內生鏈格孢菌纖維素酶輔助提取丹參莖葉中總丹酚酸條件優(yōu)化

張 芮 劉水永恒 孫士妍 張可軒 汪 玉 田 園 史仁玖 常正堯 李艷玲

山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)生命科學學院，山東 泰安 271016

丹參(Salviamiltiorrhiza)系唇形科鼠尾草屬植物，富含丹參酮類、丹酚酸類、多糖類等資源性化學物質[1-3]，具有抗氧化、抗菌消炎、抗血栓、抗腫瘤等藥理作用[4-7]。研究發(fā)現，丹參莖葉及花序中等傳統(tǒng)非藥用部位，含有豐富的水溶性丹酚酸類化學成分，其中丹酚酸B的含量較高[8]，對由于脂質的過氧化而引起的細胞膜損傷具有很明顯的保護作用，還具有抗血小板聚集和防治強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)的作用[9]。以丹酚酸作為有效成分的藥物已經成為研究和開發(fā)的熱點，但目前提取丹酚酸多采用水提醇沉法[10-11]，得率最高只能達4.75%[10]。由于丹酚酸B不耐熱，易氧化水解，對于受熱溫度和受熱時間比較敏感，所以丹參的提取液不能夠長時間高溫濃縮。酶法水解丹參條件溫和，克服了水提醇沉法因高溫提取降低了丹酚酸類物質得率的缺點。

植物內生真菌(fungal endophyte)是一類寄生于健康活體植物組織中的特殊真菌，主要存在于表面細胞層下的組織中，是植物組織內的正常菌群，與宿主植物形成了互惠共生關系。研究發(fā)現，植物內生菌具有較高的木聚糖酶、果膠酶、纖維素酶和多酚氧化酶活性，具有降解部分植物木質素和纖維素的能力[12]。纖維素酶可快速分解細胞壁，反應溫和，現已越來越多的應用于中藥有效組分的提取[13]。本試驗采用Box-Behnken響應面分析法進行試驗設計，盡量避免復雜提取技術路線，其結果更適合于工業(yè)化提取，不僅為丹參莖葉中丹酚酸類物質的進一步開發(fā)提供理論指導，也為中藥廢棄物的再次利用提供一條新路。

1 材料和方法

1.1 材料

丹參莖葉于2017年8月采自山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院)藥用植物園，自然陰干后在60℃烘箱中烘2 h，粉碎，過40目篩，分裝備用。LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；V-5100型可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；FA2004N電子天平，日本津島公司；ZHLY-180S型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺，江蘇奧華儀器廠；DNP-9162BS-Ⅲ恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1種子及發(fā)酵培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，瓊脂20 g/L，葡萄糖20 g/L，蒸餾水定容至1000 mL，自然pH；剛果紅纖維素培養(yǎng)基：微晶纖維素粉(CMC-Na)1.88 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，K2HPO40.5 g，剛果紅0.2 g，瓊脂14 g，(NH4)2SO42 g，明膠2 g，蒸餾水定容至1 000 mL；液體發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，NaNO32.5 g，FeCl30.01 g，MgSO40.3 g，CaCl20.1 g，NaCl 0.1g，麩皮10 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2.2產纖維素酶菌株的篩選及粗酶液的制備

采用剛果紅平板法[14]對產纖維素酶菌株進行初篩。將冰箱保存的菌種經PDA培養(yǎng)基活化后，轉接到剛果紅纖維素培養(yǎng)基平板上。用1 mg/mL剛果紅溶液染色30 min后用蒸餾水清洗，最后用1 mol/L的NaCl溶液脫色30 min。選用游標卡尺，分別測量透明圈直徑(H)和菌落直徑(C)，選擇兩者(H/C)比值較大的菌株，采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[15]，測定纖維素酶(CMC酶)酶活力進行復篩。采用打菌塊的方法，將培養(yǎng)于固體平板3 d的菌種接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶100 mL培養(yǎng)基，兩個6 mm菌塊，于28℃、150 r/min培養(yǎng)5～7 d。培養(yǎng)完畢后，將液體發(fā)酵液于4 500 r/min的離心機中離心10 min后，取上清液，即為粗酶液。

1.2.3丹參莖葉中總丹酚酸的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁配位顯色法[16]進行總丹酚酸含量測定。

1.2.3.1丹酚酸B標準曲線 丹酚酸對照品的制備：取丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加蒸餾水定容至10 mL棕色量瓶中，用孔徑為0.45 μm的微孔濾膜濾過，質量濃度為0.146 mg/mL的丹酚酸對照品溶液，分別從其中精密移取0、0.3、0.6、1.3、2.5、5 mL，加水定容至10 mL，精密移取稀釋液2 mL，精密加入1% NaNO22. 5 mL，搖勻，暗處放置10 min后，再加入20% Al(NO3)30. 25 mL，搖勻，暗處放置10 min后，再精密加入1 mol/L NaOH 4 mL，搖勻，暗處放置15 min，最后于493 nm下測定其吸光度(A)，以吸光度值為縱坐標，丹酚酸B含量(X)為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.3.2樣品溶液測定 精密稱取丹參藥材粉末0.2 g，置于具塞錐形瓶中。精密加入水25 mL，稱定質量，水浴回流30 min，放冷，再稱定質量，用水補足減失的質量，搖勻，濾過，即得丹參供試品溶液。按標準曲線的制備項下方法于493 nm處測定吸光度值。

