響應(yīng)面法優(yōu)化超壓腸桿菌利用黃水生產(chǎn)微生物絮凝劑

楊慧敏，曾禮蘭，賀富強(qiáng)，胡 承

（四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610064）

微生物絮凝劑是一類具有絮凝活性的微生物體或微生物代謝產(chǎn)物或分泌物，其主要成分是多糖、蛋白質(zhì)及脫氧核糖核酸等物質(zhì)[1-3]。目前，微生物絮凝劑主要應(yīng)用于廢水懸浮顆粒的去除、乳濁液的油水分離、改善污泥沉降性能、降低高濃度有機(jī)廢水中的有機(jī)物質(zhì)、重金屬的富集[4-7]。微生物絮凝劑具有無(wú)毒性、無(wú)二次污染、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[8-9]，但由于生產(chǎn)成本高，導(dǎo)致其工業(yè)化發(fā)展緩慢。

目前，眾多研究以淀粉廢水[10-11]、蜜糖廢水[12]、養(yǎng)豬廢水[13]、乳制品廢水[14]、啤酒廢水[15-16]等作為替代培養(yǎng)基生產(chǎn)微生物絮凝劑。利用黃水作替代培養(yǎng)基，生產(chǎn)微生物絮凝劑的報(bào)道較少[17]。

黃水是傳統(tǒng)濃香型白酒釀造中特有副產(chǎn)物[18]。一般情況下，每生產(chǎn)1000kg大曲酒，大約會(huì)產(chǎn)生黃水300～400kg[19]。黃水pH范圍在3～4，高化學(xué)需氧量（chemicaloxygendemand，COD）25 000～40 000 mg/L；高生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）25 000～30 000 mg/L[20]。黃水中含有大量的有機(jī)物質(zhì)，如含氮化合物、還原糖及種類豐富的有機(jī)酸、醇、醛等物質(zhì)，經(jīng)氣相色譜分析，黃水中含有8.2 g/L的還原糖、2.6%的乙醇、4.73 g/L的總酸以及多種微量成分[21]。

本研究以黃水作為替代培養(yǎng)基，采用單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超壓腸桿菌（Enterobacter nimipressuralis）利用黃水培養(yǎng)基生產(chǎn)微生物絮凝劑培養(yǎng)條件，既降低了微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本，也有效的降低了黃水中的有機(jī)物濃度，達(dá)到以廢治廢，為生產(chǎn)微生物絮凝劑的廉價(jià)培養(yǎng)基選取提供了科學(xué)依據(jù)，也探索了廢水資源化利用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與黃水

超壓腸桿菌（Enterobacter nimipressuralis）：由本實(shí)驗(yàn)室篩選和保藏；黃水：取自四川省成都市水井坊公司水井坊基地，密封保存在4 ℃冰箱中，備用。

1.1.2 化學(xué)試劑

NaOH、鹽酸、CaCl2（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏（生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；高嶺土：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，去離子水1 000 mL，pH7.2～7.4。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

PRACTUM224-1CN電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；PHS-2C筆式pH計(jì)：上?？祪x儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HWS-150立式恒溫培養(yǎng)搖床：上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；721E型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物絮凝劑的制備

將菌株按5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在設(shè)定的條件下，經(jīng)培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液即為微生物絮凝劑。

1.3.2 絮凝率的測(cè)定[22]

稱取0.5 g高嶺土置于燒杯中，加入98 mL去離子水，50 g/L的CaCl2溶液1 mL，1 mL發(fā)酵液，180 r/min充分?jǐn)嚢? min，靜置10 min。測(cè)定上清液的OD550nm值，每組實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行，去離子水作空白對(duì)照。絮凝率計(jì)算公式如下：

式中：η為絮凝率，%；A為絮凝處理前上清液于波長(zhǎng)550 nm處的吸光度值；B為絮凝處理后上清液于波長(zhǎng)550 nm處的吸光度值。

1.3.3 黃水培養(yǎng)基的制備

用去離子水將黃水按不同體積比稀釋并配制為黃水培養(yǎng)基，使黃水所占的體積比分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%；同時(shí)將黃水與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基按不同體積比混合，配制成黃水與牛肉膏蛋白胨混合培養(yǎng)基，如上，黃水所占體積比為10%～100%。將菌株分別接種到稀釋為不同倍數(shù)的黃水培養(yǎng)基中和混合培養(yǎng)基中。在恒溫?fù)u床中，溫度32 ℃、130 r/min，振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定發(fā)酵液絮凝率。

