小兒感冒顆粒對H1N1 流感病毒誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的保護作用

朱海燕岑利峰史訓(xùn)龍段娟慧代 志?

（1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海201203； 2.華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，廣東 深圳518110）

999 小兒感冒顆粒是小兒感冒類非處方藥品，是臨床上兒科抗病毒的常用藥，由廣藿香、菊花、連翹、大青葉、板藍根、地黃、地骨皮、白薇、薄荷、石膏組成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功用。999 小兒感冒顆粒用于小兒風(fēng)熱感冒，癥見發(fā)熱、頭脹痛、咳嗽痰黏、咽喉腫痛的患者。藥品說明書已明確999 小兒感冒顆?？梢灾委煾忻?，但針對病毒感染誘導(dǎo)的呼吸道感染的相關(guān)實驗研究未見報道，文獻僅表明999 小兒感冒顆粒在小鼠模型上具有鎮(zhèn)咳祛痰作用［1］。感冒是由病毒或細菌感染所誘發(fā)的上呼吸道感染疾病，病毒感染中以流感病毒最為常見，鑒于此，本研究借助甲型流感病毒H1N1 的小鼠模型，研究999 小兒感冒顆粒對流感病毒誘導(dǎo)肺損傷的保護作用，觀察藥物對病毒復(fù)制以及對相關(guān)炎癥因子、氧化損傷的抑制作用。

1 材料

1.1 動物 BALB／C 小鼠108 只，SPF 級，雄性，體質(zhì)量（14±2）g，由上海靈暢生物科技有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2013-0018。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d，輻照飼料喂養(yǎng)，自由飲水，晝夜明暗交替時間，室溫25 ℃，相對濕度40%。

1.2 病毒株 流感病毒A1 型（H1N1）鼠肺適應(yīng)株FM1（批號20171002），由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供，經(jīng)本研究室（BSL-2 級別）傳代保存，本室已備案，具有操作流感病毒的實驗資質(zhì)。

1.3 藥物與試劑 受試樣品999 小兒感冒顆粒［由華潤三九（棗莊）藥業(yè)有限公司，批號1701012（有效期2019 年12 月）］；利巴韋林原料藥作為陽性藥物（由上海芃碩生物科技有限公司）。脂質(zhì)氧化（MDA）檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號071717171009）；小鼠IFNγELISA 檢測試劑盒（上海船夫生物科技有限公司，批號M2500）；小鼠IL-10 ELISA 檢測試劑盒（上海船夫生物科技有限公司，批號M3400）；小鼠TNF-αELISA 檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供，批號12／2017）；小鼠IL-6 ELISA 檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司提供，批號1508251）。Alsever 氏液由枸櫞酸鈉（二水）8.0 g／L、枸櫞酸（一水）0.55 g／L、葡萄糖20.5 g／L、氯化鈉4.2 g／L 組成，溶解后于121 ℃下滅菌15 min 備用。公雞紅細胞懸液由公雞血按比例為1∶1 迅速混合制備，保存于Alsever 氏液中，冷藏待用。

1.4 儀器 Tissuelyser-24 多樣品組織研磨機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；Allegra 64R 臺式高速冷凍離心機（美國Beckman 公司）；JY12001 電子天平（上海方瑞儀器有限公司）；EPOCH 超微量微孔板分光光度計（美國BioTek 公司）；Forma 702 超低溫冰箱（美國Thermo Scientific 公司）；AF100 制冰機（意大利Scotsman 公司）。

2 方法

2.1 分組 受試動物預(yù)飼養(yǎng)1 天，按體質(zhì)量隨機分為正常組、病毒對照組、陽性藥物對照組（利巴韋林100 mg／kg）及999 小兒感冒顆粒低、中、高劑量組（3、6、12 g／kg）。

2.2 受試藥物配制 稱取利巴韋林原料100 mg，加入0.5% CMCNa 溶液10 mL，配成10 mg／mL 利巴韋林工作口服液。小鼠給藥劑量0.2 mL／20 g，1 次／d。取999 小兒感冒顆粒適量，6 g／袋，用熱蒸餾水研磨，定容配制質(zhì)量濃度分別為200、400、800 mg／mL 999 小兒感冒顆粒溶液，灌胃給藥體積0.3 mL／20 g，1 次／d。

