腸膜明串珠菌對蜜柚果醋釀造過程中品質變化影響

李 汀 ，鄒 波，吳繼軍，劉忠義，肖更生，徐玉娟，余元善，鄒 穎

（1.湘潭大學 化工學院，湖南 湘潭 411105；2.廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所，廣東 廣州 510610）

柚子（Citrus maxima（Burm）Merr.）又名文旦，是蕓香科柑橘亞科柚子屬植物。柚子營養(yǎng)豐富，富含有機酸、維生素、礦物質、黃酮類化合物等，具有抗動脈粥樣硬化[1]、降血壓[2]、降血脂[3]、抗炎[4-7]、抗氧化[8-10]、抗癌[11]等作用，保健價值高。

廣東省是我國柚子主產區(qū)之一，2017年僅梅州市柚子產量就達87.1萬t，占我國柚產量的25%左右。梅州蜜柚果肉約占果實鮮質量的70%，酸甜多汁[12-13]，目前以鮮食為主，年加工量不足產量1%，嚴重制約了梅州蜜柚產業(yè)的進一步發(fā)展。將柚子果肉開發(fā)成果汁比較常見，但將其加工成果醋等產品較少，且關于蜜柚果醋的研究多集中于發(fā)酵工藝的優(yōu)化，對發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分及品質變化的研究鮮見報道。

柚子苦味物質主要包括黃烷酮糖苷類化合物和類檸檬苦素兩大類，其中類檸檬苦素的苦味閾值遠低于黃烷酮糖苷類化合物[14]。研究表明[15]，柑橘類水果中檸檬苦素含量極少，但是由于其前體檸檬苦素酸A環(huán)內酯（limonoate A ring lactone，LARL）的存在，榨汁時LARL從果實中溶出，在酸性條件下或加熱條件下，LARL會轉化為檸檬苦素，致使榨汁前不苦的果汁慢慢變苦，嚴重影響口感。因此，柑橘類水果發(fā)酵制果醋的生產工藝中，脫苦研究尤為關鍵。目前國內外報道了吸附法[16]、包埋法[17]、酶法[18]等脫苦方法，但吸附法會損失大量的營養(yǎng)成分，包埋法容易造成柚子產品返苦，酶法脫苦主要針對柚皮苷，對檸檬苦素無影響[18]。有研究表明[19-21]，乳酸菌能降低胡柚果汁的檸檬苦素和柚皮苷的含量，腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）具有耐低pH和高乙醇濃度的特性，添加腸膜明串珠菌還能使酸度趨向柔和，風味得到改善。

本研究以梅州蜜柚為原料，在柚果醋發(fā)酵初始階段將腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同時接入發(fā)酵罐，研究蜜柚果醋發(fā)酵過程中有機酸，黃酮類化合物及檸檬苦素的變化，探究腸膜明串珠菌對蜜柚果醋酸味，苦味等感官品質以及抗氧化能力的影響。以期為梅州蜜柚果醋的工業(yè)生產提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

梅州蜜柚：2018年10月采摘于廣東梅州。腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）：廣東省微生物菌種保藏中心；BO213釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：法國Laffort公司；巴氏醋酸菌（Pasteuria acetate）AS1.41：廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 化學試劑

甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純）：德國Merck公司；圣草次苷（純度99.26%）、柚皮苷（純度98.06%）、野漆樹苷（純度99.61%）、蘆?。兌?8.00%）、橙皮素（純度98.90%）、檸檬苦素（純度98.30%）、對羥基苯甲酸（純度99.00%）、咖啡酸（純度99.99%）、芥子酸（純度98.60%）、乳酸（純度98.50%）、乙酸（純度98.90%）、檸檬酸（純度98.00%）標準品：上海源葉生物科技有限公司；間苯三酚（純度98.90%）：山東西亞化學股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800型分光光度計、LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；PB-10型pH計：德國賽多利斯公司；Uplc1290-6540BQ-TOF高效液相色譜四級桿飛行時間質譜聯(lián)用儀（highperformance liquid chromatography system with quadrupole-time of flightmass spectrometer，HPLC-QTOF-MS）：美國安捷倫公司；MultiskanFC多功能酶標儀：美國賽默飛世爾公司；UV1800型紫外可見分光光度計：日本島津公司；PB-10型pH計：德國Sartorius公司；ZD-2酸堿滴定儀：上海儀電科技股份有限公司；RP-101 折光儀：日本愛宕有限公司；Infinite M200PRO酶標儀：瑞士TECAN公司；JW-1042低速離心機：安徽嘉文儀器裝備有限公司；HWS電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；PB-J-S02E破壁料理機：江門市貝爾斯頓電器有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；ZHWY恒溫振蕩培養(yǎng)器：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜜柚果醋釀造工藝流程及操作要點

