棉花高效嫁接新方法及其應(yīng)用研究

秦麗霞，張換樣，李靜，朱永紅，聶園軍，焦改麗，吳慎杰*

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與經(jīng)濟(jì)研究所，山西太原030031）

棉花作為重要的資源性農(nóng)產(chǎn)品在國民經(jīng)濟(jì)中起著至關(guān)重要的作用[1]。 基因工程和細(xì)胞工程是當(dāng)今棉花遺傳改良育種的重要手段，棉花組培再生植株是轉(zhuǎn)基因技術(shù)在棉花遺傳改良應(yīng)用的基礎(chǔ)，但通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得的轉(zhuǎn)基因再生棉株試管苗根系大多發(fā)育不良，表現(xiàn)為無根苗、褐根苗和畸形苗（如叢生苗）等，根系正常的再生植株移栽至土壤或蛭石中，成活率極低（通常只有10%～20%），生長緩慢，極大地限制了棉花遺傳改良技術(shù)的應(yīng)用[2]。嫁接體系的建立和完善有利于大規(guī)模保存繁育遺傳分離群體、常規(guī)棉株以及稀有種質(zhì)資源，有利于加快現(xiàn)代生物技術(shù)在棉花遺傳改良上的廣泛應(yīng)用、加快轉(zhuǎn)基因棉花的育種進(jìn)程[2-11]。

嫁接作為一種實(shí)用技術(shù)在果樹、蔬菜等植物的繁育、增產(chǎn)、抗逆性提高等方面應(yīng)用廣泛[12]。王偉等[2]首次報道用劈接法嫁接解決轉(zhuǎn)基因棉花再生植株定植困難的問題，研究表明嫁接可以挽救一些利用移栽方法無法成活的幼苗， 極大地提高了成活率，亦可為研究組織培養(yǎng)中的變異問題（如染色體畸變等）保存寶貴的材料。 李燕娥等[3-4]進(jìn)一步研究了轉(zhuǎn)基因棉花的嫁接， 涉及到了影響嫁接的一些因素，如及時松綁、逐步放風(fēng)、澆水適量等。 張寒霜等[5]用棉花組培苗嫁接，在花盆上覆膜保濕，提出嫁接接穗長度、去繩時間等影響成活率。吳慎杰等[6]首次將插皮接法引入棉花嫁接，用塑料瓶保濕，并研究了適宜嫁接的苗齡， 得出砧木3～5 片真葉劈接法效果較好，此后用插皮接法成活率高，適用范圍較廣。王彥霞等[7]用合接法嫁接棉苗，并以頂插接法、劈接法做對照，研究了砧木接穗不同品系不同苗齡間的配合，用燒杯倒扣保濕，得出接穗1 葉1 心、砧木1～3 片真葉嫁接效果最好， 同品種或相近品種嫁接成活率高的結(jié)論。此外，Luo 等[8]采用改進(jìn)后的劈接法進(jìn)行離體莖尖植株嫁接均取得較好效果，嫁接棉株生長勢強(qiáng)，生長發(fā)育快，能夠提早開花，提早成熟，且未發(fā)現(xiàn)與嫁接有關(guān)的不利影響。 黃雙領(lǐng)等[9-10]選擇根系發(fā)達(dá)、抗病強(qiáng)的海島棉作為砧木，將海、陸棉進(jìn)行嫁接克服遠(yuǎn)緣雜交的困難，縮短有性雜交育種周期，提高產(chǎn)量和品質(zhì)及抗病性。 張大偉等[11]采用嵌合法進(jìn)行棉花嫁接，并與合接法、插皮接法、劈接法分別作嫁接比較試驗(yàn)、砧木和接穗配合試驗(yàn)和不同嫁接時期比較試驗(yàn)，表明嵌合法增加砧木與接穗間接觸面，砧木與接穗相對交錯嵌合，咬合牢實(shí)、固定較好，減少了砧穗間接觸面組織的破壞，嫁接棉苗成活率有所提高。