2.3 稀釋毒種及攻毒方法 取甲型流感病毒FM1 H1N1 鼠肺適應(yīng)株，以1640 培養(yǎng)基稀釋成濃度約為2×LD50（相當于儲存液1×10-5稀釋）的病毒液，冰浴保存。除正常組外，其余各組腹腔麻醉后，以滴鼻法感染，左右鼻孔各15 μL，共30 μL／只。攻毒后2 h，開始灌胃給藥，進行急性肺損傷試驗和生存保護試驗。

2.4 藥物對流感病毒感染小鼠的死亡保護試驗 BALB／C鼠，每組12 只，麻醉后經(jīng)滴鼻感染2×LD50的流感病毒2 h后，灌胃給藥，1 次／d，共給藥7 d。各組小鼠均自感染之日起觀察2 周，觀察小鼠發(fā)病癥狀，記錄體質(zhì)量、死亡時間、死亡數(shù)；計算死亡率、死亡保護率、平均生存時間和生命延長率。生命延長率＝［（治療組平均存活天數(shù)-病毒對照組平均存活天數(shù)）／病毒對照組平均存活天數(shù)］×100%。

2.5 藥物對流感病毒感染小鼠的肺損傷保護試驗 BALB／C 鼠，每組6 只，麻醉后經(jīng)滴鼻感染2×LD50的流感病毒2 h后，灌胃給藥，1 次／d，共給藥4 d，病毒感染96 h 后取材，取肺拍照，稱定肺質(zhì)量，體質(zhì)量，進行肺病變評分，計算肺指數(shù)（肺質(zhì)量mg／體質(zhì)量g）。肺組織用PBS 勻漿，離心，分裝凍存，待測。

2.6 病毒感染鼠肺中的病毒效價的測定方法［2］感染后96 h，每組取6 只小鼠脫頸處死，摘取肺臟，取全肺加生理鹽水2 mL 研磨制成勻漿，離心，取上清。按照常規(guī)方法做微量血凝試驗，以出現(xiàn)“＋＋”的肺勻漿上清做為最高稀釋度為血凝終點，該稀釋度即為病毒的血凝效價。將待測鼠的肺均漿液0.1 mL 作為最高濃度，用PBS 進行系列的對倍稀釋加入血凝板中，各孔病毒血凝素的稀釋度順序為1，1／2，1／4，1／8，1／16，1／32，每孔量為0.1 mL 肺勻漿稀釋液。各孔分別加入1%雞紅細胞懸液0.1 mL，立即搖勻，直立靜置，避免震動。放室溫經(jīng)30 min，45 min、1 h 各觀察1 次。以45 min 的觀察結(jié)果為準。每次試驗至少包括一個血球陰性對照組，即于孔內(nèi)加0.1 mL 鹽水和0.1 mL 1%雞紅細胞懸液。

2.7 病毒感染鼠肺中細胞因子、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的測定方法 參照ELISA 試劑盒說明書，分別配制標準品和稀釋肺勻漿樣品，按說明書操作，分別檢測肺勻漿中的TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-10 水平。參照試劑盒說明書，按說明書操作，檢測肺勻漿中的MDA 產(chǎn)物的變化。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用方差分析分析，組間比較采用Dunnett’s test 檢驗，計數(shù)資料采用百分比表示，組間比較采用卡方檢驗。以P≤0.05 表示差異具有統(tǒng)計意義。

