益心舒片HPLC-ELSD 指紋圖譜

齊元春 鄭艷春 褚 莉王春民?

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德067000； 2.頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 承德067000； 3.河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心，河北 承德067000）

益心舒片源于金元時(shí)期李杲所著《內(nèi)外傷辨惑論》 中的生脈散，由人參、麥冬、黃芪、五味子、丹參、川芎、山楂7 味藥組成，具有益氣復(fù)脈、活血化瘀、養(yǎng)陰生津的功效。其中，人參、丹參為君藥，黃芪、麥冬、川芎為臣藥，五味子、山楂為佐藥［1］。

目前關(guān)于益心舒片質(zhì)量研究的文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要以人參、丹參、五味子中化學(xué)成分的含有量測(cè)定為主［2-5］。指紋圖譜具有信息量大、特征性強(qiáng)、整體性等特點(diǎn)［6-7］，于桂芳等［8］建立了一種益心舒片以五味子和丹參中的化學(xué)成分為主要指標(biāo)的HPLC 指紋圖譜，確定29 個(gè)共有峰，并指認(rèn)出12 個(gè)共有峰，12 個(gè)共有峰成分主要來(lái)自丹參、五味子，但發(fā)現(xiàn)山楂、麥冬、人參藥材對(duì)共有峰幾乎沒(méi)有貢獻(xiàn)，不能反映君藥人參，臣藥黃芪、麥冬所含成分的整體質(zhì)量。因此，本實(shí)驗(yàn)參照2015 年版《中國(guó)藥典》（一部）［9］及相關(guān)文獻(xiàn)［10-14］，建立了以人參、黃芪、五味子和丹參中化學(xué)成分為主要指標(biāo)的HPLC-ELSD 指紋圖譜，通過(guò)共有峰歸屬和指認(rèn)控制益心舒片的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Alltench 3300 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)奧泰公司）；A-10 型全自動(dòng)空氣源（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó) Millipore 公司）；MS204TS／02 型電子天平 ［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；XSE205DU 型電子分析天平［十萬(wàn)分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；HWS26 型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52-99 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 對(duì)照品人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-201128，純度 93.4%）、人參皂苷 Re（批號(hào) 110754-201324，純度 92.7%）、人參皂苷 Rf（批號(hào) 11719-201104）、人參皂苷 Rb1（批號(hào)110704-201223，純度95.9%）、人參皂苷 Rb2（批號(hào) 111715-201203，純度93.8%）、人參皂苷 Rb3（批號(hào) 111686-201203，純度94.3%）、人參皂苷 Rd（批號(hào) 111818-201302，純度94.2%）、五味子醇甲（批號(hào)110857-201412）、隱丹參酮（批號(hào)110852-200806，純度98.7%）、丹參酮ⅡA（批號(hào)110766-200619）、五味子乙素（批號(hào)110765-201311，純度98.8%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；丹參酮Ⅰ（批號(hào)110867-200406）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；人參皂苷Rg2（批號(hào)17072601，純度≥98%）、人參皂苷Rh1（批號(hào)19022802，純度≥98%）、人參皂苷Rc（批號(hào)18092002，純度≥98%）均購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；黃芪甲苷（批號(hào)5081，純度97.2%）購(gòu)于上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司。益心舒片（頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào) 930039、930040、930042、930043、930044、930045、930046、930047、830294、830295）。乙腈、甲醇均為色譜純，均購(gòu)于美國(guó)Mreda 公司；甲醇為分析純，購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為Milli Q 設(shè)備自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，79%～79% B；30～40 min，79%～71.5% B；40～42 min，71.5%～66% B；42～50 min，66%～67% B；50～55 min，67%～62% B；55～65 min，62%～63% B；65～68 min，63%～57% B；68～75 min，57%～55% B；75～100 min，55%～30% B；100～105 min，30%～10% B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；蒸發(fā)光檢測(cè)器參數(shù)，漂移管溫度90 ℃；載氣體積流量1.0 L／min；增益值2。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品加甲醇分別制備成含人參皂苷Rg1 1.002 mg／mL、人參皂苷Re 0.543 mg／mL、人參皂苷Rf 0.305 mg／mL、人參皂苷Rb1 0.495 mg／mL、人參皂苷Rg2 0.234 mg／mL、人參皂苷Rh1 0.36 mg／mL、人參皂苷Rc 0.25 mg／mL、人參皂苷Rb2 0.377 mg／mL、人參皂苷Rb3 0.994 mg／mL、人參皂苷Rd 0.566 mg／mL、黃芪甲苷0.459 8 mg／mL、五味子醇甲0.262 mg／mL、隱丹參酮0.097 6 mg／mL、丹參酮Ⅰ0.098 mg／mL、丹參酮ⅡA0.1 mg／mL、五味子乙素0.081 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 取益心舒10 片，除去包衣，研細(xì)，取約2 g 至索氏提取器中，加75%甲醇150 mL，水浴加熱回流4 h，濾過(guò)，蒸干，殘?jiān)铀?5 mL，微熱使溶解，用水飽和正丁醇，振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇溶液，用氨試液洗滌2 次，每次40 mL，棄去氨試液，將正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 參照2015 年版《中國(guó)藥典》 益心舒片提取制備方法，分別制備缺7 味藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，以人參皂苷Rd 為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD＜4%，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進(jìn)樣，以人參皂苷Rd 為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD＜4%，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.6%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以人參皂苷Rd 為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)峰面積RSD＜4%，相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 共有峰標(biāo)定 選取人參皂苷Rd 為參照峰（S），色譜圖中各色譜峰保留時(shí)間與參照峰（S）保留時(shí)間的比值為相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見圖1。其中34 個(gè)峰為10批樣品所共有，標(biāo)定為共有峰。