采用合接法、劈接法、插皮接法和嵌合法進(jìn)行棉花嫁接，一定程度上提高了棉株的成活率。 但是對于再生植株嫁接來說存在以下弊端：常規(guī)“劈接法”貼著子葉柄摘頭去心，切口垂直于子葉柄，子葉會因重力作用向兩邊耷拉， 接穗插入固定較為困難。 也有一些研究人員在子葉柄上端留一段上胚軸，縱向剖開，然而此方法不便于砧木葉片供給接穗營養(yǎng)。 插皮接法需要的砧木較大。 合接法其形成層接觸面較少， 砧木與接穗體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)交換較少。 嵌合法操作比較繁瑣，且只適合砧木與接穗苗齡大小相近的植株。以上幾種嫁接方法對溫度和濕度的要求也比較高。 因此，棉花高效嫁接技術(shù)仍有待深入系統(tǒng)研究，完善的棉花嫁接技術(shù)體系也有待建立。

本研究建立了一種新的高效棉花嫁接技術(shù)體系，嫁接成活率可穩(wěn)定在92%以上，在適宜的砧木與接穗配合期嫁接成活率可達(dá)到100%， 該方法操作簡便、嫁接速度快、成活率高，且可以廣泛應(yīng)用于多種雙子葉植物幼苗和幼嫩枝條的嫁接。

1 材料與方法

1.1 材料的準(zhǔn)備

1.1.1海島棉作砧木，組培苗作接穗。選用根系發(fā)達(dá)、 抗枯、 黃萎病性強(qiáng)的海島棉品種海7124 作砧木， 組培室培養(yǎng)間組培苗作接穗。 2017 年1 月5日、3 月15 日在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所溫室（27～33 ℃）分別種植砧木 200 盆和 500 盆，5 月17 日、8 月 20 日在室外網(wǎng)棚（30～38 ℃）分別種植砧木各200 盆，每盆2～3 株，待子葉完全展開，每盆留1 株生長較為健壯的植株。

1.1.2黑籽南瓜作砧木，黃瓜苗作接穗。早春季節(jié)，分別在營養(yǎng)缽中播種盆栽黑籽南瓜和黃瓜各50盆，每盆2～3 株，待子葉完全展開，每盆留1 株生長較為健壯的植株。待南瓜苗長出1～2 片真葉，且第1 片真葉長至1 cm 長度左右時，即可作為砧木。播種后約10 d 左右，黃瓜苗子葉展平，長出1 片真葉和生長點(diǎn)，即可作為接穗。

1.1.3印度南瓜作砧木，甜瓜作接穗。在營養(yǎng)缽中播種盆栽印度南瓜（筍瓜）和甜瓜（新玉美人）各50盆，每盆2～3 株，置于溫室大棚中。 待子葉完全展開，每盆留1 株生長較為健壯的植株。 印度南瓜比甜瓜提前1 周種植。 待印度南瓜苗長出1～2 片真葉且第1 片真葉出展 （即破心）、2 片子葉充分展平，苗高6～8 cm、莖未中空時，即可作為砧木。 甜瓜子葉展平第1 片真葉露頭即破心后， 即可作為接穗。

1.1.4瓠葫蘆作砧木，西瓜幼嫩枝條作接穗。分別在營養(yǎng)缽中播種盆栽瓠葫蘆和西瓜 （夏寶） 各50盆，每盆2～3 株，置于溫室大棚中。 待子葉完全展開，每盆留1 株生長較為健壯的植株。 瓠葫蘆比西瓜提前10 d 播種，瓠葫蘆的真葉出現(xiàn)時，即把頂芽摘除， 待其長出2～3 片真葉、2 片子葉充分展平時，即可作為砧木。待西瓜子葉展平，第1 片真葉露頭即破心后，即可作為接穗。

