花鈴期棉花黃萎病抗病與感病品種對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

趙衛(wèi)松，郭慶港，李社增，王培培，鹿秀云，蘇振賀，張曉云，馬平

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000）

0 引言

【研究意義】棉花黃萎病（cotton verticillium wilt）是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）侵染引起的真菌性維管束病害，一般造成棉花減產(chǎn)5%—10%，嚴(yán)重的高達(dá)20%—30%，甚至絕收[1]。該病在我國主要產(chǎn)棉區(qū)均有不同程度的發(fā)生，是導(dǎo)致棉花減產(chǎn)和纖維品質(zhì)下降的主要土傳病害[2-3]。利用抗病品種是防治黃萎病的有效途徑之一。土壤微生物之間具有群體動態(tài)效應(yīng)和復(fù)雜的群落結(jié)構(gòu)，與植物的生長發(fā)育和抗病性之間存在著十分密切的關(guān)系，同時研究表明作物土傳病害的發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[4-5]。通過研究不同抗病性品種土壤微生物多樣性，揭示棉花品種抗病性與土壤微生物的相互關(guān)系，可為棉花黃萎病的生物防治和生態(tài)防治提供理論依據(jù)，同時對指導(dǎo)其他土傳病害的防治也具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，有關(guān)棉花對黃萎病抗病的研究主要集中在組織結(jié)構(gòu)[6]、生理生化（毒素、可溶性糖、酶、激素）[7]、抗病基因[8]等方面，而關(guān)于土壤微生物在抗黃萎病中的作用研究相對較少。微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性是維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和可持續(xù)的重要保障，是影響土壤微生態(tài)環(huán)境中生理活性最重要的因子[9-10]。研究表明，植物病害的發(fā)生與植物內(nèi)生菌的群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，且植物不同生育時期的根際微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異并與品種抗病性存在十分密切的關(guān)系[11-13]。同時發(fā)現(xiàn)，棉花抗/感品種產(chǎn)生的根系分泌物種類及濃度存在差異，導(dǎo)致根際微生物種類和數(shù)量不同[14]。進(jìn)一步研究表明，根系分泌物并不局限于對根際微生物的影響，可能對整個農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物環(huán)境造成影響[15-17]。土壤養(yǎng)分也顯著影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)[18]。【本研究切入點】鄂荊1號和冀863品種對黃萎病具有不同的抗性，這種抗性除了自身抗病基因外，是否與抗/感品種外界環(huán)境土壤微生物有關(guān)，以及抗/感品種間土壤微生物是否存在多樣性和種群結(jié)構(gòu)的差異，目前尚未見報道。在國家實施“化肥、農(nóng)藥雙減”的背景下，針對目前棉花黃萎病防治困難以及關(guān)于棉花抗/感品種在發(fā)病時期（主要為花鈴期）不同階段土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成變化及其與黃萎病的相互關(guān)系尚缺乏系統(tǒng)的研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】以棉花抗/感黃萎病品種為研究材料，通過高通量測序（Illumina MiSeq）技術(shù)研究抗/感品種在花鈴期不同階段的土壤細(xì)菌群落組成變化，分析細(xì)菌群落組成與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，探討細(xì)菌群落組成和品種抗病性的關(guān)系，以期為棉花黃萎病的綠色防控提供新途徑和新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)域概況

河北省曲周縣位于冀南平原，是我國五大商品棉主要生產(chǎn)基地，年平均氣溫13.1℃，無霜期平均為210 d，平均降水量為556.2 mm，70%的降水集中在6—9月。棉花是當(dāng)?shù)刂饕姆N植作物[19]。試驗在曲周縣槐橋鄉(xiāng)西漳頭村銀絮專業(yè)合作社開展。

1.2 試驗材料

供試棉花品種鄂荊1號（感黃萎病品種，EJ）和冀863（抗黃萎病品種，J863）均為晚熟品種，分別由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所和曲周縣銀絮專業(yè)合作社提供。

