不同干燥方法對(duì)牡丹皮藥材中化學(xué)成分的影響△

趙秋龍，卞曉坤，錢大瑋*，張麗，陳菲菲 ，郭盛，嚴(yán)輝，王團(tuán)結(jié)，趙建軍，段金廒

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；3.寧夏醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004

牡丹皮為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，性苦、辛，微寒，有清熱涼血、活血化瘀之效[1]。現(xiàn)代研究表明，牡丹皮中主要含有酚及酚苷類、單萜苷類、有機(jī)酸類、黃酮類、苯丙素類及鞣質(zhì)類等化學(xué)成分[2-3]，這些成分多具有顯著的生物活性，為牡丹皮發(fā)揮傳統(tǒng)功效提供物質(zhì)基礎(chǔ)。牡丹皮產(chǎn)地傳統(tǒng)加工方法為夏、秋二季，選晴天，分次采割后曬干。傳統(tǒng)干燥方法存在干燥周期長(zhǎng)、易受天氣條件影響、干燥后藥材質(zhì)量不均一等弊端[4]。近年來，基于現(xiàn)代干燥原理與技術(shù)的干燥方法逐漸應(yīng)用于中藥材產(chǎn)地加工過程中，并表現(xiàn)為效率高、條件可控、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[5]。

本研究擬通過分析不同干燥條件處理后牡丹皮中各類成分的含量變化規(guī)律，優(yōu)化和建立牡丹皮藥材適宜的干燥方法及條件，為牡丹皮藥材的產(chǎn)地干燥提供依據(jù)。

1 材料

電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；隧道式中短波紅外干燥機(jī)(江蘇泰州圣泰科紅外科技有限公司)；隧道式微波干燥機(jī)(南京研正微波設(shè)備廠)；ACQUITY UPLC系統(tǒng)(四元泵溶劑系統(tǒng)，在線脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器；Waters公司)；Xevo TQ檢測(cè)器(Waters公司)；MassLynx4.1質(zhì)譜工作站(Waters公司)；ML204電子分析天平、MS105電子分析天平(萬分之一，梅特勒-托尼多儀器有限公司)；水分測(cè)定儀(德國(guó)Adam公司)；KQ-250E型超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)儀器有限公司)；D2012高速臺(tái)式離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器北京有限公司)。

牡丹皮新鮮藥材采挖于安徽亳州譙城區(qū)譙東鎮(zhèn)牡丹皮種植基地，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定為毛茛科植物牡丹的新鮮根皮，憑證標(biāo)本存放于江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心。對(duì)照品：丹皮酚原苷(批號(hào)：DPYG20161220)、牡丹皮苷C(批號(hào)：MDGC20151211)、丹皮酚(批號(hào)：DPF20160828)、氧化芍藥苷(批號(hào)：YHYG20151121)、芍藥苷(批號(hào)：SYG20160108)、沒食子酰芍藥苷(批號(hào)：MSYG20160601)、苯甲酰芍藥苷(批號(hào)：BJYG20161011)、沒食子酸(批號(hào)：MSZS20140901)、對(duì)羥基苯甲酸(批號(hào)：DQJS20141212)、沒食子酸甲酯(批號(hào)：MSJZ20161013)、苯甲酸(批號(hào)：BJS20161109)、兒茶素(批號(hào)：ECS20160315)、槲皮素(批號(hào)：HPS20160618)、6-羥基香豆素(批號(hào)：QJDS20160921)、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖(批號(hào)：QMTT20160811)、香草乙酮(批號(hào)：XCYT20161102)均購(gòu)自南京春秋生物工程有限公司，純度≥98%；甲醇(南京化學(xué)試劑有限公司)為分析純，乙腈(Merck)及甲酸(美國(guó)ACS公司)均為色譜純，超純水由Milli-Q純水機(jī)制備。

2 方法

2.1 干燥加工方法

取牡丹皮新鮮藥材，清洗攤曬，待表面水分揮干，混合均勻，隨機(jī)分成14份，每份約1 kg，按表1所示加工方法進(jìn)行干燥。干燥前取適量新鮮藥材，測(cè)定其初始含水率，干燥過程觀察、稱質(zhì)量并計(jì)算實(shí)時(shí)含水率，當(dāng)含水率達(dá)到13.0%時(shí)，停止干燥并留樣。

表1 牡丹皮藥材不同干燥方法樣品信息

2.2 色譜及質(zhì)譜條件

色譜分析條件：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；以0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～5 min，95%～90%A；5～7 min，90%～75%A；7～10 min，75%～50%A；10～15 min，50%～5%A)；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：3 μL。進(jìn)樣前以流動(dòng)相初始條件平衡5 min。

