用半致死溫度法鑒定北疆不同時期主栽棉花耐寒性

閆臣，陳玉童，劉芯邑，張德恩，李志博

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/ 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)實驗室，新疆石河子832003）

棉花是我國主要的經(jīng)濟作物，起源于熱帶亞熱帶地區(qū)，對低溫比較敏感。 低溫脅迫是限制其生長發(fā)育、成熟和地域分布的最重要逆境因子之一[1]。低溫脅迫可以引起棉花光合氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒?、可溶性糖等一系列指?biāo)變化[2]；造成棉花細(xì)胞中葉綠體膜破損， 類囊體膜的膜質(zhì)組分和膜蛋白改變，破壞類囊體內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu)[3]；使植物的光合過程因光抑制而受到影響，導(dǎo)致光合能力下降[4]；使棉花生育期延遲、花蕾脫落，品質(zhì)和產(chǎn)量嚴(yán)重下降[5]。此外低溫使棉株更容易感染真菌、誘發(fā)多種病癥[6]。新疆是我國最大的棉區(qū)，2018 年播種面積占全國的74%以上，是國家主要商品棉基地。 受其地理位置影響，新疆有著“前期升溫慢、后期降溫快”的氣候特點，且春季氣候多變，常出現(xiàn)“倒春寒”[2]。 因此對棉花品種耐寒性進行分析鑒定對引種、抵御低溫具有一定指導(dǎo)作用。

半致死溫度（LT50）常用于植物抗逆性，尤其在耐寒性鑒定。有人認(rèn)為，用生長恢復(fù)試驗、組織褐變來估計低溫下的致死溫度分析耐寒性并不準(zhǔn)確[7]，用Logistic 方程求出LT50并進行耐寒性鑒定評價更為可靠，此方法已經(jīng)在桃樹[8]、菊花[9]等多種作物上得到應(yīng)用。 關(guān)于棉花耐寒性分析，前人多對發(fā)芽率、葉片光合氣體交換參數(shù)、葉綠素?zé)晒?、抗氧化酶、葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等指標(biāo)進行測定[2，6，10]，而并未見到LT50相關(guān)報道。 為此，本文以北疆植棉區(qū)的不同時期選育的代表性棉花品種為試驗材料，用LT50對這些品種不同生育期的耐寒性進行鑒定評價，以期為棉花耐寒性品種選育及建立耐寒鑒定方法提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用28 個棉花品種， 包括24 個北疆棉區(qū)不同時期選育的代表性棉花品種和4 個引進品種。其中引入材料中棉所36、中J9645、中JX4 的幼苗具有較強耐寒性，文中用A1－A3 表示，引入材料新陸中26 號為南疆1 個主栽棉花品種，用A28 表示。 新陸早 7 號、8 號、10 號、13 號、19 號、21 號、23 號、24 號、25 號、26 號、33 號、35 號、36 號、41號、42 號、45 號、46 號、48 號、50 號、54 號、60 號、61 號、66 號、74 號為不同時期選育審定的適宜北疆棉區(qū)的代表性棉花材料， 在文中依次用A4－A27 表示。

1.2 低溫處理

各參試材料隨機取完整、 無病蟲害的功能葉片，經(jīng)自來水洗凈后，再用去離子水漂洗數(shù)次，用濾紙吸干葉片表面的水分，用葉片打孔器避開葉脈打孔，得到30 片小圓片，分裝入具塞試管，再分別放入可控式冰箱內(nèi)，溫度分別設(shè)為－2℃、－4℃、－6℃、－8℃、－16℃。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1細(xì)胞傷害率的測定。處理12 h 后分批取出，4 ℃解凍 1.5 h，室溫平衡 30 min 后，加入 20 mL 去離子水，浸泡10 h 后用DDSJ-308A 型數(shù)字電導(dǎo)儀測定浸出液電導(dǎo)率Rc（測時搖勻）。 再將三角瓶用保鮮膜封好放入水浴鍋100℃蒸煮30 min，放置至室溫，再次測定其電導(dǎo)率Rb，用公式①、②求出相對電導(dǎo)率和傷害率。