1.3 試驗設(shè)計與土壤樣品采集

2018年4月20日播種棉花，每個處理3次重復(fù)，每小區(qū)面積為45 m2（長60 m，寬0.75 m），行距0.75 m，株距0.35 m，為了避免土壤環(huán)境因素導(dǎo)致的誤差，不同品種種植采用小區(qū)間隔排列。在棉花生長期間，按照當(dāng)?shù)厣a(chǎn)技術(shù)進(jìn)行肥水和蟲草害管理。分別在盛花期（7月19日）、開花后期（8月22日）和結(jié)鈴期（9月3日），按照“W”形采用多點取樣法，用取土器在棉花行間距離棉花根部10 cm采集0—20 cm耕作層的土壤，每小區(qū)采集約500 g土壤混勻裝于自封袋中，一部分于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)土壤微生物群落分析，一部分用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 黃萎病調(diào)查 在黃萎病發(fā)生時期（黃河流域主要從7月中旬至9月上旬），按照李社增等[20]分級標(biāo)準(zhǔn)于盛花期、開花后期和結(jié)鈴期分別調(diào)查不同品種的發(fā)病率和病情指數(shù)，分別用EJ-7、EJ-8、EJ-9和J863-7、J863-8、J863-9表示，并按照如下公式計算發(fā)病率和病情指數(shù)。病情調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)如下，0級：棉株健康，無病葉，生長正常；1級：棉株1/4以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；2級：棉株1/4以上，1/2以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；3級：棉株1/2以上，3/4以下葉片發(fā)病，變黃萎蔫；4級：棉株3/4以上葉片發(fā)病，或葉片全部脫落，棉株枯死。

發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100；

病情指數(shù)（DI）=∑（相應(yīng)病級×各級病株數(shù)）/（最高病級×總株數(shù)）×100。

1.4.2 土壤細(xì)菌群落高通量測序 土壤基因組DNA的提取按照FastDNATMSPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）試劑盒說明書進(jìn)行，DNA的純度和濃度由NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Fisher Scientific Inc.，Waltham，MA，USA）進(jìn)行檢測。細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)采用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[21]進(jìn) 行 擴(kuò)增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對其目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。文庫構(gòu)建和高通量測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.4.3 土壤中大麗輪枝菌ITS基因拷貝數(shù)量的測定在盛花期、開花后期和結(jié)鈴期，按照1.3方法采集耕作層土壤，提取DNA，將其作為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：2×Master Mix（德國DBI Bioscience公司）10 μL，大麗輪枝菌ITS上下游引物[22]（F：CCCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG；R：CGGGACTCCGATGCGAGCTGTAAC）各1 μL，DNA 1 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火并延伸30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，得到不同時間樣本的循環(huán)閾值（Ct），根據(jù)趙衛(wèi)松等[23]前期建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算土壤中大麗輪枝菌ITS基因的拷貝數(shù)量。

1.4.4 土壤理化性質(zhì)測定 采用酸度計對土壤pH進(jìn)行測定[24]；采用KCl浸提-靛酚藍(lán)比色法分別對銨態(tài)氮和硝態(tài)氮進(jìn)行測定[24-25]；采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法對速效磷進(jìn)行測定[24]；以硫酸亞鐵為標(biāo)準(zhǔn)溶液采用分光光度法按照土壤有機(jī)質(zhì)含量測定說明書步驟進(jìn)行測定[24]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行整理，Origin 8.6進(jìn)行作圖，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、獨立樣本T檢驗和鄧肯新復(fù)極差法（DMRT）多重比較統(tǒng)計分析。采用Canoco 4.5軟件對樣本微生物群落進(jìn)行主成分分析（PCA）和冗余分析（RDA），并利用CanoDraw軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 花鈴期不同階段土壤理化性質(zhì)測定

棉花抗/感品種在花鈴期不同階段對土壤理化性質(zhì)存在不同程度的影響。除了土壤中無機(jī)磷含量外，感病品種EJ土壤的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、pH、速效磷和有機(jī)質(zhì)在盛花期均高于抗病品種J863。由盛花期至結(jié)鈴期，銨態(tài)氮和速效磷含量呈現(xiàn)先顯著下降后上升的趨勢，硝態(tài)氮和有機(jī)質(zhì)含量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，pH在感病品種中變化幅度較大且存在差異，而在抗病品種中差異不顯著，無機(jī)磷含量均呈現(xiàn)先顯著上升后下降的趨勢。其中，硝態(tài)氮和無機(jī)磷含量下降幅度較大，在感病品種EJ和抗病品種J863土壤中硝態(tài)氮含量分別由66.28、45.77 mg·kg-1降至2.70、7.31 mg·kg-1，無機(jī)磷含量分別由252.37、277.60 μg·g-1降至89.69、100.95 μg·g-1（表1）。