1.3.4 培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

最佳碳氮源的確定：分別以5 g/L的葡萄糖、2.5 g/L蔗糖及2.5 g/L可溶性淀粉作為碳源，5 g/L NaCl為無(wú)機(jī)鹽，分別加入5 g/L蛋白胨、5 g/L牛肉膏、5 g/L酵母浸粉、5 g/L胰蛋白胨、2.5 g/L NH4Cl、1 g/L尿素，測(cè)定發(fā)酵液絮凝率。

最佳無(wú)機(jī)鹽的確定：以10%黃水、5 g/L葡萄糖和1 g/L尿素為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加2.5 g/L NaCl、CaCl2、MgSO4、KCl、FeSO4，接入5%的種子液，培養(yǎng)后測(cè)定發(fā)酵液絮凝率。

分別調(diào)整黃水體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%、30%；葡萄糖添加量為2.5 g/L、5.0 g/L、7.5 g/L、10.0 g/L、12.5 g/L、15.0 g/L；尿素添加量為0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L、1.25 g/L、1.50 g/L、1.75 g/L；KCl添加量為1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L；接種量為4%、6%、8%、10%、12%、14%；培養(yǎng)基初始pH值為5、6、7、8、9?？疾禳S水體積比、葡萄糖添加量、尿素添加量、KCl添加量、接種量及初始pH值對(duì)發(fā)酵液絮凝率的影響。

1.3.5 培養(yǎng)條件Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用N=12試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以絮凝率（Y）為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)黃水體積分?jǐn)?shù)（A）、葡萄糖添加量（B）、尿素添加量（C）、KCl添加量（D）、接種量（E）、初始pH（F）這6個(gè)因素進(jìn)行研究，每一個(gè)自變量的高低水平分別以1、-1進(jìn)行編碼，Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1。

表1 培養(yǎng)基成分優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests for medium components optimization

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman測(cè)試結(jié)果中每個(gè)顯著影響因素效應(yīng)的大小，設(shè)定步長(zhǎng)和變化方向，找出峰值，并快速逼近最佳值區(qū)域。

1.3.7 培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)最佳爬坡試驗(yàn)的結(jié)果，將絮凝劑最高的一組作為中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)原理[23]，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件以KCl添加量（A）、尿素添加量（B）、黃水體積分?jǐn)?shù)（C）為評(píng)價(jià)因素，以絮凝率（Y）為響應(yīng)值，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)編碼值與水平見表2。

表2 培養(yǎng)基成分優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests for medium components optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 黃水作為替代培養(yǎng)基制備微生物絮凝劑

2.1.1 產(chǎn)絮菌經(jīng)黃水培養(yǎng)和混合培養(yǎng)對(duì)絮凝效果的影響

由圖1可知，菌株經(jīng)10%的黃水培養(yǎng)與10%的混合培養(yǎng)的絮凝率基本持平，分別為73.83%和74.25%。與混合培養(yǎng)基相比，黃水的成本更低，而且達(dá)到了廢物利用的效果，因此，最適黃水體積分?jǐn)?shù)為10%。

圖1 產(chǎn)絮凝劑菌經(jīng)純黃水培養(yǎng)和混合培養(yǎng)對(duì)絮凝效果的影響Fig.1 Effect of flocculant-producing bactrium after pure Huangshui medium and mixed medium culture on flocculation efficiency

2.1.2 不同碳氮源對(duì)絮凝效果的影響

碳氮源種類對(duì)產(chǎn)絮菌分泌微生物絮凝劑有一定的影響[24]。由圖2可知，菌株可以利用多種碳氮源來(lái)產(chǎn)生微生物絮凝劑，當(dāng)碳氮源組合為葡萄糖和尿素時(shí)，菌株的絮凝率為77.35%，所以菌株的最佳碳氮源組合是葡萄糖和尿素。

圖2 不同碳氮源對(duì)絮凝效果的影響Fig.2 Effect of different carbon and nitrogen sources on flocculation efficiency

2.1.3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)絮凝效果的影響

在培養(yǎng)基中加入無(wú)機(jī)鹽，其中的金屬離子能中和并使生物高分子表面官能團(tuán)所帶的負(fù)電荷穩(wěn)定，有效的促進(jìn)產(chǎn)絮菌的產(chǎn)絮性能[25]。由圖3可知，KCl是最佳無(wú)機(jī)鹽。