式中：R 表示相對電導(dǎo)率，Rc 表示低溫處理后電導(dǎo)率，Rb 表示煮后電導(dǎo)率，I 為傷害率，Re 為蒸餾水電導(dǎo)率（因本實驗用的去離子水，可將Re 計為零）。 故公式②可轉(zhuǎn)化為③式如下：

1.3.2Logistic 方程的建立。Logistic 方程是 1 個典型的“S”曲線方程，方程為：y＝k/（1＋ae－bt），k、a、b為常數(shù)。 方程中y代表細(xì)胞傷害率，t代表處理溫度，k 為細(xì)胞傷害率的飽和容量為100[8]，b 表示溫度與細(xì)胞傷害率之間的函數(shù)關(guān)系，a 反映方程曲線與原點之間的相對位置關(guān)系[11]。朱根海等[7]、李華偉等[12]、王永紅[13]認(rèn)為應(yīng)用電導(dǎo)法配合Logistic 方程求出S 形曲線的拐點溫度能較準(zhǔn)確地估計出植物組織的LT50，可作為反映植物耐寒性的1 個重要指標(biāo)。

1.3.3LT50 的計算。將 Logistic 方程y＝k/ （1＋ae－bt）進行線性化轉(zhuǎn)化處理，ln[（k－y）/y]＝lna－bt，令y1＝ln[（k－y）/y]，則轉(zhuǎn)化為轉(zhuǎn)化細(xì)胞傷害率y1與處理溫度t的直線方程[11-12]。 求出拐點d2y/d2t時的t值，即 lna/b 為LT50值[7-8，11-12]。采用胡文冉[14]的方法計算LT50，并稍加改變，通過公式y(tǒng)1＝ln[（k－y）/y]， 利用y值與 k 值分別求出y1， 再利用 Excel 2016 圖表工具擬合轉(zhuǎn)化細(xì)胞傷害率y1 與處理溫度t的直線方程，分別求出lna 和b 值，進而計算出LT50。

1.4 數(shù)據(jù)與分析

利用SigmaPlot 12.5 進行作圖及方差分析，利用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)分析及其Logistic 回歸模型的建立，利用SPSS 19.0 對LT50進行K 類均值法聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花品種細(xì)胞傷害率與脅迫溫度Logistic回歸模型的建立

本實驗對各參試材料不同生育期的Logistic曲線進行線性化處理，擬合出了轉(zhuǎn)化細(xì)胞傷害率與溫度之間的線性關(guān)系，最終得出Logistic 方程（表1）。結(jié)果表明，擬合度大于0.8 的方程占91.07%，相關(guān)性較高，故用此法計算LT50，數(shù)據(jù)較可靠。

不同生育期，28 個棉花品種的Logistic 曲線見圖 1。 由圖 1 可知，4 個生育期下，28 個棉花品種葉片的細(xì)胞傷害率均隨著處理溫度的降低明顯波動式增大， 細(xì)胞傷害率與處理溫度呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。

盛蕾期Logistic 曲線呈典型的“S”型，大多數(shù)品種25～－2 ℃范圍內(nèi)， 細(xì)胞傷害率緩慢增加，表明在這溫度范圍內(nèi)， 棉花細(xì)胞質(zhì)膜損傷能自動修復(fù)，處于動態(tài)平衡狀態(tài)；大多數(shù)品種在－2～－6 ℃范圍內(nèi)，細(xì)胞傷害率迅速增加，表明此溫度范圍內(nèi)細(xì)胞質(zhì)膜損傷大于修復(fù)，損傷程度愈加嚴(yán)重。因此，可以認(rèn)定－2 ℃為盛蕾期棉花耐寒性的臨界溫度。細(xì)胞質(zhì)膜損傷程度逐漸加重，大多數(shù)品種細(xì)胞傷害率在－6 ℃后趨于平穩(wěn)， 少數(shù)品種在－8 ℃后趨于平穩(wěn)。