2.2 棉花抗/感品種黃萎病發(fā)生調(diào)查

在棉花盛花期、開花后期和結(jié)鈴期調(diào)查抗/感品種黃萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)，由圖1可知，感病品種EJ發(fā)病率在不同時期均顯著高于抗病品種J863；而病情指數(shù)僅在開花后期和結(jié)鈴期顯著高于抗病品種J863。

2.3 棉花抗/感品種土壤中大麗輪枝菌的數(shù)量

由圖2可見，感病品種EJ在開花后期和結(jié)鈴期土壤中大麗輪枝菌ITS拷貝數(shù)量顯著高于盛花期，分別提高了8.19%和8.38%；對于抗病品種J863，在開花后期和結(jié)鈴期土壤中病原菌ITS拷貝數(shù)量顯著低于盛花期，且分別降低了6.03%和8.86%；除了在盛花期外，抗病品種土壤中的大麗輪枝菌ITS拷貝數(shù)均低于感病品種。

2.4 土壤細(xì)菌多樣性分析

F檢驗結(jié)果表明（表2），EJ和J863在盛花期和開花后期土壤細(xì)菌的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)顯著高于結(jié)鈴期，而Shannon和Simpson指數(shù)在花鈴期不同階段差異不顯著；J863在盛花期和結(jié)鈴期的細(xì)菌豐富度Chao1和ACE指數(shù)均高于EJ，而均勻度Shannon和Simpson指數(shù)在花鈴期不同階段差異不顯著。

表1 土壤理化性質(zhì)測定Table 1 Detection of soil physicochemical properties

圖1 棉花抗/感品種的黃萎病發(fā)生調(diào)查Fig.1 Investigation of verticillium wilt in cotton resistant/susceptible varieties

表2 棉花抗/感品種在花鈴期不同階段的細(xì)菌測序量和群落多樣性Table 2 Bacterial sequencing and community diversity of cotton resistant/susceptible varieties at different flowering and boll stages

圖2 花鈴期不同階段棉花抗/感品種土壤中大麗輪枝菌ITS拷貝數(shù)量Fig.2 ITS gene copy number of V.dahliae in soil of cotton resistant/susceptible varieties at different flowering and boll stages

2.5 棉花抗/感品種細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

抗/感品種樣本的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析表明（圖3），所有樣品在主成分坐標(biāo)中位于不同的象限，說明抗/感品種在不同時期土壤樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，門水平下第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）分別可以解釋所有變量的59.5%和31.0%，2個主成分方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)到90.5%，說明其能夠表征微生物群落組成的特征，感病品種EJ位于第三、四象限，抗病品種J863位于第一、二象限；屬水平下第一主成分（PCA1）和第二主成分（PCA2）分別可以解釋所有變量的60.6%和19.3%，2個主成分方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)到79.9%，說明其能夠表征微生物群落組成的特征，EJ位于第二、三限，J863位于第一、四象限，同一個橢圓代表品種在不同時期的微生物群落組成，品種之間不存在交叉重疊，說明抗/感品種的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。

圖3 棉花抗/感品種在門（A）和屬（B）水平下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of soil bacterial community structure of cotton resistant/susceptible varieties at phylum (A) and genus (B) levels

門水平下抗/感品種土壤細(xì)菌群落組成的研究結(jié)果表明（圖4），感病品種EJ和抗病品種J863在盛花期（EJ-7/J863-7）、開花后期（EJ-8/J863-8）和結(jié)鈴期（EJ-9/J863-9）獲得的前15個豐度較高的菌群分別為變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、Rokubacteria、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、Latescibacteria、Patescibacteria、裝甲菌門（Armatimonadetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和Entotheonellaeota，其相對豐度分別介于29.97%—34.66%、14.77%—20.97%、12.17%—20.37%、10.17%—12.87%、6.97%—8.69%、2.78%—4.04%、2.28%—3.72%、1.83%—2.49%、1.14%—1.64%、0.75%—0.95%、0.38%—1.23%、0.27%—0.69%、0.09%—0.22%、0.11%—0.20%和0.07%—0.18%。其中感病品種EJ的部分菌群平均相對豐度低于抗病品種J863，如放線菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、硝化螺菌門、Patescibacteria和裝甲菌門，平均降低幅度分別為16.38%、4.05%、2.25%、6.58%、7.10%、20.60%和35.78%。