操作要點：

蜜柚汁的制備：將蜜柚去皮、去囊、去籽，果肉破碎榨汁之后，3 000 r/min離心5 min去渣，得到蜜柚果汁清汁用以發(fā)酵。

果汁成分調整[22]：用檸檬酸鈉調pH到4.0，再加入蔗糖使可溶性固形物達15.0°Bx。

酵母菌的活化：根據(jù)BO213釀酒酵母推薦接種量0.3 g/L，稱取0.6 g BO213釀酒酵母，加入30 mL含4%蔗糖溶液中，35～37 ℃活化20 min。

腸膜明串珠菌的活化復壯：在滅菌后的50 mL MRS肉湯中接入于-20 ℃凍藏的乳酸菌100 μL，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)（18±1）h。

酒精發(fā)酵：酵母活化液起泡后直接接入含2 L蜜柚果汁的發(fā)酵罐，同時接入1%活化腸膜明串珠菌于發(fā)酵罐，開始酒精發(fā)酵。另設單獨釀酒酵母發(fā)酵為對照組，溫度調節(jié)至（28±1）℃發(fā)酵，每隔24 h取樣一次，柚果汁酒精發(fā)酵時間為48 h左右。

醋酸菌的活化：稱取葡萄糖1 g，酵母粉1 g，水100 g加入三角瓶中，滅菌后加入3 mL無水乙醇及巴氏醋酸菌（Pasteuria acetate）AS1.41，置于30 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)（48±1）h。

醋酸發(fā)酵：接種5%活化醋酸菌，發(fā)酵醪轉入淺盤于（30±1）℃開始醋酸發(fā)酵，用多層濾布封口，24 h取樣一次，檢測其酒精度，發(fā)酵72 h左右得到蜜柚原醋。

殺菌：蜜柚原醋在95 ℃條件下滅菌5 min，得到成品。

1.3.2 分析檢測

pH值采用pH計直接測定；總酸（以醋酸計）的測定采用直接滴定法[23]；總糖采用直接滴定法[24]；酒精度的測定采用酒精計；總黃酮含量的測定采用硝酸鋁比色法[25]；有機酸含量的測定采用HPLC法，其色譜條件：C18色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm）；柱溫30℃；檢測波長210nm；流動相0.1 mol/L的（NH4）2HPO4（pH2.70）；流速1 mL/min；進樣量10 μL；檢測器為二極管陣列檢測器（diode-array detector，DAD）；酚類化合物的鑒定采用HPLC-QTOF-MS法，其HPLC色譜條件：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相A 乙腈，流動相B水（含0.2%甲酸），梯度洗脫程序：乙腈初始濃度為0%，10 min后升至60%，15 min時升至90%，16 min時降至10%并保持4 min。進樣量5 μL，檢測波長280 nm，流速：0～16 min為0.400 mL/min，到20 min時升至1 mL/min。柱溫保持40 ℃。MS條件：電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子源，正負離子掃描模式，毛細管電壓4.5 kV；霧化器壓力1.5 bar；干燥溫度300℃，干燥氣體流速8.0L/min，質量掃描范圍100～1 100 m/z。黃酮類及酚酸類含量的測定采用HPLC法，其色譜條件分別為：Wondasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A（4%磷酸溶液），流動相B（乙腈），梯度洗脫程序如下：0～10 min，8% B；10～55 min，8%～18% B；55～55.01 min，18%～70%B；55.01～60 min，70%B，60～60.01 min，70%～8%B；60.01～66 min，8%B；每個樣品之間平衡10 min，進樣量10 μL，流速1 mL/min，檢測波長210 nm、255 nm、287 nm、322nm；柱溫35℃，外標法標曲質量濃度范圍為2.5～100mg/L；Waters C18色譜柱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A（超純水），流動相B（甲醇），梯度洗脫程序如下：0～10 min，40%～60%B；10～15 min，60%～80%B；15～20 min，80%～60% B；20～25 min，60%～40% B，25～30 min，40% B；每個樣品之間平衡10 min，進樣量10 μL，流速0.8 mL/min，檢測波長330 nm、280 nm，柱溫30 ℃，外標法標曲質量濃度范圍為2.5～100 mg/L。