質(zhì)譜檢測(cè)條件：ESI源；掃描方式ESI+、ESI-模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：3 kV，錐孔電壓：20 V，萃取電壓：3 V，離子源溫度：150 ℃，脫溶劑氣溫度：400 ℃；錐孔氣流量：50 L·h-1；輔助氣流：0.15 mL·min-1；各種成分的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取丹皮酚原苷、牡丹皮苷C、丹皮酚、氧化芍藥苷、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、沒食子酸、對(duì)羥基苯甲酸、沒食子酸甲酯、苯甲酸、兒茶素、槲皮素、6-羥基香豆素、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖、香草乙酮對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容制成各對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于同一量瓶中，制成混合對(duì)照品溶液，其中各成分的質(zhì)量濃度分別為72.4、63.6、129.4、95.6、121.4、100.7、110.6、122.2、125.7、179.4、121.5、109.1、91.6、120.3、99.40、100.0 μg·mL-1。并將上述混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋成不同濃度的混合工作液。

2.4 供試品溶液的制備

取牡丹皮藥材粉末(過4號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)45 min，放至室溫，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，13 000 r·min-1(離心半徑4.6 cm)離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察與檢測(cè)下限、定量下限測(cè)定 精密量取2.3項(xiàng)下混合對(duì)照品工作液3 μL，按2.2項(xiàng)下的分析條件進(jìn)行測(cè)定。以被測(cè)化合物質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，并按信噪比(S/N)為10和3分別計(jì)算被測(cè)成分的定量下限(LOQ)和檢測(cè)下限(LOD)。結(jié)果見表3，各成分線性良好，r均在0.990 0以上。

2.5.2精密度試驗(yàn) 取中濃度混合對(duì)照品工作液，按2.2項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次以測(cè)定待測(cè)成分的峰面積，各指標(biāo)成分峰面積的RSD值評(píng)價(jià)儀器精密度，結(jié)果見表4。

2.5.3重復(fù)性試驗(yàn) 取1號(hào)樣品6份，按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，以各指標(biāo)峰面積的RSD值評(píng)價(jià)重復(fù)性，結(jié)果見表4。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1號(hào)樣品，按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以樣品中各指標(biāo)成分峰面積計(jì)算RSD，結(jié)果見表4。

2.5.5加樣回收率試驗(yàn) 取0.5 g已知含量的1號(hào)樣品6份，每份精密稱定，加入與樣品中各成分含量相近的各對(duì)照品，按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液并按上述條件測(cè)定，計(jì)算平均回收率和RSD值。結(jié)果見表4。

表2 牡丹皮中各成分MRM參數(shù)

表3 各成分回歸方程、線性范圍、檢測(cè)下限與定量下限

表4 各成分方法學(xué)考察

2.6 樣品測(cè)定

取不同干燥方法處理的樣品及一份鮮品適量，制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。每個(gè)樣品平行3次，以均值作為測(cè)定結(jié)果，見表5。

3 結(jié)果與分析

3.1 主成分分析(PCA)

為綜合評(píng)價(jià)不同干燥方法對(duì)牡丹皮化學(xué)成分的影響，以1～14號(hào)干燥品各類成分含量組成14×16矩陣，采用SPSS 22.0對(duì)矩陣進(jìn)行主成分分析(PCA)。

前4個(gè)主成分的特征值均大于或接近1，見表6，說明前4個(gè)因子在反映牡丹皮不同干燥品的內(nèi)在質(zhì)量起著主導(dǎo)作用，4個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)82.844%，能夠較客觀地反映牡丹皮不同干燥品的內(nèi)在質(zhì)量，故選取4個(gè)主成分進(jìn)行分析。

牡丹皮苷C、芍藥苷、沒食子酰芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、兒茶素、6-羥基香豆素、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖在PC1上有較高載荷，見表7，說明PC1主要反映了這些物質(zhì)的信息；同理，PC2主要反應(yīng)了丹皮酚、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、苯甲酸、香草乙酮等成分的信息；PC3主要反應(yīng)了對(duì)羥基苯甲酸、槲皮素的信息；PC4主要反應(yīng)了丹皮酚原苷、沒食子酸的信息。即前4個(gè)主成分基本包含了所測(cè)牡丹皮16個(gè)成分的信息。

采用4個(gè)主成分對(duì)牡丹皮不同干燥方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。以各主成分因子得分與方差貢獻(xiàn)率乘積之和相加，得出各牡丹皮干燥品各類成分總因子得分值F，其綜合評(píng)價(jià)函數(shù)為：F=0.342 61F1+0.234 77F2+0.143 22F3+0.107 84F4。

