基于白紋伊蚊Actin基因參照的登革Ⅱ型病毒一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立*

李超杰 姜玉庭 張強(qiáng)輝 高 劍 劉 源 邢 丹 李春曉 張恒端 郭曉霞** 趙彤言**

(1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071)

登革病毒(Dengue fever virus，DENV)屬于黃病毒科、黃病毒屬，是有囊膜包被的單股正鏈RNA病毒(Thanachartwetetal., 2015)。病毒基因組全長(zhǎng)約 11 kb，有1個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame, ORF)，共編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Unoetal., 2018)。根據(jù)病毒表面抗原的不同，可以分為4種不同的血清型(DENV-1～DENV-4)。埃及伊蚊Aedesaegypti和白紋伊蚊Aealbopictus是登革熱的主要傳播媒介，其中白紋伊蚊在中國(guó)的分布極其廣泛，自遼寧省往南的各個(gè)省份均有分布。

目前定量檢測(cè)登革病毒的方法主要是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)登革病毒的含量(Gongetal., 2020)。Alto等(2008)用DENV-2感染伊蚊，發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊身體中病毒滴度與蚊蟲(chóng)個(gè)體大小成正相關(guān)，這可能是由于大個(gè)體蚊蟲(chóng)攝入了更多的病毒，但是傳統(tǒng)的定量檢測(cè)方法的結(jié)果因樣本個(gè)體差異存在誤差。建立白紋伊蚊中登革病毒含量的精確檢測(cè)方法，對(duì)于白紋伊蚊感染登革病毒的研究以及登革熱的防控有重要意義。肌動(dòng)蛋白(Actin) 是一類(lèi)形成微絲的球狀多功能蛋白質(zhì)，普遍存在于所有的真核細(xì)胞中, 是高度保守的蛋白質(zhì)家族，其在進(jìn)化的過(guò)程中幾乎沒(méi)有變化。肌動(dòng)蛋白幾乎參與了真核細(xì)胞的所有生理過(guò)程, 如胞質(zhì)流動(dòng)、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、染色體運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞激化等(Pollardetal., 1986；Kabschetal., 1992；Chadwicketal., 1999)。由于肌動(dòng)蛋白的mRNA的表達(dá)數(shù)量高并且表達(dá)穩(wěn)定，在生物體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá), 所以在很多研究中被當(dāng)作內(nèi)參基因(Vascottoetal., 2004)。

本研究采用白紋伊蚊Actin基因表達(dá)含量做參照，設(shè)計(jì)DENV-2和Actin特異性引物和探針進(jìn)行一步法熒光定量雙重PCR檢測(cè)，使登革Ⅱ型病毒感染白紋伊蚊的實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果更為準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 白紋伊蚊

研究對(duì)象為廣州株白紋伊蚊，2019年7月采自廣東省廣州市，于養(yǎng)蟲(chóng)室連續(xù)常規(guī)養(yǎng)殖至第4代(F4)。飼養(yǎng)條件：溫度28±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光照∶黑暗=14 h∶10 h。

1.2 登革Ⅱ型病毒

登革Ⅱ型病毒由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供，在本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)乳鼠腦傳代，保存于-80℃冰箱。

1.3 主要儀器和試劑

Analytikjena PCR儀(Biometra Tadvanced)、QuantStudio 7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀(appliedbiosystems)、醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)供血器(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠)、RNAiso Plus(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，貨號(hào)：RR047 A)、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，貨號(hào)：RR010 A)、低熔點(diǎn)瓊脂(SIGMA公司：SLBJ0416 V)、 EasyPure? Quick Gel Extraction Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：EG101-01)、pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：CB501)、EasyPure?HiPure Plasmid MiniPrep Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：EM111-01)、GoTaq?Probe 1-Step RT-qPCR System試劑盒(Promega公司，貨號(hào)：A6120)。

1.4 引物和探針合成

針對(duì)登革Ⅱ型病毒3′UTR區(qū)域和白紋伊蚊Actin基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，登革Ⅱ型病毒基因和白紋伊蚊Actin基因的探針5'端標(biāo)記的熒光基團(tuán)分別為FAM和HEX。引物序列在華大基因合成。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

分別提取白紋伊蚊和DENV-2的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，PCR擴(kuò)增分別獲得白紋伊蚊Actin和DENV-2目的片段(反應(yīng)條件：95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35 cycles; 72℃ 5 min)。將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用凝膠回收試劑盒純化目的片段。將純化后的目的片段與質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇培養(yǎng)1 h，涂在準(zhǔn)備好的LB固體培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)后挑選白色菌落在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，測(cè)序。將含目的基因的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測(cè)得質(zhì)粒濃度，計(jì)算出目的基因相對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)。把已知濃度的質(zhì)粒稀釋至108～101copies/μL，作為后續(xù)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.6 一步法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法的靈敏度和重復(fù)性

將構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋為1×108～1×101copies /μL系列梯度濃度，確定所建立方法的最低檢測(cè)拷貝數(shù)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算3次之間的平均Ct值及各梯度濃度的變異系數(shù)，檢驗(yàn)穩(wěn)定性。

1.7 白紋伊蚊經(jīng)口感染DENV-2

白紋伊蚊羽化5～7 d后斷糖水16～18 h，使用醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)供血器喂食病毒血餐。血餐用登革Ⅱ型病毒懸液和昆明小鼠血按1∶1的比例混合而成，DENV-2的滴度為6.9×107PFU/mL。喂食白紋伊蚊1 h后，使用CO2麻醉，挑取飽血的雌蚊100只，感染后蚊蟲(chóng)置于溫度28±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光照：黑暗=14 h:10 h的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.8 白紋伊蚊總RNA提取和檢測(cè)