1.2 方法

1.2.1“Y 型”劈接法在棉花嫁接中的應(yīng)用。（1）在嫁接前1 d，將種植在花盆中的海島棉7124 砧木澆足水分。對生長有1～3 片真葉的砧木，僅保留砧木2 片子葉，切去2 片子葉以上部位莖葉；對生長有4～6 片真葉的砧木，保留砧木2 片子葉和1～2 片真葉，切去上部莖葉，然后從子葉葉柄/ 真葉葉柄下緣的5 mm 處開始，手術(shù)刀片沿葉柄中軸和莖中軸自上而下穿過葉柄下段和莖桿從中間縱向剖開，葉柄下緣的切口0.5 cm，莖段切口長1.5～2 cm，葉柄與莖的整個切口呈 Y 型，如圖 1A、1D。 （2）保留接穗頂端2～4 片幼嫩真葉和生長點(diǎn)， 長度3～5 cm，在接穗的莖稈下段兩邊各削1 刀，削尖，削面呈“V”字型，削面長 1～1.5 cm（圖 1B）。 （3）將接穗的莖段垂直插入砧木的切口中，利用葉柄下段切口的自然夾力將接穗和砧木緊密結(jié)合在一起（圖1C，1E），用塑料繩纏繞或夾子稍加固定。 （4）用塑料薄膜嚴(yán)密包裹整盆植株，5―9 月（晴天超過28 ℃時）在室外網(wǎng)棚環(huán)境中需要50%～75%的遮陽網(wǎng)在頂部遮陽，10 至翌年4 月底在正常管理的溫室環(huán)境中即可，不需要遮陽。 （5）待嫁接植株渡過緩苗期，從接穗葉片恢復(fù)平展（6―7 d）開始逐漸用鉛筆（直徑7～8 mm）在包裹植株的塑料薄膜頂上打孔放風(fēng)透氣去濕，兩天1 次，每次打3 個孔，觀察到接穗有明顯的新葉長出和伸長（14―17 d）時開始揭膜、去除固定物，即完成嫁接，繼續(xù)煉苗1 周后移栽到大盆或田間。

1.2.2不同嫁接時期的比較試驗(yàn)。分別對1 月5日、3 月 15 日、5 月 17 日、8 月 20 日不同批次種植的砧木選擇在棉苗的 1 葉 1 心、3 葉 1 心、4 葉 1 心和 6 葉 1 心 4 個生育時期，利用“Y 型”劈接法進(jìn)行嫁接試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析接穗的成活率，選擇最佳的嫁接時期。

圖1 “Y 型”劈接法嫁接示意圖

1.2.3“Y 型”劈接法嫁接比較試驗(yàn)。在海島棉棉苗生長至4 葉1 心時， 分別用前人已報道的合接法、常規(guī)劈接法、插皮接法、貼接法、切接法和嵌合法做對照，比較“Y 型”劈接法嫁接試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)不同嫁接法的接穗成活率并測量接穗月生長量。劈接法參照文獻(xiàn)[2-5]，插皮接法參照文獻(xiàn)[6]，合接法參照文獻(xiàn)[7]，嵌合法參照文獻(xiàn)[11]，貼接法和切接法參照文獻(xiàn)[13]。

1.2.4“Y 型”劈接法在其他雙子葉植物中的應(yīng)用研究。采用“Y 型”劈接法在2 葉1 心時期的黑籽南瓜上嫁接黃瓜幼苗，在1 葉1 心時期的印度南瓜上嫁接甜瓜幼苗，在3 葉1 心時期的瓠葫蘆上嫁接西瓜幼嫩枝條，隨后分別統(tǒng)計(jì)其嫁接成活率。

2 結(jié)果

2.1 “Y型”劈接法在不同嫁接時期的比較

分別在 1 月 5 日（冬季）、3 月 15 日（春季）、5月 17 日（初夏）、8 月 20 日（秋季）種植海 7124 作為砧木，組培棉苗為接穗。 用“Y 型”劈接法在砧木生長的不同時期 （1 葉 1 心、3 葉 1 心、4 葉 1 心、6葉1 心）進(jìn)行嫁接比較試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：不同季節(jié)無論是在溫室還是室外嫁接，采用“Y 型”劈接法的棉苗成活率均無顯著差異，均有92%以上的成活率（表 1）。 另外，在砧木生長的不同時期中，1 葉 1心、3 葉 1 心、4 葉 1 心和 6 葉 1 心時嫁接棉苗成活率分別為97.56%～100%、94.87%～96.49%、93.02%～98.11%和 92.10%～95.45%（表 1）。 結(jié)果表明：從1 葉 1 心至 6 葉 1 心時期的砧木苗均適合“Y 型”劈接法嫁接， 且成活率在92.10%以上， 受室內(nèi)、外溫度和濕度環(huán)境影響不大。 與先前報道嫁接相比[2-7，11，13]，“Y 型”劈接法砧木可使用時間較長。