各品種苗期、吐絮期的Logistic 曲線最后未趨于平穩(wěn)，只呈現(xiàn)“S”型的前一部分，這2 個時期大多數(shù)品種細(xì)胞傷害率在－4℃后開始快速上升， 基本未趨于平穩(wěn)。大多數(shù)棉花品種在花鈴期對低溫比較敏感， 細(xì)胞傷害率－2～25 ℃隨溫度降低迅速增加， 低于－2 ℃后多數(shù)品種細(xì)胞傷害率緩慢增長，呈現(xiàn)“S”型曲線的后一段，可知棉花在此時期耐寒性較弱，容易受到冷害。 同時結(jié)合LT50（表 1），可認(rèn)定苗期、花鈴期、吐絮期棉花耐寒性指標(biāo)的臨界溫度分別為－4 ℃、2 ℃、－4 ℃， 對棉花耐寒性鑒定工作有一定的幫助。

2.2 不同生育期LT50的確定

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圖1 不同時期棉花各品種葉片細(xì)胞傷害率與處理溫度之間的Logistic 曲線

計算Logistic 曲線拐點溫度作為植物組織的LT50，通過比較各品種LT50，可以鑒定其耐寒性。 分析結(jié)果（圖2）看出，同一棉花品種在不同生育期的LT50并不相同，表明不同生育期棉花的耐寒機制或關(guān)鍵耐寒指標(biāo)因子不同。 從苗期、盛蕾期、花鈴期、吐絮期所有參試材料的LT50范圍分別在－9.07～－0.12 ℃、－4.43～4.25 ℃、－4.02～9.69 ℃、－15.76～3.06 ℃來看，苗期、吐絮期的LT50幾乎均在0 ℃以下，說明參試材料在苗期和吐絮期均具有較好的耐寒性。根據(jù)確定的LT50，所有參試材料中，苗期、盛蕾期、花鈴期、吐絮期耐寒性最強的材料依次分別為新陸早36 號、 新陸早7 號、 新陸早 50號、新陸早35 號，而耐寒性最差的材料依次分別為新陸早60 號、新陸早25 號、新陸早13 號、新陸早54 號。

圖2 棉花品種在不同生育期的LT50

圖3 不同生育期各品種LT50 平均值差異分析

取所有參試材料的LT50平均值， 進一步對不同生育期棉花的LT50變化趨勢進行了分析 （圖3）。研究發(fā)現(xiàn)，隨著生育進程推進，不同生育期棉花的LT50有先升高后下降的趨勢，其幾乎均達到顯著差異。 其中花鈴期的棉花材料的LT50平均值為2.23 ℃，為4 個生育中最高，而苗期的參試材料的LT50平均值是4 個生育期中最低的， 為－4.79 ℃，進一步表明，花鈴期棉花適宜生長需要較高的生長溫度， 也說明不同生育期棉花的耐寒機制不一樣，不同生育期棉花的LT50耐寒分類標(biāo)準(zhǔn)不一樣，對棉花全生育期的耐寒性鑒定需要考慮棉花不同生育期。

2.3 不同生育期棉花耐寒性鑒定及耐寒等級標(biāo)準(zhǔn)建立

將棉花耐寒性分為高抗、抗、中抗、弱抗和寒敏感5 個級別進行鑒定評價。 K 類均值法聚類分析（表2）結(jié)果表明，28 個參試品種在不同生育期的耐寒鑒定級別所占比例和結(jié)果不同。 僅有1～2 個品種在4 個生育期中表現(xiàn)為寒敏感，表明北疆植棉區(qū)棉花品種都具有一定的耐寒性。 4 個生育期鑒定結(jié)果為高抗的棉花品種有明顯的差別， 其中苗期、吐絮期的比例較低，分別為7.14%、3.57%；而盛蕾期和花鈴期的高抗比例明顯升高， 分別達到了32.14%、17.86%，這說明盛蕾期和花鈴期比苗期和吐絮期相對要求較高的溫度，也表明不同生育時期棉花的耐寒機制和耐寒性不同。 綜合來看，A15（新陸早35 號）和 A2（中 J9645）在 4 個生育期的分級結(jié)果均為高抗或抗， 表明它們具有較好的耐寒性，可以作為棉花耐寒種質(zhì)資源加以使用；而A13（新陸早26 號）的綜合鑒定結(jié)果均為弱抗，表明其全生育期的耐寒性較差。