分別于染毒后第4、7、10 d取30只白紋伊蚊，處死后置于1.5 mL EP管中，加入1 mL RNAiso Plus提取蚊蟲(chóng)總RNA。使用Promega一步法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒檢測(cè)白紋伊蚊體內(nèi)DENV-2的含量和Actin基因的表達(dá)量(反應(yīng)條件：45℃ 15 min; 95℃ 10 min, 95℃ 15 s, 60℃ 60 s, 40 cycles)。

2 結(jié)果

2.1 一步法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法的靈敏度和重復(fù)性

用上述條件建立一步法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)拷貝數(shù)分別為1×108～1×101copies /μL的DENV-2和白紋伊蚊Actin基因重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示DENV-2的最低檢測(cè)濃度為1×102copies /μL，而白紋伊蚊Actin基因的最低檢測(cè)濃度為1×101copies /μL。DENV-2標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖1)的線性回歸方程為y=-3.8894x+ 42.552，相關(guān)系數(shù)0.999，白紋伊蚊Actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖2) 的線性回歸方程為y=-3.8814x+ 42.768，相關(guān)系數(shù)0.999，兩者標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的相關(guān)關(guān)系。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)3次后，DENV-2重組質(zhì)粒的變異系數(shù)在0.79%～2.66%之間(表2)，白紋伊蚊Actin基因重組質(zhì)粒的變異系數(shù)在0.38%～4.33%之間 (表3)，變異系數(shù)較大的樣本濃度主要是1×101copies /μL，證明該檢測(cè)方法在1×102～1×108copies /μL之間重復(fù)性最好。

圖1 梯度稀釋登革Ⅱ型病毒陽(yáng)性模板核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 梯度稀釋白紋伊蚊Actin基因陽(yáng)性模板核酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 不同天數(shù)白紋伊蚊登革Ⅱ型病毒與Actin基因表達(dá)量的比值

2.2 登革Ⅱ型病毒復(fù)制動(dòng)態(tài)檢測(cè)

根據(jù)上述方法，檢測(cè)白紋伊蚊吸食DENV-2型病毒血餐后，登革Ⅱ型病毒和白紋伊蚊Actin基因的表達(dá)量在第4、7和10 d的變化情況 (圖3)。在第4 d DENV-2的感染率為0%，第7 d的感染率為37%，第10 d的感染率為30%。第7 d DENV-2與Actin基因的比值在0.51～0.93之間，第10 d DENV-2與Actin基因的比值在0.63～0.94之間(表4)。第7 d陽(yáng)性蚊蟲(chóng)比值的平均值為0.72，標(biāo)準(zhǔn)差為0.17；第10 d陽(yáng)性蚊蟲(chóng)比值的平均值為0.80，標(biāo)準(zhǔn)差為0.09，應(yīng)用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，第10 d的比值平均值高于第7 d的比值平均值，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即第10 d的病毒含量高于第7 d的病毒含量(表5)。

表1 登革Ⅱ型病毒和Actin的引物及探針序列

表2 登革Ⅱ型病毒檢測(cè)時(shí)各梯度濃度的Ct值及變異系數(shù)

表3 白紋伊蚊Actin基因檢測(cè)時(shí)各梯度濃度的Ct值及變異系數(shù)

表4 陽(yáng)性蚊蟲(chóng)DENV-2與Actin基因表達(dá)量的比值

表5 陽(yáng)性蚊蟲(chóng)DENV-2與Actin基因表達(dá)量比值的比較

3 討論

目前常用的登革病毒檢測(cè)方法為僅使用病毒特異性引物和探針對(duì)病毒進(jìn)行絕對(duì)定量分析(Houetal., 2013)，但是即使是同時(shí)孵化的一籠蚊蟲(chóng)，其個(gè)體大小也存在較大的差異。Fish(1985)調(diào)查了美國(guó)東北地區(qū)10種雌性成蚊的個(gè)體大小，其變異系數(shù)(CV)為10.51%～38.13%。在野生環(huán)境中，個(gè)體大的蚊蟲(chóng)擁有更長(zhǎng)的生命，更強(qiáng)的飛行能力和遷徙能力，因此能有更多的機(jī)會(huì)吸食宿主的血液，擁有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)與疾病傳播能力(Haramis, 1985; Nasci, 1986)。Alto等(2008)的研究表明在實(shí)驗(yàn)室條件下，小個(gè)體白紋伊蚊和埃及伊蚊比大個(gè)體蚊蟲(chóng)更容易感染和播散DENV-2。但是在感染了病毒的埃及伊蚊中，身體中病毒滴度與個(gè)體大小成正相關(guān)，作者給出的解釋是大個(gè)體蚊蟲(chóng)擁有更多供病毒復(fù)制的組織。但我們認(rèn)為大個(gè)體蚊蟲(chóng)可以一次攝入更多的病毒血餐，這可能在對(duì)比不同處理?xiàng)l件下病毒載量的實(shí)驗(yàn)中帶來(lái)影響，而用病毒核酸與內(nèi)參表達(dá)量的比值來(lái)反映每個(gè)蚊蟲(chóng)個(gè)體中病毒的量則能消除個(gè)體大小帶來(lái)的差異，結(jié)果更加具有說(shuō)服力。

在本研究中，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.999，擬合效果較好。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣本3次重復(fù)的變異系數(shù)均不超過(guò)5%，重復(fù)性較好。DENV-2和Actin的最低檢測(cè)濃度分別為102和101copies/μL，靈敏度較高。另外本研究中的白紋伊蚊Actin引物同樣可用于C6/36細(xì)胞的檢測(cè)(數(shù)據(jù)未展示)。