輔助生殖胚胎培養(yǎng)D2細(xì)胞數(shù)與卵裂期選擇性單胚胎移植臨床結(jié)局

魏玉蘭 靳 鐳 黃 博 任新玲

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院(武漢,430030)

選擇性單胚胎移植(eSET)以其降低多胎妊娠率、改善母嬰圍產(chǎn)結(jié)局的優(yōu)勢成為輔助生殖技術(shù)的趨勢,而挑選出最具發(fā)育潛能的胚胎移植成為關(guān)注焦點(diǎn)[1]。單囊胚移植可在保持理想妊娠率的基礎(chǔ)上降低多胎妊娠率,但存在部分患者無囊胚形成從而取消移植的風(fēng)險(xiǎn)。國內(nèi)多數(shù)生殖中心選擇在受精后第3天(D3)進(jìn)行卵裂期胚胎移植,但移植胚胎多為2個(gè),卵裂期單胚胎移植尚少有臨床研究報(bào)道。本研究探討了單個(gè)卵裂期胚胎移植周期中在D3優(yōu)質(zhì)胚胎為8細(xì)胞的前提下,第2天(D2)不同細(xì)胞數(shù)對臨床結(jié)局的影響,以期優(yōu)化胚胎選擇方案,提高eSET臨床妊娠率。

1 資料與方法

1.1 研究對象及納入標(biāo)準(zhǔn)

收集本中心2016年1月—2018年12月行輔助生殖新鮮周期行eSET患者的臨床資料,以D3為單個(gè)優(yōu)質(zhì)8細(xì)胞胚胎的移植周期為研究對象(n=2375),根據(jù)D2細(xì)胞數(shù)不同分組,比較2、3、5、6細(xì)胞組與4細(xì)胞組的臨床妊娠率、活產(chǎn)率及流產(chǎn)率。納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡≤35歲；②D2胚胎卵裂球無多核表現(xiàn)；③D3移植單個(gè)來源于正常受精的優(yōu)質(zhì)8細(xì)胞胚胎；④夫婦雙方染色體正常；④排除遺傳性疾病。本研究經(jīng)本院倫理委員會審批。

1.2 治療方法

1.2.1促排卵及體外授精促排卵方案按照本院生殖中心常規(guī)治療方案,根據(jù)女方年齡、基礎(chǔ)卵泡及基礎(chǔ)內(nèi)分泌等情況選擇不同促排方案(短效長方案,卵泡期長方案,拮抗劑方案,黃體期方案等)。B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況,卵泡成熟時(shí),注射HCG(珠海麗珠制藥,5000IU)5000～10000U,37h經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。密度梯度離心法優(yōu)化精液并根據(jù)患者不孕不育相關(guān)因素及精子質(zhì)量選擇實(shí)施常規(guī)IVF或單精子卵胞漿內(nèi)注射(ICSI)操作。

1.2.2胚胎評估時(shí)間及方法根據(jù)伊斯坦布爾共識,正常授精后17±1 h觀察原核, 44±1 h觀察D2胚胎,68±1 h觀察D3胚胎,評估細(xì)胞數(shù)目、碎片比例、卵裂球大小是否均勻[2]。

1.2.3胚胎評估方法D3卵裂期胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ級,卵裂球數(shù)8～10個(gè),卵裂球大小均勻且碎片≤10%；Ⅱ級,卵裂球數(shù)8～10個(gè),卵裂球大小均勻或輕度不均且碎片<25%；Ⅲ級,卵裂球大小嚴(yán)重不均且碎片<50%,或卵裂球無大小嚴(yán)重不均、碎片25%～50%；Ⅳ級,碎片≥50%。

1.2.4胚胎處理方案選擇D2～D3胚胎繼續(xù)發(fā)育,卵裂球大小均勻或輕度不均,無碎片或碎片≤10%且D3細(xì)胞數(shù)為8細(xì)胞的胚胎為移植首選,余下胚胎冷凍或繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 臨床妊娠診斷

胚胎移植后14d抽取患者靜脈血查絨毛膜促性腺激素(β-HCG),陽性者14d后經(jīng)陰道B超監(jiān)測有原始心管搏動(dòng)及孕囊者為臨床妊娠。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 各組一般臨床資料比較

各組女方年齡、不育年限、體質(zhì)指數(shù)(BMI) 、HCG日內(nèi)膜厚度、促性腺激素(Gn)使用總量等比較均無差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組一般臨床資料比較

2.2 各組臨床結(jié)局比較

4細(xì)胞組臨床妊娠率、活產(chǎn)率高于2、3、6細(xì)胞組(P<0.05),但與5細(xì)胞組無差異(P>0.05)；流產(chǎn)率各組均無差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組臨床結(jié)局比較[例(%)]

3 討論

細(xì)胞數(shù)目直接反映胚胎的發(fā)育速度,是胚胎內(nèi)在潛能的一種表現(xiàn)。現(xiàn)有研究表明D3 8細(xì)胞胚胎具有植入能力較強(qiáng)[3]及染色體異常率較低[4]的優(yōu)勢；同時(shí)也有研究表明D2 4細(xì)胞胚胎與非4細(xì)胞胚胎相比具有較高的體外發(fā)育能力和體內(nèi)著床潛能[5]。正常受精后D2 4細(xì)胞、D3 8細(xì)胞是胚胎最為理想的狀態(tài),但經(jīng)常會出現(xiàn)D3是優(yōu)質(zhì)8細(xì)胞胚胎而對應(yīng)的D2胚胎卻是發(fā)育速度不一的非4細(xì)胞狀態(tài)。目前D2具體細(xì)胞數(shù)與D3卵裂胚臨床結(jié)局之間的關(guān)聯(lián)尚少有報(bào)道,因此本研究探討了D2不同細(xì)胞數(shù)對臨床結(jié)局的影響,以期為綜合分析和選擇胚胎提供參考。