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)絮凝效果的影響Fig.3 Effect of different inorganic salts on flocculation efficiency

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同體積分?jǐn)?shù)黃水對(duì)絮凝效果的影響

由圖4可知，絮凝率隨著黃水體積分?jǐn)?shù)的增加，呈現(xiàn)先快速增加又緩慢下降的趨勢(shì)。當(dāng)黃水體積分?jǐn)?shù)為15%時(shí)，絮凝率最大為78.75%。黃水中的乙醇可以促進(jìn)產(chǎn)絮菌生產(chǎn)微生物絮凝劑[10]。黃水體積分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)其中不利于菌體生存繁殖的物質(zhì)（如糠醛）積累或黃水濃度過(guò)低其中的有機(jī)物質(zhì)不足，不利于產(chǎn)絮菌的生長(zhǎng)，則抑制了其代謝產(chǎn)物的分泌。因此，最佳黃水體積分?jǐn)?shù)為15%。

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)黃水對(duì)絮凝效果的影響Fig.4 Effect of different volume fraction of Huangshui on flocculation efficiency

2.2.2 不同葡萄糖添加量對(duì)絮凝效果的影響

如圖5所示，當(dāng)葡萄糖添加量＜7.5 g/L時(shí)，絮凝率隨著葡萄糖添加量的增加而增加。當(dāng)葡萄糖添加量＞7.5 g/L時(shí)，絮凝率隨著葡萄糖添加量的增加反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)葡萄糖添加量為7.5 g/L時(shí)，絮凝率最大為80.7%。因此，最佳葡萄糖添加量為7.5 g/L。

圖5 不同葡萄糖添加量對(duì)絮凝效果的影響Fig.5 Effect of different glucose addition on flocculation efficiency

2.2.3 不同尿素添加量對(duì)絮凝效果的影響

如圖6所示，當(dāng)尿素添加量＜1.25 g/L時(shí)，絮凝率隨著尿素添加量的增加而迅速增加；當(dāng)尿素添加量＞1.25 g/L時(shí)，絮凝率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)尿素添加量為1.25 g/L時(shí)，絮凝率最大為78.9%。因此，最佳尿素添加量為1.25 g/L。

圖6 不同尿素添加量對(duì)絮凝效果的影響Fig.6 Effect of different urea addition on flocculation efficiency

2.2.4 不同KCl添加量對(duì)絮凝效果的影響

如圖7所示，當(dāng)KCl添加量＜2.5 g/L時(shí)，絮凝率隨著KCl添加量的增加而升高；當(dāng)KCl添加量＞2.5 g/L時(shí)，絮凝率隨著KCl添加量的增加反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)KCl添加量為2.5g/L時(shí)，絮凝率最大為80.77%。因此，最佳KCl添加量為2.5 g/L。

圖7 不同KCl添加量對(duì)絮凝效果的影響Fig.7 Effect of different KCl addition on flocculation efficiency

2.2.5 不同接種量對(duì)絮凝效果的影響

圖8 不同接種量對(duì)絮凝效果的影響Fig.8 Effect of different inoculum on flocculation efficiency

如圖8所示，當(dāng)接種量較低時(shí)，絮凝率較低，隨著接種量在4%～6%范圍內(nèi)的增加，絮凝率也隨之上升，當(dāng)接種量為6%時(shí)，絮凝率最大為81.74%。當(dāng)接種量＞6%，雖然適應(yīng)期縮短了許多，但是由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分一定，營(yíng)養(yǎng)消耗過(guò)快，菌體易老化不利于產(chǎn)物的生成和積累，因而導(dǎo)致絮凝率下降。因此，最佳接種量為6%。

2.2.6 初始pH不同對(duì)絮凝率的影響

如圖9所示，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為5～7時(shí)，絮凝率隨初始pH增加而增大；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為7時(shí)，絮凝率最大為79.32%；當(dāng)初始pH＞7之后，絮凝率稍有下降。因此，最佳初始pH為7。

圖9 不同初始pH值對(duì)絮凝效果的影響Fig.9 Effect of different initial pH on flocculation efficiency