差異顯著性分析表明，在結(jié)鈴期，抗病品種土壤的變形菌門菌群的相對豐度顯著下降；在盛花期和開花后期，抗/感品種間差異不顯著。由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種土壤的酸桿菌門和芽單胞菌門的相對豐度呈顯著下降趨勢，而抗病品種表現(xiàn)為顯著上升，且抗病品種顯著高于感病品種。由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種土壤的放線菌門、綠彎菌門和Patescibacteria菌群的相對豐度分別表現(xiàn)為顯著上升，而抗病品種表現(xiàn)為顯著下降，其中在盛花期，感病品種土壤的放線菌門菌群相對豐度顯著低于抗病品種，在結(jié)鈴期品種間差異不顯著；在盛花期，感病品種土壤的綠彎菌門菌群的相對豐度顯著低于抗病品種，而在開花后期和結(jié)鈴期顯著高于抗病品種。由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種土壤的Rokubacteria菌群的相對豐度表現(xiàn)為顯著下降，而抗病品種差異不顯著。在不同生育時期，擬桿菌門、浮霉菌門、硝化螺菌門、疣微菌門、厚壁菌門和Entotheonellaeota菌群的相對豐度變化抗/感品種間差異均不顯著。

屬水平下抗/感品種菌群的相對豐度研究結(jié)果表明（圖5），感病品種EJ和抗病品種J863在盛花期（EJ-7/J863-7）、開花后期（EJ-8/J863-8）和結(jié)鈴期（EJ-9/J863-9）獲得的前20個豐度較高的菌群分別為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Haliangium、硝化螺菌屬（Nitrospira）、Bryobacter、Iamia、Dongia、Pseudarthrobacter、芽球菌屬（Blastococcus）、Luedemannella、紅色桿菌屬（Rubrobacter）、Gaiella、類諾卡氏屬（Nocardioides）、Pontibacter、Ilumatobacter、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Gemmatirosa、微單孢菌屬（Micromonospora）和Solirubrobacter，其相對豐度分別介于12.84%—26.80%、5.79%—16.78%、6.07%—10.14%、4.41%—11.38%、6.18%—9.02%、4.71%—8.30%、2.00%—6.45%、3.13%—5.16%、2.81%—4.96%、2.25%—5.51%、2.14%—3.95%、2.01%—5.08%、1.87%—5.16%、1.23%—5.97%、1.19%—4.41%、2.03%—3.67%、0.70%—3.47%、1.13%—3.04%、0.87%—3.82%和0.71%—2.32%。其中，感病品種EJ的平均相對豐度低于抗病品種J863的菌群包括鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Bryobacter、Iamia、Pseudarthrobacter、芽球菌屬、紅色桿菌屬、類諾卡氏屬、Pontibacter、鏈霉菌屬、Gemmatirosa、微單孢菌屬和Solirubrobacter，與抗病品種J863相比，上述菌群平均相對豐度下降幅度分別為5.09%、19.41%、13.79%、2.36%、10.78%、34.47%、46.76%、61.84%、52.75%、48.61%、74.79%、9.13%和26.42%。

圖4 棉花抗/感品種在門水平下細(xì)菌群落組成相對豐度變化（前15個）Fig.4 Relative abundance of bacterial community composition of cotton resistant/susceptible varieties at phylum level (top 15)

圖5 棉花抗/感品種在屬水平下細(xì)菌群落組成相對豐度變化（前20個）Fig.5 Relative abundance of bacterial community composition of cotton resistant/susceptible varieties at genus level (top 20)