3 結(jié)果

3.1 感冒顆粒對流感病毒感染鼠的生存保護作用 病毒對照組感染小鼠7 d 后開始出現(xiàn)死亡，到第9 天共死亡10 只，余2 只存活至14 d。病毒感染后小鼠體質(zhì)量前2 天保持穩(wěn)定增長，第3、4 天體質(zhì)量開始下降，直至出現(xiàn)死亡，存活的動物在感染第9 天后，體質(zhì)量逐漸回升（圖2）。999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染后小鼠生命有保護作用，能延長病毒感染鼠的生命存活時間，降低死亡率。第14 天，低、中、高劑量999 小兒感冒顆粒平均存活時間分別為10.3、11.0、13.5 天，動物生命延長率分別為11.8%、19.1%、47.2%（表1）；病毒對照組14 d 后生存率為16.7%，99 小兒感冒顆粒低、中、高劑量組能顯著提高生存率，分別達到41.7%、58.3、91.7%，利巴韋林治療組生存率達到100%（圖1）。與病毒對照組相比，高劑量治療組顯著性提高動物體質(zhì)量。

表1 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠死亡保護和延長生命的作用

圖1 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠生存保護的作用

圖2 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠體質(zhì)量的影響

3.2 999 小兒感冒顆粒對流感病毒急性感染鼠肺損傷的保護作用 病毒感染小鼠在感染4 d 后體質(zhì)量未見顯著增長，肺部充血水腫導(dǎo)致肺質(zhì)量增加，肺指數(shù)升高。999 小兒感冒顆粒高、中、低劑量組能降低肺指數(shù)，減少肺部充血的面積，減輕肺水腫的程度，降低肺表觀病變率；其中，與病毒對照組比較，高劑量組肺表觀病變率，低、高劑量組肺指數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。利巴韋林作為陽性治療藥物能降低病毒感染鼠的肺指數(shù)（P＜0.01）。見圖3～5。

圖4 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺表觀病變的作用（n＝6）

圖5 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺指數(shù)的作用（n＝6）

3.3 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠肺中病毒復(fù)制的抑制作用 流感病毒的表面主要存在血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種蛋白，血凝素能促進紅細胞的凝集，病毒血凝滴度實驗就是通過觀察紅細胞的凝集狀況，判斷病毒的復(fù)制程度。本實驗結(jié)果顯示，病毒感染4 d 后小鼠肺臟中的病毒增殖活躍，血凝素效價增高。999 小兒感冒顆粒高、中、低治療組對雞紅血球凝集都有一定的抑制活性，流感病毒感染的靶器官組織的病毒拷貝都有一定程度的減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，陽性藥對照組具有顯著的抗病毒活性（P＜0.01）。見圖6。

圖6 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿血凝素效價的作用（n＝6）

3.4 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠肺勻漿中干擾素的影響 IFN-γ 主要由活化的Th 細胞和NK 細胞產(chǎn)生，其生物學(xué)功能主要是免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)多種抗原提呈細胞表達MHC-I／II，活化單核、巨噬細胞并分泌IL-6、TNF-α 等。同時IFN-γ 主要通過與細胞表面受體的結(jié)合，誘導(dǎo)病毒感染細胞產(chǎn)生多種病毒蛋白，使細胞內(nèi)產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)而發(fā)揮抗病毒作用，其抗病毒作用是非特異的。結(jié)果顯示，病毒感染4 d 后小鼠肺臟中的IFN-γ 水平升高（P＜0.05），999小兒感冒高劑量組IFN-γ 水平升高（P＜0.05），陽性藥對照組的IFN-γ 未見升高。見圖7。

表2 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿血凝素效價的抑制作用

3.5 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠肺勻漿中炎性細胞因子的影響 TNF-α 是主要的促炎細胞因子，主要由活化的巨噬細胞，NK 細胞及T 淋巴細胞產(chǎn)生，病毒感染過程中，TNF-α 是主要誘導(dǎo)免疫損傷的效應(yīng)細胞因子。結(jié)果表明，病毒感染小鼠第4 天，小鼠肺中TNF-α 水平升高（P＜0.01），反應(yīng)肺部免疫過度激活，炎性滲出，與病理形態(tài)一致。999 小兒感冒顆粒高、中、低劑量組對肺部的TNF-α水平均有抑制作用（P＜0.01），陽性藥對照組也具有的抑制活性。見圖8。