表2 不同生育期耐寒性分級的聚類分析

依據(jù)表2 的分析結(jié)果，根據(jù)入選的不同耐寒類別棉花的LT50，本實驗又初步建立了不同生育期棉花耐寒性級別劃分的LT50標(biāo)準(zhǔn)（表3），期望為應(yīng)用LT50鑒定不同生育期棉花種質(zhì)資源的耐寒性提供科學(xué)指導(dǎo)。

表3 不同生育期棉花不同類別耐寒性LT50 的確立 ℃

3 討論與結(jié)論

膜系統(tǒng)是植物受低溫傷害和抵抗低溫傷害的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[13]。 低溫脅迫下，棉花葉片質(zhì)膜透性與其耐寒性呈負(fù)相關(guān)， 可以作為耐寒性的鑒定指標(biāo)[15]，質(zhì)膜透性增加，電解質(zhì)會出現(xiàn)不同程度的外滲[8，10，13]，電解質(zhì)外滲率與原生質(zhì)膜受害程度成正相關(guān)[16]，電解質(zhì)外滲率與細(xì)胞傷害率已經(jīng)成為低溫傷害的標(biāo)志[8，12-13]。

本試驗中，隨著溫度的降低，大多數(shù)品種細(xì)胞傷害率呈現(xiàn)“慢- 快- 慢”的增長趨勢，這與前人試驗結(jié)果基本一致[8-9，12]。 本試驗結(jié)合朱根海等[7-8，14]方法，建立了28 個品種的Logistic 方程，結(jié)果顯示大部分品種細(xì)胞傷害率與溫度之間呈現(xiàn)典型的“S”型，方程擬合度較高，初步表明Logistic 方程結(jié)合LT50可用于棉花耐寒性鑒定。

分析發(fā)現(xiàn)，不同生育期下各個棉花品種的LT50并不一致，表明棉花材料之間耐寒性存在差異。 花鈴期的LT50平均為2.23℃， 明顯遠高于其他3 個生育期，主要原因可能是花鈴期是棉花生殖生長與營養(yǎng)生長兩旺期，也是水肥敏感時期，水肥均可對棉花產(chǎn)生脅迫，不僅僅體現(xiàn)在低溫脅迫上，同時與花鈴期棉花適宜生長需要相對較高的溫度相符。耐寒性鑒定結(jié)果表明， 中J9645 和新陸早35 號耐寒性最強，新陸早36 號次之，新陸早26 號對低溫最敏感。 其中，中J9645 是中棉所鑒定出的耐寒性強的棉花材料， 本試驗結(jié)果與其一致， 進一步表明Logistic 方程結(jié)合LT50可用于棉花耐寒性鑒定評價。 整體上，棉花對低溫比較敏感，耐寒性相對較差，28 個品種各時期LT50較一些木本植物或一些耐冷植物偏低。

不同時期的28 個品種LT50平均值存在顯著差異， 即不同生育期棉花耐寒性之間存在顯著差異，再次表明不同生育期棉花耐寒機制不同，故而不能僅通過1 個生育時期的鑒定結(jié)果對棉花耐寒性評價，需建立不同生育期相應(yīng)的適宜評價指標(biāo)體系。實驗劃分出每個生育期棉花耐寒性級別，確立不同生育期棉花耐寒性標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為苗期、盛蕾期、花鈴期、 吐絮期棉花耐寒性指標(biāo)的臨界溫度分別為－4 ℃、－2℃、2 ℃、－4 ℃，為棉花材料耐寒性、品種選育和栽培管理提供一定的科學(xué)依據(jù)。但此實驗是基于新疆地區(qū)主栽早熟棉花品種，且第1 次用Logistic 方程結(jié)合LT50運用到棉花耐寒性鑒定，研究結(jié)果還有待深化。