大頭金蠅線粒體ND3基因的遺傳多樣性分析及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

賈彬，馮添翼，劉新良，宋智敏，婁志國，劉欽來

(山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東 泰安)

0 引言

大頭金蠅起源于東南亞，世界各地均有分布，屬雙翅目麗蠅科金蠅屬，我國多數(shù)省份均有分布，是常見的醫(yī)學(xué)媒介昆蟲，為刑事案件中死亡時間和死亡地點的推論提供刑偵證據(jù)，擁有較強的法醫(yī)學(xué)研究價值[1]。目前的主要研究在于蠅種鑒定及其幼蟲生長發(fā)育時間推斷死亡時間，但采用形態(tài)學(xué)方法種類鑒定常會受到各種限制，分子生物學(xué)DNA技術(shù)成為基因鑒定和種群研究的新興熱點，特別對于遺傳多態(tài)性結(jié)合地理隔離推斷死亡地點的研究目前還很少[2-3]。

線粒體具有結(jié)構(gòu)簡單，基因構(gòu)成穩(wěn)定，易于測序，母系遺傳的各項特點，且缺少核DNA的修復(fù)保護能力而易受地理因素影響突變（突變率為核DNA的5-10倍），常常被用作遺傳多樣性分析和基因鑒定的研究對象，大頭金蠅線粒體ND3基因是線粒體NADH氧化還原酶一個亞基的編碼基因，具有進化速率相對較快，序列變異率較高的特點，常被應(yīng)用于類群系統(tǒng)發(fā)育研究中，本文將各地區(qū)大頭金蠅線粒體ND3基因進行比對并結(jié)合地域信息加以分析，研究與地域的相關(guān)性，完善中國大頭金蠅線粒體研究并對其在死亡地點的研究提供新的思路[4-6]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 捕集方式

通過懸掛式捕蠅籠，在12個采集地點的火車站、室外草地、廁所等位置用腐敗的魚類為誘餌捕捉食腐昆蟲，初步挑選蒼蠅個體后用75%酒精浸泡，-80℃保存，實驗時經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒別選擇出大頭金蠅。

1.1.2 實驗儀器

美國ABI公司的PCR擴增儀（型號：A24811），BIO-RAD公司的核酸電泳系統(tǒng)和凝膠電泳系統(tǒng)（型號：Tanon-3500R）。

1.1.3 實驗試劑

動物DNA快速提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）、高保真PCR反應(yīng)試劑盒（南京維諾贊生物科技有限公司）。

表1 各地區(qū)大頭金蠅采集信息

1.2 方法

1.2.1 運用CTAB法提取mtDNA樣品[7]。

1.2.2 PCR擴增和測序

應(yīng)用軟件Primer5，模板為大頭金蠅線粒體（GenBank：NC019633.1），設(shè)計上下游引物（上游 5’-3’：ACTCAAACCACCCA TTCCATT 下游 5’-3’：CGCTTCATATTCAAGGTAGATTG），之后用PCR反應(yīng)試劑盒擴增，擴增后序列送至上海生工生物科技有限公司進行測序。（條件：94℃預(yù)變性 3min；94℃變性 15s；退火15s，退火溫度49.3℃；72℃延伸65s；徹底延伸10min；循環(huán)數(shù)35-40個。）

表2 大頭金蠅各種群ND3基因突變及突變位點

2 數(shù)據(jù)分析

2.1 不同地區(qū)大頭金蠅的遺傳多樣性分析

大頭金蠅線粒體ND3基因全長354bp，起止點為5558-5911（GenBank：NC019633.1）,此次實驗的設(shè)計引物起止點為4708～5989，測序長度為1281bp，通過剪切后的實際長度為354bp。12個地區(qū)的樣本測序結(jié)果共發(fā)現(xiàn)保守位點344個，變異位點10個：其中自裔位點5個（位點位置：101 132 149 310 342），簡約信息位點5個（位點位置78 225 247 309 315），樣本總體平均核苷酸差異為1.34689，核苷酸多樣性（Pi）為0.380%，12個地區(qū)樣本的核苷酸多樣性介于：0.00226～0.00508，其中TY地區(qū)和YC地區(qū)的核苷酸多樣性最高，12個地區(qū)樣本共產(chǎn)生12個單倍型。

2.2 不同地區(qū)大頭金蠅間的遺傳分化研究

運用WinArl35軟件對12個大頭金蠅種群進行群遺傳分化研究，發(fā)現(xiàn)12個種群群體內(nèi)總體遺傳分化系數(shù)Fst =0.10299，結(jié)果表示總變異數(shù)的89.70%為群體間變異，10.30%為群體內(nèi)變異，表明群體間存在較大遺傳分化。12個種群間發(fā)現(xiàn)5組具備統(tǒng)計學(xué)意義的Fst數(shù)據(jù)，范圍是0.3500～0.6000。SL-BZ兩地群體（Fst值為0.6000）遺傳分化程度最大，KM-EEDS兩地群體（Fst值為0.3500）遺傳分化程度最小。