圖7 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿IFN-γ 的作用（n＝6）

圖8 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿重TNF-α 的作用（n＝6）

IL-6 是主要促炎細胞因子，由激活的巨噬細胞、淋巴細胞及上皮細胞分泌，能被IL-1β 和TNF-α 誘導(dǎo)，參與炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，病毒感染小鼠第4 天，鼠肺中IL-6 水平升高（P＜0.01），肺部局部免疫過度激活。999 小兒感冒顆粒對肺部的IL-6 的水平有抑制作用，尤中高劑量組與病毒組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），陽性藥對照組的抑制IL-6 水平（P＜0.01）。見圖9。

IL-10 主要由淋巴細胞、巨噬細胞和肥大細胞產(chǎn)生。在炎癥、免疫及增殖等方面均有調(diào)節(jié)作用，是一種多功能的細胞因子。在肺的急性炎癥期，IL-10 具有抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 和MIP-1 等炎癥介質(zhì)表達，是一種重要的抗炎性細胞因子，對免疫應(yīng)答主要起抑制作用。結(jié)果表明，病毒感染小鼠第4 天，鼠肺中IL-10 水平降低（P＜0.01），反應(yīng)肺部局部的免疫防御激活。999 小兒感冒顆粒對肺部的IL-10 的分泌有升高作用，其中高劑量治療組與病毒組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），陽性藥對照組對IL-10 水平?jīng)]有作用。見圖10。

圖9 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿IL-6 的作用（n＝6）

圖10 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿IL-10 的作用（n＝6）

3.6 999 小兒感冒顆粒對流感病毒感染鼠肺勻漿中丙二醛（MDA）的影響 MDA 是脂質(zhì)過氧化，也是細胞氧化損傷的一個重要檢測指標。文獻已證實病毒感染的病理條件下，ROS 產(chǎn)生過多，氧化系統(tǒng)活性下降，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)損傷細胞膜，使細胞受損。流感病毒感染過程中，氧自由基的大量產(chǎn)生，機體不能及時清除這些自由基，進而導(dǎo)致肺泡組織細胞脂質(zhì)過氧化，引發(fā)肺泡組織的廣泛性損傷。結(jié)果表明，病毒感染小鼠第4 天，鼠肺中MDA 水平增高（P＜0.01），反應(yīng)病毒增殖誘導(dǎo)肺部氧化損傷加重，與病理形態(tài)一致。999 小兒感冒顆粒對肺部的MDA 水平具有抑制作用，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖11），結(jié)果顯示藥物具有一定抗氧化損傷作用。

4 討論

999 小兒感冒顆粒是用于治療兒童感冒的常用中成藥，雖臨床應(yīng)用已久，但其抗病毒活性尚未見報道。本實驗通過生存和急性肺損傷實驗，研究999 小兒感冒顆粒對流感病毒誘導(dǎo)肺損傷的保護作用，并通過檢測細胞因子、血凝素效價等指標探討其抗病毒及抗炎機制。

圖11 999 小兒感冒顆粒對H1N1 感染鼠肺勻漿MDA 的作用（n＝6）

生存試驗結(jié)果顯示，999 小兒感冒顆粒3 個劑量組能增加病毒感染鼠的存活率（分別為41.7%、58.3%、91.7%），延長生命存活時間，并且能提高動物體質(zhì)量，表明999 小兒感冒顆粒對甲型流感病毒感染鼠具有顯著的保護作用。急性肺損傷試驗結(jié)果顯示，999 小兒感冒顆粒組能減輕H1N1 病毒感染鼠肺部的充血及水腫，降低鼠肺指數(shù)，抑制肺部的TNF-α、IL-6 的炎性因子分泌，增加抗炎因子IL-10 以及IFN-γ 的表達，其中以高劑量組效果最佳。此外，999 小兒感冒顆粒對流感病毒的復(fù)制以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 都呈現(xiàn)一定的抑制活性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，999 小兒感冒顆粒對甲型流感病毒感染誘導(dǎo)的肺損傷，具有顯著的保護作用，具有抗炎的活性和免疫調(diào)節(jié)功能。

隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明病毒誘導(dǎo)的肺損傷的過程是個多因素相互作用的結(jié)果，在流感病毒感染的小鼠模型中，病毒的持續(xù)復(fù)制和宿主的過度免疫應(yīng)答是造成鼠肺部損傷的2 個主要因素。H1N1 流感大流行造成的高死亡率主要是由過度的免疫應(yīng)答所引發(fā)的“細胞因子風(fēng)暴”所致，而細胞因子風(fēng)暴即是由感染H1N1 引起的體內(nèi)炎性細胞因子／趨化因子大量的產(chǎn)生，引起的急性呼吸窘迫綜合癥和器官衰竭的重要原因［3］。

病毒被吸入體內(nèi)，即可通過病毒與血凝素受體結(jié)合入侵宿主，激活多種模式識別受體，包括TLR、RIG-1、NOD2，激活NF-κB 等轉(zhuǎn)錄因子，進而誘發(fā)干擾素和細胞因子，發(fā)揮病毒防御以及病毒清除的作用。感染的最初0～4 h內(nèi)，誘發(fā)瞬時的固有免疫防疫應(yīng)答，當病毒突破機體屏障后，感染后的96 h 內(nèi)主要由固有免疫應(yīng)答發(fā)揮作用，包括補體、巨噬細胞、NK 細胞、干擾素（INF）等。IFN 主要通過與靶細胞表面受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)抗病毒蛋白基因，抑制病毒蛋白質(zhì)合成，從而抑制病毒增殖。H1N1 甲流病毒的感染，不僅在肺上皮細胞中復(fù)制，在巨噬細胞等免疫細胞中也復(fù)制，激活NF-KB、STAT 等信號通路，最終釋放TNF-α、IFN-α／β、MIP-1、IP-10、IL-1β、IL-6 等蛋白的過度表達，與疾病的輕重成呈正相關(guān)，引發(fā)致死性的病理損傷［4-7］。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為流感屬“瘟疫”“溫病”等范疇，感受非時之氣或疫癘之邪，999 小兒感冒顆粒是針對“風(fēng)、熱，毒”的組方。方中廣藿香疏風(fēng)解表，化濕和中；連翹清熱解毒，輕宣透表，共為君藥。菊花、薄荷疏散上焦風(fēng)熱，清利頭目；大青葉、板藍根淸熱解毒，消腫利咽，共為臣藥。地骨皮、白薇清熱泄火涼血；石膏清解氣分實熱；地黃淸熱涼血，滋陰生津，共為佐藥。諸藥合用，共奏疏風(fēng)解表，清熱解毒功用［8］。表里雙解，在表疏風(fēng)散熱，在里清氣分熱兼涼血，截斷病勢。與流感病毒固有免疫階段的病理發(fā)展特征，恰好契合。

999 小兒感冒顆粒處方有十味中藥，其成分復(fù)雜。雖復(fù)方的抗病毒藥效尚未見報道，但單味藥的研究已為復(fù)方抗病毒的治療提供了很多實驗依據(jù)。廣藿香、連翹、板藍根、大青葉、菊花、薄荷中的單體或單藥提取物已證實具有體內(nèi)、外的抗流感病毒活性［9-13］。本研究結(jié)果初步闡明了復(fù)方具有顯著抑制病毒誘導(dǎo)的肺損傷的藥效，并證實其藥效與抗病毒、抗炎及免疫調(diào)控機制有關(guān)，部分阻斷致死劑量病毒感染誘發(fā)的高細胞因子血癥，加速機體對病毒的清除，上調(diào)干擾素的表達，抑制了過度的免疫病理損傷。由于復(fù)方的機制研究的復(fù)雜性和系統(tǒng)性，其確切機制有待進一步研究。

綜上所述，999 小兒感冒顆粒對流感病毒誘導(dǎo)的肺損傷的保護作用可能是通過抗病毒、抗炎、免疫調(diào)控途徑來實現(xiàn)的。