按綜合評(píng)價(jià)函數(shù)計(jì)算出不同干燥品的綜合得分(F)，見表8。由綜合得分可知，紅外40 ℃干燥得分最高，紅外50 ℃次之。

表5 不同干燥方法牡丹皮樣品中各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=3) mg·g-1

樣品編號(hào)對(duì)羥基苯甲酸沒食子酸甲酯苯甲酸兒茶素槲皮素6-羥基香豆素1,2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖香草乙酮10.1730.0130.0391.7060.0461.5785.7330.30920.1720.0150.0431.7110.0451.5775.7340.32930.2310.0130.0411.7190.0421.5856.1430.44340.2180.0160.0391.7190.0431.5856.4350.34650.1910.0180.0451.8210.0461.6768.1060.51760.2140.0220.0431.7360.0441.5917.1020.54270.2550.0170.0461.7240.0451.5935.9740.49680.2400.0130.0421.7230.0431.5906.7950.30890.1750.0160.0451.7180.0461.5915.8270.374100.2370.0200.0401.7210.0431.5916.5920.401110.1820.0210.0461.7300.0431.5776.6450.579120.1760.0150.0411.6980.0471.5645.4820.553130.2260.0010.0411.7210.0431.5885.8820.293140.2430.0020.0321.7230.0431.5946.7470.272150.2920.0170.0522.7410.0682.79410.0800.548

表6 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率

4 討論

通過分析不同干燥方法對(duì)牡丹皮中各類成分的影響發(fā)現(xiàn)，干燥后干燥品中酚及酚苷類成分(丹皮酚原苷、牡丹皮苷C、丹皮酚)含量變化最大、變化范圍寬。研究表明，酚類物質(zhì)在植物體內(nèi)的生物合成及代謝易受多酚氧化酶(PPO酶)的影響而氧化成醌類成分[6-7]。上述酚類成分的變化可能由不同干燥條件下PPO酶活性的不同引起的。此外，丹皮酚為牡丹皮藥材中最主要的成分，除微波干燥外，在其他兩種現(xiàn)代干燥方式下，隨著干燥溫度升高，丹皮酚含量先升高后降低，60 ℃時(shí)達(dá)到最大，這可能由于：60 ℃以下，隨著溫度升高，丹皮酚含量損失時(shí)間變短，此階段干燥時(shí)間是主要因素；60 ℃以后，隨著溫度升高，丹皮酚受熱揮發(fā)含量降低，此階段溫度是主要因素[8]。

表7 旋轉(zhuǎn)變換后的因子載荷矩陣

表8 不同干燥加工方法處理的牡丹皮成分含量綜合評(píng)分

單萜苷類成分(氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、沒食子酰芍藥苷及芍藥苷)含量變化趨勢(shì)相似，紅外>微波>熱風(fēng)，這可能由于熱風(fēng)干燥速率慢，物料內(nèi)部不能迅速脫水，干燥時(shí)間較長(zhǎng)使得單萜苷類水解損失較多[9]。微波雖然干燥速率較快，但在干燥初期有一個(gè)瞬間升溫的過程，此過程可能對(duì)牡丹皮中單萜苷類成分造成破壞損失。

有機(jī)酸類成分(沒食子酸甲酯、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、沒食子酸)中沒食子酸是主要成分，含量較高，干燥溫度對(duì)沒食子酸含量影響較大，快速低溫干燥提高了沒食子酸的穩(wěn)定性[10]，且40～60 ℃沒食子酸含量較高。

黃酮類成分槲皮素、兒茶素兩者在曬干后含量下降最多，有研究表明光照促進(jìn)了槲皮素、兒茶素這兩個(gè)成分分解。1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖為鞣質(zhì)類成分，其在干燥后含量較鮮品均降低，這可能由于鞣質(zhì)類成分對(duì)濕熱較敏感，采用一般的干燥方法不能保存其主要成分，其在濕熱條件下可能會(huì)降解[11]。而6-羥基香豆素為苯丙素類，其在3種現(xiàn)代干燥方式下變化趨勢(shì)相似，均隨溫度升高，含量先升高后降低，在溫度為50～60 ℃時(shí)含量較高，且干燥后含量均低于鮮品，曬干樣品中的6-羥基香豆素含量最高[12]。這可能由于6-羥基香豆素為苯丙素類，具有鄰羥基桂皮酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，具有熱不穩(wěn)定性，干燥溫度低有利于有效物質(zhì)的保留[13]。

本研究分析了不同條件干燥后各樣品成分含量，發(fā)現(xiàn)紅外40 ℃干燥綜合得分最高，說明藥材的綜合品質(zhì)最好，并且分析了不同干燥方式下牡丹皮藥材中各類成分含量的變化，為后續(xù)牡丹皮藥材產(chǎn)地干燥過程中穩(wěn)定藥材品質(zhì)提供了支撐，也為根類藥材產(chǎn)地加工共性技術(shù)的形成提供了有益的探索和實(shí)踐。