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 共有峰通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 年版）分析，中位數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜，見圖1。10 批樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.991、0.989、0.995、0.989、0.984、0.974、0.998、0.978、0.991、0.986，均在0.97 以上。

2.4.3 共有峰歸屬 分別吸取7 種陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL，色譜圖見圖2。通過(guò)陰性比較，共有峰1～14 號(hào)、16 號(hào)、18 號(hào)、19 號(hào)、21 號(hào)、24號(hào)、25 號(hào)、28 號(hào)、29 號(hào)峰歸屬人參，15 號(hào)歸屬黃芪，23號(hào)、31 號(hào)、32 號(hào)、33 號(hào)歸屬丹參，17 號(hào)、20 號(hào)、22 號(hào)、26 號(hào)、27 號(hào)、30 號(hào)、34 號(hào)歸屬五味子；人參對(duì)色譜圖的貢獻(xiàn)最大，其次為五味子、丹參以及黃芪中的黃芪甲苷。

圖1 10 批樣品ELSD-HPLC 指紋圖譜

圖2 共有峰歸屬

2.4.4 共有峰指認(rèn) 通過(guò)對(duì)照品對(duì)共有峰進(jìn)行指認(rèn)，共確定16 個(gè)，見圖3。

3 討論

蒸發(fā)光檢測(cè)器具有通用性，不受流動(dòng)相梯度影響，基線穩(wěn)定，還能用于未知物檢測(cè)的特點(diǎn)［15］。人參皂苷在203 nm波長(zhǎng)下建立益心舒片指紋圖譜，基線發(fā)生較為嚴(yán)重的漂移，色譜峰雜亂，干擾較為嚴(yán)重，不能用于質(zhì)量控制。因此，采用HPLC-ELSD 法，建立益心舒片指紋圖譜，很好的解決了以上問(wèn)題。

同HPLC 指紋圖譜相比，HPLC-ELSD 指紋圖譜增加了對(duì)人參皂苷、黃芪甲苷等皂苷類成分的整體質(zhì)量控制，缺乏對(duì)于阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B 等酚酸類成分的質(zhì)量控制。因此，將兩者相結(jié)合的方式能夠更加準(zhǔn)確、全面的反映和控制益心舒片的質(zhì)量。

指紋圖譜色譜峰分離過(guò)程中，為了增加人參皂苷Rg2、人參皂苷Rh1 與人參皂苷Rc 的分離度，42～50 min 采用66%～67%水相梯度洗脫，能夠在短時(shí)間內(nèi)得到較好的分離度；為了增加人參皂苷Rb3 和黃芪甲苷的分離度，55～65 min采用62%～63%水相的洗脫方式，能夠在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較好的分離度。

本研究對(duì)液相色譜柱的類型［Kromasil 100-5-C18、Inertsil ODS-3、Agilent 5 TC-C18（2）］，柱溫（25、30、35 ℃）、流動(dòng)相（乙腈-0.02% 磷酸、乙腈-水、甲醇-水）進(jìn)行考察，最終確定“2.1”項(xiàng)下條件。

實(shí)驗(yàn)還對(duì)蒸發(fā)光檢測(cè)器漂移管溫度（75、80、90、100 ℃）和載氣體積流量（1.0、1.5、2.0 L／min）進(jìn)行考察，最終確定蒸發(fā)光檢測(cè)器溫度為90 ℃，載氣體積流量1.0 L／min?？疾炝顺曁崛?，索氏提取后正丁醇萃取2 種提取方法，以及不同提取溶劑（50%、75%、100%甲醇）、提取時(shí)間（2、3、4、5 h）的提取效果，發(fā)現(xiàn)索氏提取后正丁醇萃取最好；50%甲醇提取，整體峰面積較低，提取不完全，75%甲醇提取時(shí)，整體峰面積最大，提取最為完全，而100%甲醇提取時(shí)，以人參為主的皂苷類成分峰面積與75%甲醇提取時(shí)無(wú)差異，但以丹參酮ⅡA、隱丹參酮、五味子醇甲和五味子乙素為主的黃酮類成分峰面積明顯更低。另外，75%甲醇索氏提取時(shí)4 h 內(nèi)提取完全，為最佳提取時(shí)間。

本研究在進(jìn)行提取溶劑考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，100%甲醇提取與75%甲醇提取相比，以人參為主的皂苷類成分峰面積無(wú)明顯差異，但以丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、五味子醇甲、五味子乙素為主的脂溶性成分峰面積明顯更低，可能是由于人參皂苷在水和甲醇中均能較好地溶解，所以2 種溶劑提取效果無(wú)明顯差別。五味子和丹參中的脂溶性成分易溶于甲醇，難溶于水，可能是由于益心舒片中皂苷類成分的存在增加其在水中的溶解度，而且75%甲醇提取效果優(yōu)于100%甲醇，具體原因有待進(jìn)一步研究。

圖3 各成分ELSD-HPLC 圖譜