1.2.4酶法輔助提取總丹酚酸條件優(yōu)化

考察酶液量、酶解pH以及酶解時間對丹參莖葉總丹酚酸提取效果的影響。在單因素試驗的基礎上，進行響應面法中的Box-Behnken 試驗，利用Design-Expert設計三因素三水平試驗，對丹參內生真菌Y-2纖維素酶提取總丹酚酸條件進行優(yōu)化。

1.2.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0 軟件進行數據分析，所有實驗均重復3 次，利用Design-Expert 8.0.6程序對各個因素的響應值進行回歸擬合分析。

2 結 果

2.1 纖維素酶產生菌的篩選結果

根據直徑比值大小，用剛果紅培養(yǎng)基透明圈法，從丹參莖葉中分離到了8株產纖維素酶的內生真菌菌株，其中Y-2具有較高纖維素分解能力。通過DNS法測定其纖維素酶活力，重復3次取得平均值，Y-2的CMC酶活力最高，達到46.63 U/mL。

2.2 內生真菌Y-2的形態(tài)鑒定結果

Y-2在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d后，菌落呈黑色絨狀，菌絲呈灰色至黑色，生長迅速，擴散快，絨毛狀菌絲較為濃密(圖1)。Y-2的光學顯微鏡鏡檢結果，如圖2所示，分生孢子呈褐色，具分隔，為倒棍棒形。根據《真菌分類鑒定手冊》初步確定為鏈格孢屬(Alternariasp.)。

圖1 內生真菌Y-2菌落特征

圖2 Y-2光學顯微鏡下觀察結果

2.3 單因素試驗

2.3.1酶液量對丹參莖葉總丹酚酸提取的影響

將待測樣品分別按照酶液量進行分組，每組樣品酶液量分別為40、50、60、70、80、90 mL，同時設定酶解pH為6，溫度為55 ℃，酶解時間6 h，并在以上設定好的條件下進行單因素試驗。

圖3 酶液量對丹參莖葉丹酚酸提取量的影響

由圖3可知，總丹酚酸提取量隨著酶液量的增加，丹酚酸的提取率也逐漸升高。當酶液量為90 mL時，丹參莖葉總丹酚酸提取率最高，但從80到90 mL增加不明顯，考慮到經濟因素選擇最優(yōu)酶液量為80 mL。

2.3.2酶解pH對總丹酚酸提取的影響

設定酶液量為80 mL，溫度為55 ℃，酶解時間6 h，分別選取酶解pH為4、5、6、7、8，進行單因素試驗，測定Y-2纖維素酶提取對丹酚酸含量的影響。

圖4 pH對丹參莖葉丹酚酸提取量的影響

由圖4可知，隨著pH的不斷增大，丹酚酸含量也在不斷增加，當pH達到7時，丹酚酸含量達到最高值，隨后在pH為8時，丹酚酸含量呈下降趨勢。因此，選擇pH 7作為提取丹酚酸的最適pH。

2.3.3酶解時間對丹酚酸提取的影響

將待測樣品分別按照酶解時間進行分組，每組酶解時間分別為4、5、6、7、8 h，溫度為55℃，酶解pH為7，并在以上設定好的條件下進行單因素試驗。

圖5 提取時間對丹參莖葉丹酚酸提取量的影響

由圖5所示，隨著酶解時間的不斷增加，丹酚酸含量也在不斷增加，當時間達到6 h時，丹酚酸含量達到最高值，隨后酶解時間不斷增大，丹酚酸含量呈下降趨勢。

2.4 響應面法優(yōu)化Y-2纖維素酶提取丹參莖葉總丹酚酸工藝條件

2.4.1Box-Benhnken實驗設計與分析

實驗因素及水平設計見表1，根據Box-Benhnken實驗設計原理，并且結合單因素的實驗結果，選取酶液量、酶解pH、酶解時間3個因素，以丹參內生真菌Y-2纖維素酶提取丹酚酸含量為響應值，來設計三因素三水平的響應面分析實驗，并且利用Design-Expert 8.0.6軟件對每個因素下所產生的一系列數據進行二次回歸擬合，然后得到纖維素酶提取丹酚酸含量(Y)對3個因素的二次多項回歸方程，再由所得到的二次方程來進一步取得最佳的提取條件。