1.3.3 抗氧化活性測定

（1）清除DPPH·能力的測定

參考林羨等[26]的方法，用酶標儀測定樣品在波長517 nm處的吸光度值。DPPH·清除率計算公式如下：

式中：A1為對照組吸光度值；A0為試劑空白組吸光度值；Ai為樣品組吸光度值；Aj為樣品空白組吸光度值。

（2）氧自由基吸收能力的測定

氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）的測定參考STEED L E等[27]的方法進行，采用Trolox為標準品，樣品的ORAC值以Trolox當量（Trolox equivalent，TE）表示（μmol TE/g）。

1.3.4 感官評價

參考國標GB/T 18187—2000《釀造食醋》對蜜柚果醋進行感官評分，選取10名經驗豐富的品鑒人員做蜜柚果醋的感官分析，分別從色澤，口味，氣味和組織狀態(tài)進行打分，以每一項平均值的總和作為醋品質綜合評分[28]，蜜柚果醋感官評價標準見表1。

表1 蜜柚果醋感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of pomelo vinegar

1.3.5 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行方差分析，結果以平均值±標準偏差表示，并用Origin8.5軟件制圖。

2 結果分析

2.1 蜜柚果醋發(fā)酵過程中總糖、酒精度、pH、總酸的變化

0～48 h為酒精發(fā)酵階段，48～120 h為醋酸發(fā)酵階段，發(fā)酵過程中總糖、酒精度、pH總酸的變化結果見圖1。

由圖1A可知，發(fā)酵前48 h混菌發(fā)酵組及對照組中總糖含量均隨著發(fā)酵的進行迅速降低，分別由132.63 g/L降為4.71 g/L和10.42 g/L，結果表明，酒精發(fā)酵階段混菌發(fā)酵組總糖消耗量較對照組要大，這可能由于腸膜明串珠菌也參與消耗總糖。發(fā)酵時間＞48 h之后，總糖含量趨于穩(wěn)定，發(fā)酵120 h時總糖含量分別為0.76 g/L和1.18 g/L。為了使混菌發(fā)酵組和對照組同時進行醋酸發(fā)酵，且發(fā)酵到48 h時混菌發(fā)酵組和對照組總糖基本消耗完全，酒精度也均達到最大值，因此選擇在發(fā)酵48 h時同時接入醋酸菌。

由圖1B可知，發(fā)酵0～48 h混菌發(fā)酵組及對照組中酒精度呈上升趨勢，發(fā)酵至48h時酒精度均達到最大值，且混菌發(fā)酵組酒精度為7.87%vol，顯著低于對照組的酒精度8.33%vol（P＜0.05），可能由于混菌發(fā)酵組中的少量總糖被乳酸菌利用，這一部分的總糖并沒有轉化成酒精。發(fā)酵時間＞48 h之后，醋酸菌利用乙醇產生醋酸，使混菌發(fā)酵組及對照組中酒精度呈下降趨勢，發(fā)酵至120 h，混菌發(fā)酵組和對照組的酒精度分別為0.37%vol和0.10%vol，表明醋酸發(fā)酵基本結束。

由圖1C可知，蜜柚果汁的最初pH值為3.97，在酒精發(fā)酵階段（0～48 h），混菌發(fā)酵組的pH值呈上升趨勢，在48 h達到4.41，可能是與混菌發(fā)酵組的檸檬酸的降解以及乳酸的增加有關，而對照組則略微下降為3.90。在醋酸發(fā)酵階段（48～120 h），兩組pH值均呈下降趨勢，這是由于此階段產生大量醋酸有關，發(fā)酵結束時，混菌發(fā)酵組和對照組的pH值分別為3.82和3.56。

圖1 不同發(fā)酵組中總糖（A）、酒精度（B）、pH值（C）和總酸（D）含量的變化Fig.1 Changes of total sugars (A),alcohol (B),pH value (C) and total acids (D) contents in different fermentation groups

由圖1D可知，蜜柚果汁的初始總酸含量為5.78 g/kg，發(fā)酵0～72 h期間，混菌發(fā)酵組的總酸含量始終低于對照組，可能是由于混菌發(fā)酵組的檸檬酸被大量消耗有關。發(fā)酵72～96 h期間由于醋酸菌開始生長繁殖，消耗酒精產生醋酸，所以總酸含量開始呈現(xiàn)緩慢上升趨勢，發(fā)酵96～120 h期間，醋酸菌大量繁殖，醋酸轉化速率相應加快，所以呈現(xiàn)快速升高的趨勢。發(fā)酵過程中總酸的變化與pH值的變化呈負相關，醋酸發(fā)酵結束時混菌發(fā)酵組和對照組的總酸含量分別達到46.30 g/kg和52.19 g/kg。