2.2 棉苗不同嫁接方法比較

為了選擇高效的棉花嫁接方法，采用不同嫁接方法進(jìn)行比較試驗(yàn)。在砧木棉苗生長至4 葉1 心時期，利用海7142 為砧木、組培苗為接穗，分別用“Y型”劈接法、合接法、常規(guī)劈接法、插皮接法、貼接法、切接法和嵌合法7 種嫁接方法進(jìn)行嫁接。 10 d后統(tǒng)計(jì)嫁接成活率。 結(jié)果顯示：7 種嫁接方法嫁接的棉苗成活率相差很大。 其中，“Y 型”劈接法嫁接的效果最好，嫁接成活率為98.11%；貼接法、合接法、 嵌合法、 切接法依次為 89.13%、86.27%、82.98%、80.77%， 插皮接法的嫁接成活率為78%；常規(guī)劈接法嫁接效果最差， 其嫁接成活率只有63.27%（表2）。 以上7 種不同嫁接方法比較試驗(yàn)結(jié)果表明，“Y 型”劈接法是棉花最適宜的嫁接方法。

表1 “Y 型”劈接法不同時期棉苗嫁接成活率統(tǒng)計(jì)分析

同一時期砧木和相同的嫁接時間，7 種嫁接方法的成活率有顯著差異，但接穗的生長速率無顯著差異。 接穗月生長量在 （9.43±2.01）～（10.15±1.73） cm 之間（表2）。

2.3 “Y型”劈接法在其他雙子葉植物中的應(yīng)用研究

采用“Y 型”劈接法分別在2 葉 1 心時期的黑籽南瓜上嫁接黃瓜幼苗，在1 葉1 心時期的印度南瓜上嫁接甜瓜幼苗，在3 葉1 心時期的瓠葫蘆上嫁接西瓜幼嫩枝條，10 d 后分別統(tǒng)計(jì)其成活率。 結(jié)果顯示：黃瓜、“新玉美人”甜瓜和“夏寶”西瓜的嫁接成活率均高達(dá)90%以上，分別為97.78%、96.08%和93.75%（表3）。 表明“Y 型”劈接法也適用于其他雙子葉植物的嫁接。

表2 不同嫁接法棉株成活率和生長速率統(tǒng)計(jì)

表3 采用“Y 型”劈接法嫁接植株成活率統(tǒng)計(jì)

3 討論

影響嫁接成活的因素很多，其中砧木與接穗間形成層的再生、砧木和接穗的營養(yǎng)積累與水分的運(yùn)輸、愈合組織的形成是嫁接成活的關(guān)鍵。 再生形成層和愈傷組織形成的多少、快慢是影響嫁接成活率高低的主要原因[14]。 本研究比較了7 種不同的棉花嫁接方法， 以便建立一種適宜棉花嫁接的高效嫁接技術(shù)體系。 研究探索出一種新的適合多種雙子葉植物（包括棉花）和幼嫩枝條嫁接技術(shù)—“Y 型”劈接法。

3.1 “Y型”劈接法操作簡單，接穗固定方便且愈合快，成活率高，砧木可使用時期長

與前人報道常規(guī)劈接法相比[2-5]，“Y 型”劈接法嫁接棉苗成活率極高的關(guān)鍵在于砧木的切口同時穿過葉柄下段和莖的中軸，利用葉柄下段切口自然夾力的固定作用將接穗和砧木固定并緊密結(jié)合在一起，用塑料繩纏繞或夾子稍加固定即可；不需要用手指捏住切口將接穗和砧木固定。 更為重要的是，葉片光合作用的營養(yǎng)物質(zhì)可通過葉柄就近輸送入接穗中，促進(jìn)接口迅速愈合。 砧木與接穗間接觸面較多，營養(yǎng)物質(zhì)和水分等交換的多、快，因此再生形成層和愈傷組織形成較多、較快。 整個嫁接操作簡單，固定方便，嫁接速度快，且成活率高達(dá)92%以上。 適合常規(guī)劈接法的砧木時期大約僅有1 周[2-5]、插皮接法的砧木需要有一定木質(zhì)化程度苗齡較大的砧木[6]。 本研究中的“Y 型”劈接法砧木可使用時期較長，從出現(xiàn)1 片真葉至6 片真葉的苗齡期均適用。 不必多次種植砧木，便于管理，可節(jié)約成本，節(jié)省人力。