差異顯著性分析結(jié)果表明，由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種土壤中鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和Pontibacter菌群的相對豐度表現(xiàn)為顯著下降，而抗病品種表現(xiàn)為顯著上升；在盛花期，上述菌群的相對豐度品種間差異不顯著，而在其他時期抗病品種顯著高于感病品種。感病品種土壤的溶桿菌屬菌群相對豐度呈顯著下降趨勢，而抗病品種呈現(xiàn)先顯著上升后下降的趨勢；在盛花期，感病品種該菌群的相對豐度高于抗病品種，在其他生育時期內(nèi)抗/感品種間差異不顯著。由盛花期至結(jié)鈴期，感病品種Haliangium菌群的相對豐度呈顯著上升趨勢，而在抗病品種呈顯著下降趨勢；在結(jié)鈴期，感病品種該菌群的相對豐度高于抗病品種，其他時期品種間差異不顯著。在生育期內(nèi)抗/感品種硝化螺菌屬的相對豐度呈上升趨勢但差異不顯著。在結(jié)鈴期，抗病品種土壤Bryobacter和Iamia菌群的相對豐度顯著高于感病品種，其他時期品種間差異不顯著。在結(jié)鈴期，感病品種Dongia和Ilumatobacter菌群的相對豐度顯著高于抗病品種，其他時期品種間差異不顯著。在生育期內(nèi)，Pseudarthrobacter和Luedemannella的相對豐度在品種間差異不顯著。在盛花期，抗病品種土壤的芽球菌屬、微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群的相對豐度均顯著高于感病品種，其他時期品種間差異不顯著。在結(jié)鈴期，紅色桿菌屬的相對豐度品種間差異不顯著，其他時期該菌群抗性品種顯著高于感病品種。在生育期內(nèi)，感病品種土壤Gaiella菌群的相對豐度呈顯著上升趨勢，而抗病品種差異不顯著，且感病品種高于抗病品種。在結(jié)鈴期，感病品種土壤類諾卡氏屬菌群的相對豐度顯著低于抗病品種，其他時期差異不顯著。在開花后期，鏈霉菌屬的相對豐度品種間差異不顯著；在盛花期和結(jié)鈴期，抗病品種的相對豐度顯著高于感病品種。在生育期內(nèi)，抗病品種土壤Gemmatirosa菌群的相對豐度高于感病品種，且在抗病品種中呈顯著上升趨勢。

2.6 細(xì)菌屬水平群落組成與土壤理化性質(zhì)的冗余分析（RDA）

屬水平土壤中優(yōu)勢細(xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性分析表明（圖 6），優(yōu)勢細(xì)菌群落對土壤理化性質(zhì)的響應(yīng)不同。其中，相對豐度較高的鞘氨醇單胞菌屬和溶桿菌屬與硝態(tài)氮、無機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，Bryobacter與無機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，芽單胞菌屬與無機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)相關(guān)性不大，Haliangium和硝化螺菌屬與銨態(tài)氮、速效磷呈正相關(guān)，硝化螺菌屬與硝態(tài)氮、無機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。

進(jìn)一步研究表明，抗/感品種在花鈴期不同階段的細(xì)菌群落組成與土壤理化性質(zhì)之間存在相關(guān)性。其中，感病品種EJ在盛花期（EJ-7）和開花后期（EJ-8）的細(xì)菌群落組成與硝態(tài)氮、無機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，結(jié)鈴期（EJ-9）與速效磷、銨態(tài)氮呈正相關(guān)；抗病品種J863在盛花期（J863-7）的細(xì)菌群落組成與硝態(tài)氮、無機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，在開花后期（J863-8）的細(xì)菌群落組成與硝態(tài)氮、無機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，在結(jié)鈴期（J863-9）的細(xì)菌群落組成與上述土壤理化指標(biāo)之間相關(guān)性不大。

3 討論

3.1 不同抗性品種對土壤微生物群落的影響

雷娟利等[26]研究表明，抗枯萎病西瓜品種根際土壤細(xì)菌的均勻度和多樣性均高于感病品種，并且抗病品種的細(xì)菌數(shù)量高于感病品種，而真菌和放線菌數(shù)量在抗/感品種間不存在相關(guān)性；蔡秋華等[27]通過比較烤煙抗/感青枯病和黑脛病品種的根際土壤微生物變化，發(fā)現(xiàn)抗病品種與根際土壤細(xì)菌和放線菌呈正相關(guān)，而與真菌呈負(fù)相關(guān)；李洪連等[28]通過平板涂布法比較了棉花黃萎病不同抗/感品種與根際土壤微生物的關(guān)系，結(jié)果表明抗病品種的真菌種數(shù)多于感病品種，并且前者區(qū)系組成更為復(fù)雜，抗性品種與真菌數(shù)量呈正相關(guān)，而與細(xì)菌數(shù)量無顯著相關(guān)性。

圖6 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌屬水平群落組成的冗余分析Fig.6 RDA analysis of soil physicochemical properties and bacterial communities at genus level