2.2 蜜柚果醋發(fā)酵過程中有機酸的變化

0～48 h為酒精發(fā)酵階段，48～120 h為醋酸發(fā)酵階段，發(fā)酵過程中有機酸變化結果見圖2。

圖2 不同發(fā)酵組中乳酸（A）、乙酸（B）、檸檬酸（C）含量的變化Fig.2 Changes of lactic acid (A),acetic acid (B),citric acid (C)contents in different fermentation groups

由圖2A可知，在酒精發(fā)酵期間（0～48 h），混菌發(fā)酵組的乳酸含量明顯增加，在發(fā)酵時間48 h時乳酸含量升至4.32 g/L，顯著高于對照組（P＜0.05），發(fā)酵時間＞48 h之后，乳酸含量總體呈下降趨勢，發(fā)酵120 h時下降至1.17 g/L，而對照組發(fā)酵過程中乳酸含量無顯著變化（P＞0.05）。這可能是腸膜明串珠菌進行了檸檬酸-乳酸發(fā)酵。醋酸發(fā)酵后，混菌發(fā)酵組的乳酸含量明顯降低，這可能是因為醋酸發(fā)酵過程中乳酸被氧化或與乙酸反應轉化為乳酸乙酯[29]。

由圖2B可知，在發(fā)酵48 h時混菌發(fā)酵組的乙酸含量顯著高于對照組（P＜0.05），可能由于腸膜明串珠菌在酒精發(fā)酵階段產生乙酸；進入醋酸發(fā)酵后，兩組的乙酸含量迅速增加，在發(fā)酵120 h 時，混菌發(fā)酵組和對照組的乙酸含量分別達到36.86 g/L，40.02 g/L，且混菌發(fā)酵組的乙酸含量顯著低于對照組（P＜0.05），這可能因為對照組酒精發(fā)酵階段積累的酒精充分轉化為乙酸，使對照組的乙酸含量最終高于混菌發(fā)酵組。

由2C可知，在酒精發(fā)酵期間（0～48 h），檸檬酸含量明顯降低，在發(fā)酵48 h時，檸檬酸含量降至0.24 g/L，顯著低于對照組（P＜0.05），發(fā)酵48 h之后，檸檬酸含量趨于平穩(wěn)。對照組發(fā)酵過程中檸檬酸含量沒有下降。這可能是由于混菌發(fā)酵組的腸膜明串珠菌消耗了檸檬酸產生其他物質以及用于自身的生長消耗。

2.3 蜜柚果醋發(fā)酵過程中總黃酮，ORAC值和DPPH自由基清除能力的變化

0～48 h為酒精發(fā)酵階段，48～120 h為醋酸發(fā)酵階段，發(fā)酵過程中總黃酮，ORAC值和DPPH自由基清除能力的變化結果見圖3。

由圖3A可知，混菌發(fā)酵組和對照組的總黃酮含量整個發(fā)酵階段均呈先下降后上升的趨勢，分別在24 h和48 h開始上升，在醋酸發(fā)酵階段呈現(xiàn)明顯上升趨勢，說明加入腸膜明串珠菌進行混菌發(fā)酵加快總黃酮的積累。發(fā)酵120 h時，混菌發(fā)酵組和對照組的總黃酮含量達到0.59 g/L和0.56 g/L，較蜜柚果汁總黃酮含量分別上升了78.79%和69.70%，且混菌發(fā)酵組總黃酮含量顯著高于對照組（P＜0.05）。說明醋酸發(fā)酵有利于柚果醋黃酮物質含量的增加，在發(fā)酵初期添加腸膜明串珠菌，總黃酮含量增加更為明顯。

由圖3B可知，對照在整個發(fā)酵過程中清除DPPH自由基能力始終呈現(xiàn)下降趨勢，而混菌發(fā)酵組在進入醋酸發(fā)酵后的清除DPPH自由基能力逐漸上升，發(fā)酵120 h時，混菌發(fā)酵組的清除DPPH自由基能力為43.94%，顯著高于對照組的40.10%（P＜0.05），說明腸膜明串珠菌參與柚果醋的釀造增強了醋酸發(fā)酵階段的清除DPPH自由基能力。

由圖3C可知，混菌發(fā)酵組和對照組的ORAC值在酒精發(fā)酵期間均呈上升趨勢，混菌發(fā)酵組的ORAC值在發(fā)酵48 h時達到最大值29.53 μmol TE/g，顯著低于對照的33.32 μmol TE/g（P＜0.05）。但進入醋酸發(fā)酵之后，由于醋酸發(fā)酵階段應處于有氧環(huán)境，兩組的ORAC值均呈現(xiàn)下降趨勢，其中對照組下降較快，發(fā)酵120 h后，混菌發(fā)酵組的ORAC值顯著高于對照組（P＜0.05），這說明腸膜明串珠菌能增強了柚果醋的抗氧化能力。