Desai等[6]認(rèn)為細(xì)胞數(shù)目是評估胚胎最重要的指標(biāo),可作為胚胎活力和妊娠結(jié)局的有效預(yù)測指針。正常受精后44±1h觀察D2胚胎形態(tài),此階段卵裂球數(shù)目也就是卵裂速度對臨床結(jié)局有非常重要意義。De Placido等[7]也認(rèn)為胚胎發(fā)育速度與臨床結(jié)局顯著相關(guān)。從本研究數(shù)據(jù)來看,4細(xì)胞組臨床妊娠率、活產(chǎn)率最佳,提示D2 4細(xì)胞是D3選擇優(yōu)質(zhì)胚胎的重要參考。

發(fā)育速度較慢的2、3細(xì)胞組臨床妊娠率、活產(chǎn)率均明顯低于4細(xì)胞組,流產(chǎn)率雖與其他各組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異但明顯偏高。Somfai等[8]發(fā)現(xiàn),缺乏潛力發(fā)育到囊胚的胚胎第1次卵裂時(shí)間顯著長于正常胚胎。據(jù)研究報(bào)道過慢的胚胎發(fā)育速度可能代表卵子內(nèi)在發(fā)育能力的嚴(yán)重缺陷或染色質(zhì)的異常[9]。雖然此類胚胎可以通過后續(xù)不斷的自身修復(fù)越過遲緩期至D3發(fā)育為8細(xì)胞胚胎但最終大部分胚胎可能因發(fā)育潛能受限被淘汰而無法獲得妊娠。

另外,本研究中發(fā)育速度較快的5細(xì)胞組臨床妊娠率,活產(chǎn)率與4細(xì)胞組無差異,但6細(xì)胞組與4細(xì)組相比,臨床妊娠率、活產(chǎn)率均下降,提示D2發(fā)育過快的胚胎移植后著床能力較低。針對發(fā)育速度過快,Magli等[4]和Ambartsumyan等[10]研究報(bào)道胚胎發(fā)育速度過快可能會增加胚胎染色體異常。Van Royen等[11]對<38歲患者進(jìn)行研究,認(rèn)為胚胎卵裂速度過快預(yù)示其繼續(xù)發(fā)育潛能的有限性。另外,此類胚胎中的一些卵裂球可能不是真正的胚胎細(xì)胞而只是較大的無核碎片[12]。

與以往研究[3,5]報(bào)道不同,本研究中5細(xì)胞組并未因?yàn)榘l(fā)育速度較快而出現(xiàn)植入率下降,反而其臨床妊娠率、活產(chǎn)率較理想,與4細(xì)胞組無差異。原因可能為,既往研究對D3細(xì)胞數(shù)無明確界定,而D3細(xì)胞數(shù)也是評估胚胎潛能的重要參數(shù)[3,13]。本研究不同的是D3為優(yōu)質(zhì)8細(xì)胞,明確了研究對象,對卵裂胚移植的篩選更有臨床價(jià)值。 此外也可能與本研究對象更年輕(≤35歲)以及近年技術(shù)和培養(yǎng)體系的改進(jìn)有關(guān)?；诒狙芯拷Y(jié)果,我們認(rèn)為在D2缺乏4細(xì)胞的情況下,5細(xì)胞也是較好的選擇,4細(xì)胞和5細(xì)胞可同時(shí)列為D2優(yōu)質(zhì)胚胎。

卵裂模式包括正常卵裂及異常卵裂,而胚胎出現(xiàn)非整倍體或基因異常是誘發(fā)卵裂模式異常的主要原因。劉麗等[14]的研究顯示胚胎早期發(fā)育階段會出現(xiàn)高比例的卵裂行為異常,在381個(gè)D3胚胎的卵裂中異常卵裂占65.35%。而Athayde等[15]也認(rèn)為異常卵裂在胚胎發(fā)育中普遍存在,部分通過形態(tài)學(xué)參數(shù)靜態(tài)評估的優(yōu)質(zhì)胚胎,可能表現(xiàn)為卵裂模式異常,而異常卵裂的胚胎發(fā)育潛能低下,嚴(yán)重影響妊娠結(jié)局。Yang等[16]報(bào)道了異常卵裂模式可造成胚胎染色體異常,導(dǎo)致妊娠率降低,流產(chǎn)率升高。本研究中D2發(fā)育較慢的2、3細(xì)胞及發(fā)育較快的5、6細(xì)胞至D3均發(fā)育為8細(xì)胞,本身就存在前后發(fā)育速度不均而增加了異常卵裂風(fēng)險(xiǎn),其臨床妊娠率較低可能與此有關(guān)。提示有條件的醫(yī)療中心可配備時(shí)差成像系統(tǒng)(TLI),利于持續(xù)和動(dòng)態(tài)觀察胚胎發(fā)育,便于發(fā)現(xiàn)卵裂模式異常的胚胎。

綜上所述,D3優(yōu)質(zhì)8細(xì)胞胚胎結(jié)合D2細(xì)胞數(shù)進(jìn)行綜合評估有利于挑選最具發(fā)育潛能的胚胎。在D3優(yōu)質(zhì)胚胎為8細(xì)胞的前提下D2 4細(xì)胞是首選,5細(xì)胞同樣可列為優(yōu)質(zhì)胚胎作為備選。