游引物序列5’-TGATTGCTCAGCACATAGCC-3’，下游引物序列5’-GACAGGTCTTCAGCACCACA-3’；rs1256049位點(diǎn)上游引物序列5’-TCTACACACACAGGGAGCTGA-3’，下游引物序列5’-CAGGACTTTGTTCCCACTCAC -3’；PCR擴(kuò)增體系共20.0 μl，其中上下游引物(5μmol)各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl，SYBR Mix 10.0 μl，cDNA(25 ng/ml) 2.0 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5min，(95℃變性45s，60℃延伸60s)×40，72℃ 10min。

1.4.2 酶切PCR擴(kuò)增引物: rs1256064和rs1256049位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切體系共20.0 μl，其中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物16 μl，10×Buffer 2.1 μl，RsaI 0.7 μl，BSA 0.2 μl。酶切反應(yīng)條件為37℃ 4 h。將酶切后的產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析，凝膠成像儀成像，隨后根據(jù)酶切產(chǎn)物片段的大小確定基因型。

2 結(jié) 果

2.1 2組rs1256064位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 經(jīng)PCR擴(kuò)增出rs1256064位點(diǎn)基因318 bp片段，經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生153 bp和165 bp 2個(gè)片段，在群體中組成pp、Pp和PP 3種不同類型的基因型。與對(duì)照組相比，EMs組患者rs1256064等位基因pp基因型數(shù)顯著升高，PP基因型數(shù)顯著降低(P<0.01)，p等位基因頻率顯著升高，P等位基因頻率顯著降低(P<0.01),見(jiàn)表1。

2.2 2組rs1256049位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 經(jīng)PCR擴(kuò)增出rs1256049位點(diǎn)基因299 bp片段，經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生105 bp和172 bp 2個(gè)片段，在群體中組成pp、Pp和PP 3種不同類型的基因型。與對(duì)照組相比，EMs患者組rs1256049等位基因PP基因型數(shù)顯著升高，Pp基因型數(shù)顯著降低(P<0.05)，P等位基因頻率顯著升高，p等位基因頻率顯著降低(P<0.05), 見(jiàn)表2。

2.3 rs1256064、rs1256049位點(diǎn)基因與子宮內(nèi)膜異位癥臨床病理特征的關(guān)系 rs1256064和rs1256049位點(diǎn)等位基因頻率與EMs患者臨床分期、有無(wú)流產(chǎn)、有無(wú)不孕史有關(guān)(P<0.05)，與EMs患者年齡、病理類型、有無(wú)痛經(jīng)、產(chǎn)次無(wú)關(guān)(P>0.05)， 見(jiàn)表3。

2.4 影響子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析表明，臨床分期、不孕史、rs1256064位點(diǎn)p等位基因頻率升高、rs1256049位點(diǎn)P等位基因頻率升高是EMs發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表1 2組rs1256064位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表2 2組rs1256049位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表3 rs1256064和rs1256049位點(diǎn)與子宮內(nèi)膜異位癥臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

表4 影響EMs發(fā)病的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

EMs因侵襲性強(qiáng)、復(fù)發(fā)率高成為臨床上婦科難治疾病，育齡期婦女發(fā)病率高達(dá)10%，成為婦女不孕癥的危險(xiǎn)因素[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，不孕癥婦女患者中25%～50%伴有EMs，盆腔體檢正常的育齡女性超過(guò)50%患有不同程度的EMs。到目前為止，很多學(xué)者對(duì)EMs的發(fā)病機(jī)制開(kāi)展大量的臨床研究和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，但仍無(wú)法完全闡述EMs的具體發(fā)病機(jī)制[11-12]。學(xué)術(shù)界對(duì)免疫學(xué)、子宮內(nèi)膜種植、遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制頗有爭(zhēng)論，隨著生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，ERβ基因與EMs發(fā)生發(fā)展的關(guān)系受到重視，成為研究的熱點(diǎn)[13]。但大多從細(xì)胞或動(dòng)物模型上探討ERβ與EMs的關(guān)系，在臨床上未曾對(duì)ERβ基因具體核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行研究。因此本研究選ERβ基因rs1256064和rs1256049位點(diǎn)單核苷酸，試圖從基因水平上找尋ERβ基因rs1256064和rs1256049位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與EMs發(fā)病之間的相關(guān)性。

ERβ基因由40 kb堿基組成，位于14q23-24.1，包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，廣泛分布在兩性組織和生殖器官中，在人乳腺、卵巢、子宮內(nèi)膜中表達(dá)，且分泌期低表達(dá)，增生期高表達(dá)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，ERβ可能與子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)[16]。李鵬程等[17]研究發(fā)現(xiàn)，ERβ在EMs大鼠模型子宮內(nèi)膜中高表達(dá)，可上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、氨基末端激酶(c-Jun)表達(dá)水平，在EMs發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在廣西壯族絕經(jīng)婦女血清雌二醇、孕酮水平研究中，ERβ基因經(jīng)Rsa-Ⅰ內(nèi)切酶酶切出RR、Rr、rr、r、R基因組，r基因組孕酮和雌二醇水平顯著降低，黃體生成素、促卵泡激素顯著升高[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PCR擴(kuò)增出rs1256064位點(diǎn)基因318 bp片段，經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后分別產(chǎn)生153 bp、165 bp 2個(gè)片段，與對(duì)照組相比，EMs組患者rs1256064等位基因pp基因型數(shù)和p等位基因頻率顯著升高，PP基因型數(shù)和P等位基因頻率顯著降低，提示rs1256064位點(diǎn)基因與EMs相關(guān)。對(duì)rs1256049等位基因研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PCR擴(kuò)增出rs1256049位點(diǎn)基因299 bp片段，經(jīng)RsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生105 bp和172 bp 2個(gè)片段，與對(duì)照組相比，EMs組患者rs1256049等位基因PP基因型數(shù)和P等位基因頻率顯著升高，Pp基因型數(shù)和p等位基因頻率顯著降低，提示rs1256049位點(diǎn)基因與EMs有關(guān)，可能此類基因特征患者更易患EMs。臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，rs1256064和rs1256049位點(diǎn)等位基因頻率與EMs患者臨床分期、有無(wú)流產(chǎn)、有無(wú)不孕史有關(guān)，與EMs患者年齡、病理類型、有無(wú)痛經(jīng)、產(chǎn)次無(wú)關(guān)，提示rs1256064和rs1256049位點(diǎn)等位基因頻率可能參與EMs進(jìn)程，與EMs發(fā)生發(fā)展相關(guān)，多因素Logistic回歸分析表明，臨床分期、不孕史、rs1256064位點(diǎn)p等位基因頻率升高、rs1256049位點(diǎn)P等位基因頻率升高是EMs發(fā)病的危險(xiǎn)因素，提示該類患者具有患EMs風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)定期體檢，注意防治。

綜上所述，EMs患者rs1256064位點(diǎn)基因pp基因數(shù)和p等位基因頻率、rs1256049位點(diǎn)基因PP基因數(shù)和P等位基因頻率顯著升高，與患者臨床分期、不孕史有關(guān)，是EMs患病的危險(xiǎn)因素，提示rs1256064和rs1256049位點(diǎn)可能作為早期預(yù)防和判斷EMs的臨床指標(biāo)。但rs1256064和rs1256049位點(diǎn)基因具體作用機(jī)制還有待從動(dòng)物和細(xì)胞模型進(jìn)行深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

郝娜：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫；田蕓婕：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；賈亞靜：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；路曉琳：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析