2.4 蜜柚果醋中酚類化合物

為了研究發(fā)酵對柚子多酚以及苦味成分的影響。采用HPLC-QTOF-MS法測定混菌發(fā)酵組和對照組的酚類化合物，結果見表2。由表2可知，共鑒定出9種酚類物質和1種類檸檬苦素，包括5種黃酮類化合物：圣草次苷、柚皮苷、野漆樹苷、蘆丁、橙皮素；4種酚酸類物質：對羥基苯甲酸、咖啡酸、間苯三酚、芥子酸；1種類檸檬苦素：檸檬苦素。

蜜柚果醋發(fā)酵過程中酚類化合物含量的變化見表3。由表3可知，柚果汁中酚類組成最少，柚果酒中新增咖啡酸，而柚果醋中新增對羥基苯甲酸和芥子酸，其中混菌發(fā)酵組醋酸發(fā)酵結束時對羥基苯甲酸含量為5.07 mg/L，顯著高于對照組（P＜0.05）。酒精發(fā)酵階段，間苯三酚、野漆樹苷、蘆丁、橙皮素均呈上升趨勢，其中混菌發(fā)酵組野漆樹苷和蘆丁上升較快，表明發(fā)酵初期添加腸膜明串珠菌能增加野漆樹苷和蘆丁的釋放，而醋酸發(fā)酵階段，對照組間苯三酚、野漆樹苷、蘆丁繼續(xù)上升，但橙皮素則顯著下降，與混菌發(fā)酵組趨勢相反。上述結果表明，腸膜明串珠菌能改變柚果醋酚類化合物的組成，增加對羥基苯甲酸和橙皮素的含量，減少野漆樹苷和蘆丁的含量，這可能與腸膜明串珠菌和酵母菌、醋酸菌的相互作用有關，其機理尚待進一步闡明。

表2 蜜柚果醋中酚類化合物鑒定Table 2 Identification of phenolic compounds in pomelo vinegar

表3 混菌發(fā)酵組和對照組中酚類物質的含量變化Table 3 Changes of phenolic compounds contents in mixed-strains fermentation group and control group mg/L

柚皮苷和檸檬苦素是柚果汁中兩種主要的苦味物質，常規(guī)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵對其影響較小，添加腸膜明串珠菌后，柚皮苷在酒精發(fā)酵階段降解較多，下降幅度為38.4%，醋酸發(fā)酵階段含量略有上升；而檸檬苦素在酒精發(fā)酵階段略有下降，在醋酸發(fā)酵階段下降較多，下降幅度為44.7%。以上結果表明，在柚子果醋發(fā)酵初始階段添加腸膜明串珠菌，可起到降低柚子果醋苦味的作用。

2.5 蜜柚果醋的感官評價

蜜柚果醋的感官評價結果見表4。由表4可知，對色澤和組織狀態(tài)方面，對照組的評分均高于混菌發(fā)酵組，但在統(tǒng)計學上并沒有顯著性差異（P＞0.05）。另外混菌發(fā)酵組在滋味的分數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05）?；炀l(fā)酵組和對照組的總分分別為82.7分和78.6分，加入腸膜明串珠菌有利于柚果醋品質的提升?；炀l(fā)酵組豐富了有機酸組成，使口感更加柔和，降低了苦味物質的含量，更容易被人接受。

表4 混菌發(fā)酵組和對照組柚果醋樣品的感官評分Table 4 Sensory scores of pomelo vinegar samples in mixed-strains fermentation group and control group

3 結論

與對照組相比，腸膜明串珠菌與酵母菌混菌發(fā)酵可消耗檸檬酸，增加柚果醋中乳酸含量，減少乙酸的刺激感；顯著增加氧化自由基吸收能力（ORAC值）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力（P＜0.05）；顯著提升柚果醋中總黃酮含量（P＜0.05）。從柚果醋中共鑒定出9種酚類化合物和1種檸檬苦素，其發(fā)酵過程中新生成了對羥基苯甲酸，咖啡酸和芥子酸。與柚果汁相比，果醋中對羥基苯甲酸、芥子酸、咖啡酸、間苯三酚、野漆樹苷、蘆丁和橙皮素含量均上升，其中混菌發(fā)酵組的柚果醋中對羥基苯甲酸和橙皮素顯著高于對照組（P＜0.05）。此外，混菌發(fā)酵還能顯著降低柚皮苷和檸檬苦素，從而降低柚果醋的苦味。以上結果可為梅州蜜柚果醋釀造工業(yè)提供一定的理論基礎。