2.3 多重序列比對統(tǒng)計地域性SNP位點和單倍型

2.3.1 SNP位點統(tǒng)計數(shù)據(jù)

用Genbank中大頭金蠅線粒體DI212序列（GenBank：NC019633.1）為模板，運用MEGA6.0軟件，將60條中國大頭金蠅ND3序列與之比對（表2），由表可知12個地區(qū)的大頭金蠅群體共出現(xiàn)5個共享SNP位點，5個私有SNP位點，其中225號位點共享頻率最高，私有SNP位點均為單只出現(xiàn)。

2.3.2 單倍型統(tǒng)計數(shù)據(jù)

從DNAsp 5.0軟件分析單倍型分布情況中可以發(fā)現(xiàn)（表3），KM,TY,YC等7個地區(qū)具有私有單倍型，H1,H2,H3,H5,H6單倍型為共享單倍型，其中H2單倍型出現(xiàn)頻率最高，在9個地區(qū)中均有出現(xiàn)。

表3 大頭金蠅各種群單倍型分布情況

2.4 地域特征的SNP位點的驗證

本文通過地域間種群遺傳多樣性這一理論依據(jù)找到了一些具有地域特征的SNP位點，但這些SNP位點是否具有地域性和穩(wěn)定性，能否用作法醫(yī)學(xué)死亡地點推測的理論支撐仍需驗證，故本文于第二年，采用隨機抽樣的方法在上年的12個地區(qū)中抽取了4個地區(qū),中國南方兩個地區(qū)（昆明和廣西），中國北方兩個地區(qū)（鄂爾多斯和棗莊），重新捕捉蒼蠅進行驗證。每一個地區(qū)驗證4只蒼蠅，實驗結(jié)果如圖1。在鄂爾多斯地區(qū)驗證實驗中，EEDS7，EEDS9均在315位點（C-T）產(chǎn)生突變，證明中國北方蒼蠅在此位點的突變穩(wěn)定性和特異性。在桂林地區(qū)和昆明地區(qū)驗證實驗中，GL6在309位點（A-G）產(chǎn)生突變，說明南方蒼蠅在309位點存在突變的穩(wěn)定性和特異性。若309（A-G）,310（C-T）同時存在突變，也可進一步認為是KM地區(qū)存在的突變，但是由于本實驗中實驗數(shù)量有限，仍需要進一步探尋。

圖中綠色部分代表前期實驗數(shù)據(jù)、藍色部分代表驗證實驗數(shù)據(jù)、黃色部分代表詳細突變情況。

3 討論

線粒體DNA具備細胞內(nèi)最大的拷貝量，擁有比核DNA更高的突變率[8]，ND3為線粒體上的一個基因，我們期望ND3基因可以延續(xù)線粒體高突變率這一特點。通過對ND3基因的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，其擁有較明顯的AT偏向（77.87%），其特性與包含雙翅目在內(nèi)的昆蟲線粒體DNA相符（mean A=30% T=43% C=12%G=15%[9-10]）。

群體內(nèi)遺傳分化貢獻率為10.30%，群體間遺傳分化貢獻率為89.70%，表明群體間變異是變異的主要來源，群體間具有顯著差異也就是說地域間具有顯著差異性，這種遺傳分化的差異性反應(yīng)的是地域之間的地理環(huán)境的差異性。進一步說明地域群體在遺傳結(jié)構(gòu)上存在的差異能夠反應(yīng)地理環(huán)境之間的差異。

生物種群產(chǎn)生一定方向的歧化選擇與各個地區(qū)環(huán)境氣候間的差異性有關(guān)，這種選擇導(dǎo)致遺傳性的突變，具有地域性分布的地理隔離便由此生成[11]。本實驗通過研究中國12個經(jīng)緯度和環(huán)境氣候相差較大地區(qū)的大頭金蠅種群，發(fā)現(xiàn)其中有多個地區(qū)具備地域性特征的SNP位點和私有單倍型，“例如KM地區(qū)的310號突變位點，H4單倍型；TY地區(qū)的101號突變位點，H7單倍型；YC地區(qū)的132號突變位點，H8單倍型；BZ地區(qū)149號突變位點，H11單倍型；SL地區(qū)342號突變位點，H9單倍型等?！北緦嶒灁M利用這些具備地域性特征的SNP 位點和私有單倍型來進行地域推測，例如根據(jù)309（A-G）號突變位點,可推測為南方蒼蠅；若存在309（A-G），310（C-T）突變，可完成是昆明地區(qū)的推測；根據(jù)315（C-T）位置的突變，可推測為北方地區(qū)的蒼蠅。進而將其應(yīng)用到法醫(yī)學(xué)的死亡地點推測。但是基于本研究樣本數(shù)量有限這一客觀因素，這些特異性的位點和單倍型是否可以用作死亡地點的推測，目前還不能得出確切結(jié)論，未來需要有足夠的樣本數(shù)量來支撐，而本文的目的在于為第一案發(fā)現(xiàn)場的推斷從法醫(yī)昆蟲學(xué)的角度提供一種理論基礎(chǔ)。

圖1 前期實驗和驗證試驗各位點突變詳情