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)，以絮凝率（Y）為響應(yīng)值，采用Plackett-Burman（N=12）試驗(yàn)考察影響絮凝效果的8個(gè)因素的顯著性。Plackett-Burman試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3，主效應(yīng)分析采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行，結(jié)果見表4。

表3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman tests for medium components optimization

通過(guò)F值檢測(cè)相關(guān)因素的顯著性，由表4可知，模型的F值16.98，P值為0.003 5＜0.05，說(shuō)明得出的一階回歸模型是顯著的，擬合程度高，可以用于理論預(yù)測(cè)。因素黃水體積分?jǐn)?shù)（P=0.002 1＜0.05）、尿素添加量（P=0.016 2＜0.05）、KCl添加量（P=0.001 2＜0.05）為顯著性因素。因此對(duì)黃水體積分?jǐn)?shù)、尿素添加量和KCl添加量這3個(gè)顯著因子進(jìn)一步優(yōu)化。

表4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化Plackett-Burman試驗(yàn)主效應(yīng)分析Table 4 Main effects analysis of Plackett-Burman tests for medium components optimization

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)是確定逼近中心點(diǎn)的顯著影響因素的取值以及提高絮凝率，黃水體積分?jǐn)?shù)、尿素添加量及KCl添加量這3個(gè)因素的變化方向和步長(zhǎng)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。由表5可知，3個(gè)顯著影響因素的中心點(diǎn)在第3組試驗(yàn)附近，因此確定第3組的水平作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，即黃水體積分?jǐn)?shù)20%、尿素添加量1.5 g/L及KCl添加量3 g/L。

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest ascent tests for medium components optimization

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基成分

以KCl添加量（A），尿素添加量（B）黃水體積分?jǐn)?shù)（C）為影響因素，絮凝率（Y）作為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見表6，方差分析結(jié)果見表7。

表6 培養(yǎng)基成分優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests for medium components optimization

續(xù)表

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表6數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到響應(yīng)面二次回歸方程：Y=84.52+0.46A+0.96B-0.70C-0.50AB-1.73AC-0.38BC-6.09A2-5.37B2-3.83C2。模型的P值＜0.000 1，說(shuō)明模型的二次擬合方程是高度顯著的，失擬項(xiàng)P值為0.379 6＞0.05，說(shuō)明失擬因素不存在，該回歸方程可以用于初步分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)B、C對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）、二次項(xiàng)A2、B2、C2和交互項(xiàng)AC對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

KCl添加量、尿素添加量和黃水體積分?jǐn)?shù)各因素兩兩交互對(duì)絮凝率的影響結(jié)果見圖10。

由圖10a可知，三維曲面圖較為緩和，等高線呈較緩和的橢圓形，說(shuō)明尿素與KCl添加量的交互作用相對(duì)較小。由圖10b可知，三維曲面圖最為陡峭，等高線呈明顯的橢圓形，說(shuō)明黃水體積分?jǐn)?shù)與KCl添加量交互作用相對(duì)顯著。由圖10c可知，三維曲面圖較為緩和，等高線呈較緩和的橢圓形，說(shuō)明尿素添加量與黃水體積分?jǐn)?shù)的交互作用相對(duì)較小。

通過(guò)軟件Design-Expert 8.0.6軟件分析得到最佳培養(yǎng)基成分為3.02 g/L KCl，1.52 g/L尿素，17.23%黃水，此時(shí)絮凝率理論值為84.6124%。結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際操作的可行性，將上述最優(yōu)培養(yǎng)基組分修正為3.0 g/L KCl，1.5 g/L尿素，17%黃水。以響應(yīng)面分析得到的最佳結(jié)果進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)3次，測(cè)得絮凝率實(shí)際平均值為84.35%，與理論值基本吻合。

圖10 KCl添加量、尿素添加量及黃水體積分?jǐn)?shù)對(duì)絮凝率影響的響應(yīng)面曲面及等高線Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between KCl addition,urea addition and Huangshui volume fraction on flocculation rate

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，超壓腸桿菌產(chǎn)絮凝劑優(yōu)化發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH值7，接種量6%，黃水體積分?jǐn)?shù)為17%，葡萄糖添加量為7.5g/L、尿素添加量為1.5g/L、KCl添加量為3 g/L。在此最佳培養(yǎng)基條件下，絮凝劑的絮凝率可達(dá)到84.35%。該研究為超壓腸桿菌利用黃水培養(yǎng)基生產(chǎn)微生物絮凝劑的研究及應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。