3.2 “Y型”劈接法采用逐步定量打孔透氣，對環(huán)境的溫、濕度無需嚴(yán)格控制

早期報道的棉花嫁接方法大多采用提前練苗后進(jìn)行保濕和透氣，保濕用的是剪去瓶口的透光性好的礦泉水瓶（或燒杯、罐頭瓶等）將其罩住，然后澆上水，周緣蓋土來密封，以保濕防接穗萎蔫。太早透氣棉苗會萎蔫，太晚會發(fā)霉，造成嫁接成活率較低[2-4]。吳慎杰等[6]在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，用帶蓋的剪去瓶底的透光性好的塑料瓶將其罩住，3～4 d 后擰松瓶蓋進(jìn)行通氣，第7 d 去掉瓶蓋，12 d 后揭瓶，延長了練苗時間，增加棉苗透氣、保濕，并抑制發(fā)霉。隨后的多種棉花嫁接方法中采用塑料薄膜包裹整個嫁接植株花盆保濕，用遮蔭棚進(jìn)行遮陰，7～10 d后去膜，對環(huán)境的溫、濕度需要嚴(yán)格控制[9-11]。 本研究發(fā)明的“Y 型”劈接法包膜后，膜內(nèi)的濕度很快上升接近于100%，采用鉛筆逐步定量打孔透氣，開始打孔后濕度會逐漸降低到70%～75%， 對環(huán)境的溫、濕度不需要嚴(yán)格控制。通常只有在5―9 月有超過28 ℃的晴天天氣時， 在室外環(huán)境中需要50%～75%的遮陽網(wǎng)在頂部遮陽，10 月至翌年4 月底在正常管理的溫室環(huán)境中（20～37 ℃）不需要遮陽。 轉(zhuǎn)基因棉苗和組培苗可以隨時嫁接，對溫室環(huán)境和大田環(huán)境要求不嚴(yán)。本發(fā)明“Y 型”劈接法突破苗木一般在春季進(jìn)行嫁接的局限[15-16]，在夏季幼嫩枝條上也可以實(shí)現(xiàn)嫁接，保留葉片保濕，上面遮陽，可整年用于組培苗的嫁接。

3.3 “Y型”劈接法應(yīng)用廣泛

本研究發(fā)明的“Y 型”劈接法不僅適用于轉(zhuǎn)基因和組織培養(yǎng)再生棉株幼苗和幼嫩枝條的嫁接，還適用于其他多數(shù)雙子葉植物幼苗和幼嫩枝條（如黃瓜、甜瓜、西瓜和果樹、沙棘等林木）的嫁接，應(yīng)用范圍非常廣泛。 構(gòu)建完善的高效的棉花嫁接技術(shù)體系，能很好地解決了棉花轉(zhuǎn)基因無菌苗的定植困難問題；同時還能搶救污染苗、畸形苗等無需長根的棉苗[4]，嫁接棉苗生長發(fā)育旺盛，能提早開花、結(jié)實(shí)，且能保持優(yōu)良性狀，縮短育種周期[7-8]。 完善的嫁接體系的建立將有助于加快現(xiàn)代生物技術(shù)在植物遺傳改良上的廣泛應(yīng)用，例如已有報道嫁接對根- 冠互作機(jī)制研究[17]、嫁接對提高棉花耐NaCl 脅迫的效應(yīng)的研究[18]及利用嫁接系統(tǒng)研究棉花抗黃萎病機(jī)理[19-20]。

4 結(jié)論

本研究建立了一種雙子葉植物幼苗和幼嫩枝條的高效“Y 型”劈接嫁接方法。砧木的切口同時穿過葉柄下段和莖的中軸，利用葉柄下段切口自然夾力的固定作用便于接穗和砧木固定并緊密結(jié)合，尤其葉片光合作用的營養(yǎng)物質(zhì)可通過葉柄就近輸送入接穗中，促進(jìn)接口迅速愈合。整個嫁接操作簡單，嫁接速度快，且成活率高達(dá)92%以上。 采用定量逐步打孔透氣，對環(huán)境的溫、濕度無需嚴(yán)格控制。此技術(shù)體系突破苗木一般在春季進(jìn)行嫁接，并且可整年用于棉花轉(zhuǎn)基因苗和組培苗的嫁接。