本研究結(jié)果表明，棉花黃萎病抗/感品種之間的土壤細(xì)菌群落多樣性、結(jié)構(gòu)和組成方面存在差異。群落組成方面，在門水平上，抗病品種的放線菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門、硝化螺菌門、Patescibacteria和裝甲菌門菌群的相對豐度高于感病品種；在屬水平上，抗病品種的鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Bryobacter、Iamia、Pseudarthrobacter、芽球菌屬、紅色桿菌屬、類諾卡氏屬、Pontibacter、鏈霉菌屬、Gemmatirosa、微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群的相對豐度高于感病品種，進(jìn)一步驗證了前人的研究觀點，即抗病品種的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)優(yōu)于感病品種[26,29]，而與李洪連等[28]通過選擇性平板法表明抗病性不同的棉花品種與根際細(xì)菌數(shù)量無明顯相關(guān)性的結(jié)論存在區(qū)別，本研究認(rèn)為對微生物群落的研究方法存在區(qū)別可能是導(dǎo)致研究結(jié)果不同的主要原因之一。此外，抗/感品種的植物根系分泌物種類和含量不同[14]，且根系分泌物能夠影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[13,30-31]，推測根系分泌物是造成抗/感品種根際土壤微生物群落差異的原因之一。關(guān)于作物根系分泌物中的哪些物質(zhì)通過何種代謝途徑對微生物造成影響，有待于進(jìn)一步研究。

3.2 作物生育時期對土壤微生物群落的影響

已有研究表明，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受作物生育時期的影響較為明顯[29-30]。BREIDENBACH等[29]比較了水稻不同生育時期對根際土壤和非根際土壤微生物群落組成的影響，發(fā)現(xiàn)在水稻生長早期草螺菌屬（Herbaspirillum）菌群的相對豐度較高，且根際土壤高于非根際土壤；INCEOGLU等[30]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯不同品種根際土壤微生物受作物生育時期的影響，其中幼苗期和開花期的根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著不同于衰老期；CHAPARRO等[13]比較了擬南芥苗期、抽薹期和開花期根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明幼苗期的土壤微生物群落明顯不同于其他時期，并且指出植物在不同的生育時期能夠招募特定的微生物種類；李洪連等[28]研究表明，抗/感黃萎病棉花品種在根際微生物區(qū)系組成的差異在苗期和現(xiàn)蕾期比較明顯，而在花鈴期差異則顯著降低，說明根際微生物對棉花抗病性的影響在生長前期較大，生長后期則較?。缓萚32]對黃瓜不同生育時期根際土壤微生物的研究發(fā)現(xiàn)，根際微生物主要類群的數(shù)量與其生長發(fā)育呈正相關(guān)，且根際微生物數(shù)量在花期或盛果期時達(dá)到最高峰，之后呈下降趨勢。

本研究結(jié)果表明，在盛花期、開花后期和結(jié)鈴期抗/感品種之間的土壤細(xì)菌群落多樣性差異性存在區(qū)別。對于抗病品種而言，由盛花期至結(jié)鈴期，鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、Pontibacter和Gemmatirosa菌群的相對豐度呈上升趨勢；溶桿菌屬菌群的相對豐度呈先上升后下降趨勢，Haliangium菌群的相對豐度呈下降趨勢。而對于感病品種而言，鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、芽單胞菌屬和Pontibacter菌群的相對豐度呈下降趨勢，Haliangium和Gaiella菌群的相對豐度均呈上升趨勢。此外，由盛花期至結(jié)鈴期，Pseudarthrobacter、硝化螺菌屬和Luedemannella菌群的相對豐度在品種間差異不顯著。在結(jié)鈴期，Bryobacter、Iamia、Dongia、Ilumatobacter和類諾卡氏屬菌群的相對豐度存在差異，而在盛花期和開花后期差異不顯著。在盛花期，芽球菌屬、微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群的相對豐度存在差異，其他時期品種間差異不顯著。在結(jié)鈴期，紅色桿菌屬菌群的相對豐度品種間差異不顯著，其他時期差異顯著；在盛花期和結(jié)鈴期，鏈霉菌屬菌群的相對豐度在品種間存在顯著差異。抗/感品種由盛花期至結(jié)鈴期的病情指數(shù)呈逐步上升趨勢，本研究僅從對土壤細(xì)菌的群落組成變化進(jìn)行了研究，而抗/感品種受黃萎病菌侵染后根際微生物和植物內(nèi)生菌的組成及變化情況有待于進(jìn)一步探究。