通過Design-Expert 8.0.6對表1中響應面與各個因素進行回歸擬合，得到纖維素酶提取丹酚酸含量對3個因素酶液量(A)、酶解pH(B)、酶解時間(C)編碼值的二次多項回歸方程為Y=3.60-0.12A+0.18B-0.046C-0.015AB+0.038AC+0.10BC-0.35A2-0.74B2-0.56C2。實驗結果如表2所示。

表2 Box-Behnken中心組合設計方案及實驗結果

利用Design-Expert 8.0.6程序對各個因素的響應值進行回歸擬合分析，所得到的回歸模型的各項系數的顯著性檢驗結果和方程的方差分析結果。從表3可以看出，整體模型達極顯著水平，即P值小于0.01，模型的失擬項(P=0.103 50)無統(tǒng)計學意義；相關系數R2= 0.925 7，說明該方程對實驗擬合較好，模型建立的回歸方程能代替真實點解釋響應結果。

在表3中，B2、C2的P值均遠小于0.01，有統(tǒng)計學意義，A2的P值顯著性次之。3個因素對纖維素酶提取丹酚酸含量的影響強弱依次排序為：B>C>A，即酶解pH>酶解時間>酶液量。

2.4.2因素間交互影響

根據回歸模型作出相應的響應面和等高線(圖6至8)，用來考察擬合響應面的形狀并分析各因素對于響應值的影響，還有他們之間的相互作用，并且從中確定最佳因素的水平范圍。根據研究顯示，等高線的形狀反映了交互效應的強弱，若等高線越趨向于橢圓，則表明交互作用越強，反之，若等高線越趨向圓則表明因素之間的交互作用越弱。響應曲面的傾斜度越高，且等高線越密集，則說明兩因素之間的交互作用越明顯。通過比較兩組圖響應面最高點以及等高線，可以看出，在所選范圍內存在著極值，也就是響應面最高點同時也是等高線最小橢圓的中心點。

根據圖6，可以看出第一個圖中，響應面的等高線為橢圓形，并且坡度比較陡，說明了酶液量與酶解pH的交互作用較強，二者對于丹酚酸的提取影響較大；同時也可以看出，酶解pH所對應的曲面相對于酶液量的曲面而言較陡，說明酶解pH對丹參中單酚酸提取的影響力相對于酶液量的影響來說，要更大一些。

圖6 酶液量與酶解pH對丹酚酸提取量的影響

由圖 7可知，響應面的等高線為橢圓形，并且坡度相對較強，說明酶解時間與酶液量的交互作用強，對于丹酚酸的提取率影響較大；同時酶解時間對應的曲面相對于酶液量而言較陡，說明酶解時間對丹參中單酚酸提取的影響要大于 酶液量的影響。

圖7 酶液量與酶解時間對丹酚酸提取量的影響

圖8 酶解pH與酶解時間對丹酚酸提取量的影響

由圖7，8可知，響應面等高線的形狀為近似圓形的橢圓，且坡度較緩，這說明酶解pH與酶解時間的交互作用較弱，對于丹酚酸的提取影響較?。煌瑫r酶解pH對應的曲面相對于酶解時間而言較陡，說明酶解pH對丹酚酸提取的影響力相對于酶解時間的影響要大一些。

綜上所述，各因素間的交互作用的響應值影響情況，其中酶解pH的影響效應最為顯著，其次是酶解時間，酶液量對丹酚酸提取的影響最小。

經過Design Expert 8.0.6軟件的分析，可知丹參中丹酚酸酶解的最佳工藝條件為：酶解時間6 h，酶解溫度55℃，纖維素酶用量80 mL、酶解pH 7。在此條件下，丹酚酸理論提取量與實驗結果所得接近。在最優(yōu)的提取條件下，丹參莖葉總丹酚酸的得率比較高，并且優(yōu)于單因素試驗設計。最后得到各因素變量的二次方程模型，可以看出，該模型回歸比較顯著，對試驗擬合較好，有一定的應用價值。

3 討 論

丹酚酸是丹參提取物中的有效成分，具有較強的清除人體內的氧自由基，抑制脂質的過氧化反應，并且能夠提高人體的免疫力，對一些疾病具有較好的治療以及防御能力[17-19]。本研究從丹參莖葉中分離出一株高產纖維素酶的菌株Y-2，結合該菌株的菌落形態(tài)、孢子形態(tài)等特征，鑒定為鏈格孢屬(Alternariasp.)，該菌株的CMC酶活力達到46.63 U/mL，這與已分離到的內生菌產纖維素酶菌株相比，有較高纖維素酶活性[20]，為該內生菌的進一步研究應用奠定了基礎。

纖維素酶可快速分解細胞壁，反應溫和，現已越來越多的應用于中藥有效組分的提取研究中[21-22]。Box-Behnken 響應面分析法較傳統(tǒng)優(yōu)化方法更為精確可靠[22-24]，本試驗采用響應面法進行試驗設計，盡量避免復雜提取技術路線，其結果更適合于指導擴大提取，為丹酚酸類化合物的進一步開發(fā)提供理論指導。