3.3 病原菌數(shù)量與作物品種抗病性的關(guān)系

許多學(xué)者從土壤和植株組織中的病原菌數(shù)量與作物品種抗病性的關(guān)系角度開展研究[33-35]。劉瓊光等[33]研究表明，根際土壤中青枯菌數(shù)量與番茄品種抗性之間相關(guān)性不高，而植物根內(nèi)青枯菌數(shù)量與番茄品種抗性密切相關(guān)；王卉等[34]研究發(fā)現(xiàn)，青枯菌數(shù)量在番茄抗/感品種之間存在明顯差異，而病原菌數(shù)量在不同品種根部的吸附差異不顯著；吳傳德等[35]研究表明，棉花枯萎病抗病品種根際土壤中病原菌數(shù)量明顯少于感病品種。本研究結(jié)果表明，土壤中大麗輪枝菌的數(shù)量與黃萎病發(fā)生的相關(guān)性存在差異，其中土壤中病原菌數(shù)量與感病品種鄂荊1號的發(fā)病率和病情指數(shù)呈正相關(guān)，而與抗病品種冀863相關(guān)性不強(qiáng)。開花后期和結(jié)鈴期抗病品種冀863土壤中的病原菌ITS拷貝數(shù)低于感病品種鄂荊1號。

3.4 土壤理化性質(zhì)與微生物群落的關(guān)系

土壤養(yǎng)分、pH、有機(jī)質(zhì)等土壤理化性質(zhì)是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素[36-37]。ZHOU等[38]研究表明，連續(xù)多年施氮顯著影響了土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)變化，該團(tuán)隊進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)土壤pH、有機(jī)碳和硝態(tài)氮含量是導(dǎo)致東北黑土中氨氧化古菌群落差異的主要因素[39]，SUN等[40]施氮后獲得了相似的研究結(jié)果。

菌群屬水平的研究結(jié)果表明，抗病品種許多優(yōu)勢菌群的相對豐度高于感病品種，并且在特定時期微生物菌群的相對豐度在抗/感品種間存在顯著差異，如在開花后期和結(jié)鈴期，抗病品種土壤的鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬和Pontibacter菌群的相對豐度呈顯著上升趨勢，而感病品種反呈下降趨勢，且抗病品種高于感病品種。鞘氨醇單胞菌屬菌群與硝態(tài)氮、無機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，而與銨態(tài)氮和速效磷呈負(fù)相關(guān)。芽單胞菌屬和Gemmatirosa菌群與硝態(tài)氮呈正相關(guān)，而與其他理化性質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。此外，盡管溶桿菌屬菌群與硝態(tài)氮、無機(jī)磷、pH和有機(jī)質(zhì)呈正相關(guān)，但抗/感品種間的相對豐度差異不顯著。類諾卡氏屬菌群與速效磷呈負(fù)相關(guān)，而紅色桿菌屬和鏈霉菌屬菌群與速效磷呈正相關(guān)；芽球菌屬菌群與土壤理化性質(zhì)不具有相關(guān)性；微單孢菌屬和Solirubrobacter菌群與銨態(tài)氮和速效磷呈負(fù)相關(guān)。

綜合分析抗/感品種在花鈴期不同階段的土壤微生物群落組成與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，可為合理施肥提高不同生育時期土壤優(yōu)勢菌群的相對豐度，進(jìn)而提高植物的抗病性提供科學(xué)依據(jù)。因此，通過施用不同類型的氮肥（銨態(tài)氮型和硝態(tài)氮型）來改善土壤特定優(yōu)勢菌群的相對豐度是今后研究的內(nèi)容之一。此外，土壤溫度和濕度亦是重要的環(huán)境因子[41-42]，其如何對土壤中微生物群落和病原菌數(shù)量產(chǎn)生影響亦有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

土壤中大麗輪枝菌的數(shù)量與棉花抗/感品種黃萎病發(fā)生的相關(guān)性存在差異，其中土壤中病原菌數(shù)量與感病品種鄂荊1號的發(fā)病率和病情指數(shù)呈正相關(guān)，而與抗病品種冀863相關(guān)性不強(qiáng)?？共∑贩N在盛花期、開花后期和結(jié)鈴期土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)優(yōu)于感病品種，并且生育時期的優(yōu)勢菌群存在不同程度的差異。土壤中細(xì)菌的多樣性、相對豐度和組成受有機(jī)質(zhì)、pH、氮素類型、速效磷等指標(biāo)影響。同時，棉花不同生育時期對土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯影響。